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Articolo metodologico

Progettazione e validazione di una biostampante ad estrusione volumetrica per la biostampa di estratto solubile di membrana basale per la ricerca traslazionale

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DOI:

10.3791/67788

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28 marzo 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Biological Structure Mechanics (LaBS), Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano

In questo articolo

Sommario

Gli estratti solubili della membrana basale sono le matrici biologiche più utilizzate nella ricerca sul cancro, ma il loro complesso comportamento reologico rende difficile la loro biostampa con i sistemi di bioprinting disponibili in commercio. Questo lavoro presenta una strategia di bioprinting personalizzata per produrre costrutti di matrici pure con una buona fedeltà di forma sia in strati singoli che multipli.

Abstract

Nella ricerca traslazionale, i modelli 3D in vitro sono essenziali per far progredire la comprensione scientifica e lo sviluppo terapeutico. A questo scopo, gli estratti solubili di membrana basale (SBMes), derivati da cellule di sarcoma di topo, svolgono il ruolo chiave di replicare le caratteristiche meccaniche e biochimiche del microambiente in vivo . Sono particolarmente preziosi in una varietà di campi di ricerca, dall'ingegneria tissutale ai test sui farmaci. In particolare, sono diventate fondamentali nella ricerca sul cancro in quanto le tradizionali colture cellulari 2D, ampiamente utilizzate nel campo, possono fornire informazioni fuorvianti poiché non catturano la struttura tridimensionale (3D) e il microambiente tumorale.

Nella ricerca sul cancro, modelli 3D in vitro efficaci sono fondamentali per comprendere meglio l'evoluzione del cancro e anticipare le sfide, come i meccanismi di resistenza ai farmaci. Gli organoidi sono emersi come promettenti modelli 3D in vitro , che offrono una rappresentazione più accurata della biologia dei tumori. Crescono in SBMes poiché creano un ambiente in cui le cellule possono crescere e auto-organizzarsi in strutture 3D. Tuttavia, l'SBMe presenta sfide significative, tra cui basse proprietà meccaniche e comportamento reologico complesso, che ne impediscono l'uso con i sistemi di bioprinting per estrusione pneumatica disponibili in commercio.

Per ovviare a queste limitazioni, abbiamo sviluppato un sistema di bioprinting a basso costo e a controllo volumetrico e un protocollo specifico per la stampa di strutture con SBMe. Questo sistema si basa su un estrusore volumetrico e supera i limiti dei tradizionali approcci ad azionamento pneumatico. Una volta assemblato e programmato con uno specifico g-code, il sistema può biostampare sia SBMe puro che diluito per ottenere costrutti sia monostrato che multistrato. Questo approccio offre un metodo più affidabile e scalabile per la produzione di modelli 3D di colture cellulari, aprendo la strada a una ricerca più efficace su nuovi trattamenti e test farmacologici.

Introduzione

Nella ricerca traslazionale, la creazione di modelli 3D in vitro che replichino fedelmente l'ambiente in vivo è essenziale per far progredire la comprensione scientifica e lo sviluppo terapeutico1. Un componente chiave nella loro costruzione è l'uso di analoghi della matrice extracellulare (ECM), come gli estratti solubili della membrana basale (SBMes), che riflettono meglio la complessità dei tessuti naturali. Le SBMe sono particolarmente preziose in una varietà di campi di ricerca, dall'ingegneria tissutale ai test sui farmaci 2,3. In particolare, sono diventati fondamentali nella ricerca sul cancro, in quanto replicano le caratteristiche meccaniche e biochimiche del microambiente tumorale, consentendo lo sviluppo di modelli che riflettono meglio la crescita tumorale, le metastasi e le risposte al trattamento.

Infatti, nonostante i notevoli progressi compiuti negli ultimi decenni, molte terapie continuano a fallire, portando a frequenti fallimenti del trattamento in ambito clinico. Questo fallimento è spesso attribuito a meccanismi di resistenza ai farmaci causati da alti livelli di eterogeneità cellulare 4,5. Modelli in vitro efficaci, in grado di ricapitolare accuratamente la complessità dei tumori umani, sono fondamentali per comprendere meglio l'evoluzione del cancro e anticipare questo fenomeno.

Le tradizionali colture cellulari 2D sono state fondamentali nella ricerca sul cancro, ma possono portare a informazioni fuorvianti sull'efficacia dei farmaci e sul comportamento del tumore, poiché non riescono a catturare la struttura 3D e il microambiente dei tumori reali 6,7,8. Al contrario, i modelli 3D in vitro sono emersi come alternative promettenti, offrendo una rappresentazione più accurata del microambiente tumorale e del comportamento biologico imitando la complessità 3D 9,10.

Nella ricerca sul cancro, gli organoidi sono ampiamente utilizzati come modelli 3D per lo studio della malattia e dell'efficacia dei farmaci, poiché forniscono modelli più accurati e pertinenti di tessuti e organi umani. L'uso di SBMe, derivato dalle cellule del sarcoma di topo di Engelbreth-Holm-Swarm, è stato fondamentale per far progredire la ricerca sul cancro11,12. Fornisce un substrato gelatinoso in cui le cellule possono crescere, proliferare e auto-organizzarsi in strutture di organoidi, garantendo un corretto sviluppo e crescita13,14.

Tuttavia, la SBMe pone una serie di sfide a causa delle sue caratteristiche uniche e complesse. Essendo un fluido non newtoniano, l'SBMe presenta proprietà di assottigliamento al taglio, il che significa che la sua viscosità diminuisce con l'aumentare dello sforzo di taglio, rendendo la sua manipolazione e applicazione incoerenti sotto forze variabili. Inoltre, il suo comportamento tissotropico aumenta la complessità, in quanto può recuperare la sua viscosità nel tempo quando lo stress di taglio viene rimosso15,16. Queste proprietà, insieme alla bassa resistenza meccanica (con valori del modulo di stoccaggio che vanno da 10 Pa a 5.000 Pa a seconda della concentrazione proteica) e al comportamento termosensibile, peggiorano queste sfide, richiedendo un controllo meticoloso durante la preparazione e l'uso, nonché la biostampa pura.

I sistemi standard di bioprinting ad azionamento pneumatico non riescono a controllare correttamente l'erogazione di SBMe poiché l'applicazione della pressione provoca un comportamento incontrollabile dopo la sua espulsione dalla siringa. Essa è affetta da un fenomeno simile all'"effetto spurt" descritto per i fusi polimerici, in cui la portata aumenta bruscamente al di sopra di un certo valore critico di pressione 17,18,19. Come riportato nel nostro precedente lavoro16, la strategia di erogazione a controllo volumetrico consente di disaccoppiare l'estrusione SBMe dalla pressione generata nel dosatore, che dipende dalle proprietà reologiche della matrice, dalle condizioni di lavoro e dalla geometria dell'ugello. Negli ultimi anni, sul mercato sono stati fatti diversi tentativi di sfruttare lo stesso principio, con Matribot di Corning in testa. Consente la manipolazione e la deposizione di SBMe e altri bioink sensibili alla temperatura grazie a condizioni di temperatura controllata. Tuttavia, potrebbe essere costoso, limitando l'accessibilità per i laboratori più piccoli.

Nel nostro articolo precedente, abbiamo presentato un'alternativa personalizzata a basso costo: un sistema di bioprinting volumetrico16. Questa versione era basata su una stampante 3D entry-level modificata con un estrusore stampato in 3D personalizzato. Nonostante la sua efficacia nel bioprinting, presentava alcune limitazioni nella ripetibilità della stampa. Essendo derivato da una stampante 3D entry-level, aveva alcuni problemi con i movimenti Z e l'auto-homing. Per rispondere a queste esigenze, abbiamo sviluppato una versione avanzata del nostro sistema di dosaggio volumetrico personalizzato a basso costo e un protocollo specifico per le strutture di bioprinting che utilizzano SBMe.

Qui, forniamo protocolli per la costruzione e l'uso di questo sistema. È composto da un estrusore volumetrico personalizzato, basato sul nostro precedente studio16, una custodia per bioprinter e un sistema di controllo. La produzione e l'assemblaggio vengono effettuati per ogni modulo. Se assemblato e programmato con un file gcode specifico, seguendo la descrizione del protocollo per la gestione delle matrici, il sistema è in grado di biostampare costrutti puri o diluiti utilizzando l'SBMe con una buona fedeltà di forma sia in strati singoli che multipli.

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Protocollo

1. 3D stampa e assemblaggio di bioprinter volumetrici

  1. Prepara e stampa in 3D i componenti della biostampante.
    1. Scarica il file *. File di progettazione STL dal file supplementare 1.
    2. Carico*. STL nel software proprietario di slicing per definire l'orientamento dei pezzi sulla lastra di stampa e tutte le opzioni necessarie per la stampante 3D. Stampa i pezzi utilizzando acido polilattico (PLA) con opzioni di media qualità (dimensione ugello 0,4 mm, diametro filamento 1,75 mm, temperatura estrusore 220 °C, temperatura piastra di stampa 50 °C, altezza strato 0,2 mm, velocità di stampa 300 mm/s).
      NOTA: Le opzioni di qualità media possono variare a seconda della stampante utilizzata per la stampa dei pezzi.
    3. Staccare i pezzi stampati dal piano della stampante 3D. Rimuovere le strutture di supporto stampate, se presenti, e lucidare le superfici dove necessario.
  2. Assemblare l'estrusore (Figura 1).
    1. Inserire due cuscinetti lineari a sfere (LM4UU) nei fori verticali del blocco spintore. Inserire anche un dado per vite T8 nel foro centrale posteriore e fissarlo con quattro viti (M3x10).
    2. Fissare un giunto rigido dell'albero al motore passo-passo e quindi fissarlo all'alloggiamento del motore dell'estrusore utilizzando quattro viti (M3x6).
      NOTA: Orientare il motore passo-passo in base alla scanalatura nell'alloggiamento del motore dell'estrusore per consentire il corretto posizionamento del jack per i cavi.
    3. Fissare il motore passo-passo, montato al punto 1.2.2, ad una vite T8 (150 mm) utilizzando il giunto rigido dell'albero precedentemente inserito. Assicurarsi che ogni blocco sia fissato correttamente con le viti di fermo.
    4. Fissare un cuscinetto a flangia autoallineante (diametro interno 8 mm) nella parte inferiore della base dell'estrusore con due viti (M4x8).
    5. Inserire due cuscinetti a sfera (4 x 9 x 4 mm) negli appositi fori sulla parte superiore della base dell'estrusore e gli altri due nei fori della sezione inferiore.
    6. Inserire la parte assemblata (passaggio 1.2.1) nella base dell'estrusore attraverso la cavità nella parte superiore della struttura. Collegare i quattro cuscinetti a sfera (passaggio 1.2.5) con due aste da 4 mm, una per lato. Far passare le aste attraverso i due cuscinetti lineari a sfere nella parte assemblata al punto 1.2.1.
      NOTA: E' anche possibile inserire prima le barre sui due cuscinetti a sfera superiori e poi inserirle nella base dell'estrusore fino a raggiungere il cuscinetto a sfere inferiore e il tutto è fissato nelle fessure definite.
    7. Inserire la parte assemblata al punto 1.2.3 nel foro centrale della base dell'estrusore. Ruotare la vite di comando per far passare il dado della vite di comando e raggiungere il cuscinetto della flangia autoallineante. Utilizzare le viti di fermo nel componente per bloccare la vite di comando e due viti (M3x8) per fissare l'alloggiamento del motore dell'estrusore sulla parte superiore della base dell'estrusore.
    8. Utilizzare altre due viti (M3x40) e dadi M3 per fissare il fermo della flangia del cilindro della siringa alla parte inferiore della base dell'estrusore, per bloccare la flangia del cilindro della siringa (direzione di inserimento dall'alto verso il basso). Utilizzare altre due viti (M3x30) e dadi M3 per fissare il fermo del pistone della siringa ai fori superiori del blocco di spinta (direzione di inserimento dal basso verso l'alto) per bloccare la flangia dello stantuffo.
    9. Inserire due viti (M4x80) in due molle e farle passare attraverso i fori presenti nella parte inferiore della base dell'estrusore e del blocco siringa. Avvitare i dadi lasciando lo spazio per la siringa per evitare che il blocco siringa scivoli.
      NOTA: Le viti devono andare da dietro in avanti.
  3. Assemblare l'asse X (Figura 2).
    1. Inserire quattro cuscinetti a sfere lineari (LM8UU x 24 mm) nel X_Left_Block e X_Right_Block parti nei fori superiore e inferiore, due per ciascuno. Fissare anche due blocchi della cintura sopra i blocchi X destro e X sinistro con le viti (M2x10) lasciando spazio per la cintura.
    2. Inserire due cuscinetti a sfera (5 x 16 x 5 mm) nei fori centrali di X_Right_Block, uno per lato. Posizionare una puleggia (foro 5 mm) nella cavità interna del X_Right_Block e collegare i due cuscinetti a sfera con un'asta da 5 mm (lunghezza 35 mm), facendola passare attraverso la puleggia.
      NOTA: Utilizzare un'asta più lunga per il montaggio per avere una migliore maneggevolezza. Dopo aver posizionato i pezzi in posizione, tagliare l'asta della lunghezza desiderata.
    3. Fissare un finecorsa al X_motor_housing con due viti (M3x8). Inserire il motore NEMA 17 nell'alloggiamento del motore e utilizzare quattro viti (M3x8) per fissare il coperchio del X_block_1 all'alloggiamento del motore e al motore.
    4. Fissare una puleggia (foro 5 mm) al motore e bloccarla con viti di fermo, quindi avvitare la parte assemblata al punto da 1.3.3 a X_block_1 con quattro viti (M5x8). Fissare anche un finecorsa nella parte inferiore del X_Left_Block con due viti (M3x8).
      NOTA: Il diametro esterno delle pulegge nei passaggi 1.3.2 e 1.3.4 deve essere lo stesso.
    5. Posizionare due cuscinetti a sfere lineari (LM8UU x 45 mm) nei fori nella parte superiore e inferiore del X_slider.
    6. Collegare le parti assemblate nei passaggi 1.3.2 e 1.3.4 con due aste da 8 mm (lunghezza 200 mm) e farle passare attraverso la parte assemblata nel passaggio 1.3.5.
      NOTA: Tagliare le aste della lunghezza desiderata prima del montaggio.
    7. Bloccare un'estremità della cinghia al X_slider_belt_connection utilizzando il blocco della cinghia e due viti (M2x8). Far passare la cinghia attorno alla puleggia nella parte assemblata 1.3.4, quindi attorno alla puleggia nella parte assemblata 1.3.2 e fissare l'altra estremità della cinghia al collegamento X_slider_belt utilizzando il secondo blocco cinghia e altre due viti (M2x8). Assicurarsi che la cintura sia ben tesa per ottenere il movimento corretto.
      NOTA: Durante questa fase, il X_slider deve essere spostato verso un'estremità della struttura dell'asse X per evitare interferenze.
    8. Avvitare la X_slider_belt_connection al X_slider con una vite (M6x20).
    9. Collegare l'estrusore al X_slider e fissarlo con quattro viti (M5x10).
  4. Assemblare l'asse Y (Figura 3).
    1. Posizionare la staffa di fissaggio sulla parte posteriore della bioprinter utilizzando quattro viti (M3x10) e quattro dadi.
      NOTA: La posizione della staffa di fissaggio può essere adattata per ottenere la corretta tensione della cinghia e consentire l'inserimento del motore passo-passo.
    2. Inserire il motore passo-passo nella staffa di fissaggio e avvitarlo con quattro viti (M3x8). Quindi, posizionare una puleggia (foro 5 mm) sull'albero motore e fissarla con le viti di fermo.
      NOTA: La puleggia può essere fissata all'albero motore prima di inserire il motore nella staffa di fissaggio per evitare interferenze tra i componenti.
    3. Posizionare due pulegge (diametro interno 8 mm) sull'asta anteriore da 8 mm e bloccarle sulle due aste (a 2,5 cm dall'estremità). Ripetere questa operazione per l'asta posteriore e aggiungere un'altra puleggia, a 5 cm di distanza dall'estremità destra.
    4. Fissare 12 cuscinetti a flangia autoallineanti (diametro 8 mm) alle parti superiori interne della biostampante.
    5. Collegare le due parti anteriori della bioprinter e le due parti posteriori della bioprinter (direzione sinistra/destra) utilizzando le aste assemblate al punto 1.4.3 e bloccarle ai cuscinetti della flangia autoallineante (diametro 8 mm). Fissare le due parti assemblate a tutte le giunzioni con le viti (M3x8).
      NOTA: Quando si posiziona l'asta posteriore, posizionare una cinghia chiusa che collega la puleggia sul motore passo-passo con la puleggia interna sull'asta.
      NOTA: Fissare il motore passo-passo serrando i dadi per garantire l'assenza di movimento del motore e la corretta tensione della cinghia.
    6. Collegare le due parti assemblate al punto 1.4.5 utilizzando quattro aste da 8 mm. Far passare le aste attraverso i cuscinetti lineari a sfere presenti nella parte assemblata 1.3 e bloccarle ai cuscinetti a flangia autoallineanti (diametro 8 mm). Fissare le due parti assemblate a tutte le giunzioni con le viti (M3x8).
    7. Fissare un'estremità della cinghia aperta sulla parte superiore del X_block_1 utilizzando il blocco della cinghia e ripetere questa operazione per la X_block_2. Far passare la cinghia attorno alle pulegge posteriori a sinistra, quindi attorno alla puleggia anteriore e fissare nuovamente l'altra estremità della cinghia alla X_block_1 con un altro blocco cinghia. Ripetere questa operazione per la seconda cinghia.
      NOTA: Le cinghie devono essere adeguatamente tese per ottenere il movimento corretto e della stessa lunghezza per evitare piegamenti o interferenze nei movimenti Y.
  5. Assemblare l'asse Z (Figura 4).
    1. Avvitare insieme le parti inferiori della custodia della biostampante (M4x8).
    2. Fissare un cuscinetto a flangia autoallineante (diametro 8 mm) al pavimento della parte inferiore della parte assemblata al passaggio 1.5.2.
    3. Fissare con viti due cuscinetti lineari a sfere flangiati (LMH8UU) ai fori esterni presenti nel Z_slider e una madrevite nel foro centrale (M3x8).
    4. Fissare un finecorsa al lato sinistro Z_plane con due viti (M3x8).
    5. Fissare il motore passo-passo a un giunto rigido dell'albero. Fissare un motore passo-passo al Z_block con quattro viti (M3x20) e un'asta filettata al giunto rigido dell'albero. Assicurarsi che ogni blocco sia fissato correttamente con le viti di fermo.
    6. Collegare la parte assemblata al punto 1.5.5 alla base della biostampante utilizzando due aste da 8 mm. Lasciarli passare attraverso la parte assemblata al punto 1.5.3.
    7. Fissare la Z_block al pannello posteriore utilizzando due viti (M5x8).
    8. Collegare Z_plane a Z_slider utilizzando quattro viti (M3x25). Inseriteli nei fori di Z_plane dall'alto verso il basso, passate la molla tra Z_plane e Z_slider e fissateli con i dadi. Regolare la tensione della molla per livellare il piano.
    9. Fissare quattro piedini regolabili sotto la struttura della biostampante nell'apposita cavità. Livellare la bioprinter regolando i piedini.
    10. Collegare la parte assemblata alla parte assemblata al punto 1.4.6 con otto viti (M4x12).
    11. Fissare con le viti due cerniere sulla parte frontale della struttura nelle apposite sedi e un magnete sulla parte destra nell'apposito punto (M2x8). Avvitare l'intera struttura a lastre di plexiglass trasparente da 2 mm per chiudere le aperture.
      NOTA: Avvitare il pannello frontale in plexiglass alle cerniere e inserire un'altra vite in corrispondenza del magnete per ottenere una porta anteriore.
  6. Visualizzare l'assieme (Figura 5A).
    1. Far passare i cavi, collegati al display, attraverso il foro inferiore e fissare il display all'alloggiamento del display con quattro viti (M3x3).
      NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito senza il coperchio della manopola LCD. Potrebbe essere posizionato sulla manopola preinstallata dopo il fissaggio all'alloggiamento del display.
    2. Chiudere l'alloggiamento con il coperchio utilizzando quattro viti (M2x6).
    3. Inserisci la scheda SD nello slot sinistro.
    4. Lascia che i fili passino attraverso il foro sulla parte superiore della struttura. Avvitare la parte assemblata nella parte superiore del bioprinter con due viti (M3x8).
      NOTA: Tutti i cavi (motori, finecorsa e display) scorreranno vicino al muro e usciranno dal foro in basso a sinistra. Sono fissati con fermacavi per evitare interferenze con le parti meccaniche.
  7. Assemblaggio dell'elettronica (Figura 5B)
    1. Fissare la presa alla parte esterna della custodia elettronica con due viti (M3x10).
    2. Fissare la scheda madre alla parte interna del case elettronico con quattro viti (M3x10).
    3. Fissare la parte inferiore dell'alimentatore alla parte interna della custodia elettronica con quattro viti (M3x8).
    4. Passare i fili attraverso il foro circolare sul coperchio e collegarli alla scheda madre. Chiudere la custodia elettronica con il suo coperchio utilizzando quattro viti (M3x10).
      NOTA: E' possibile collegare la custodia dell'elettronica alla struttura della biostampante o lasciarla sulla scrivania in caso di spazi di lavoro ridotti.
      La Figura 6 mostra tutti i collegamenti dei cavi elettronici. Possono essere leggermente diversi a seconda della scheda madre della stampante 3D in uso.

2. Impostazione del software e processo di generazione del gcode

  1. Preparazione delle impostazioni del software di slicing
    1. Aprire il software di affettamento.
      NOTA: Le istruzioni possono variare a seconda del software utilizzato o della versione.
    2. Accedi alla piattaforma.
    3. Vai alle opzioni Impostazioni . Selezionare la stampante, quindi Aggiungi una stampante non in rete. Seleziona la stampante FFF personalizzata e nella casella Nome stampante, digita il nome della stampante. Fare clic su Aggiungi.
      NOTA: Se si tratta della prima installazione del software, il pannello Aggiungi stampante si aprirà automaticamente dopo l'accesso.
    4. Nella finestra Impostazioni macchina , modificare le impostazioni predefinite x, y, z a 176, 120, 45 mm.
    5. Deselezionare l'opzione Letto riscaldato se non è già deselezionata.
    6. Inserire nei pannelli G-code iniziale e G-code finale le righe di testo riportate nei file intitolati 'JoVE_Starting_G-code.txt' e 'JoVE_Ending_G-code.txt' nel File supplementare 2.
      1. Modificare il valore 150 nella riga 'M92 E150' nel file g-code iniziale in base alla portata da applicare. Stimare il valore corretto utilizzando la seguente formula:
        figure-protocol-1
        Dove Q è la portata desiderata [μL/min].
        NOTA: Questa formula è stata ottenuta sperimentalmente con il sistema descritto. Potrebbe essere diverso se ci sono modifiche ai componenti meccanici o elettrici. Una possibile alternativa potrebbe essere quella di fissare il valore in base al sistema in uso e creare un codice MATLAB personalizzato per generare il file gcode desiderato.
    7. Modificare il valore Diametro materiale compatibile nel pannello Estrusore 1 a 1,75 e quindi chiudere.
    8. Vai su Marketplace, seleziona il plug-in Z Offset Setting e installalo. Al termine del processo, riavvia il software per finalizzare. Una volta riaperto, seleziona Impostazioni | Stampante | Gestisci stampanti sulla barra degli strumenti. Nella finestra Preferenze , fai clic su Impostazioni e attiva tutte le opzioni selezionando l'opzione Controlla tutto e chiudila.
    9. Configurare la configurazione facendo clic su Impostazioni di stampa (terzo pulsante) nel menu stage , che contiene il pannello di configurazione . Immettere la percentuale di riempimento nel profilo di stampa corrente nel pannello di configurazione . Selezionare il pulsante Personalizzato per modificare le impostazioni di stampa correnti e il profilo Fine nel menu a discesa. Impostare la velocità di stampa su 10 mm/s.
  2. Preparazione del gcode
    1. Scarica il file *. File di progettazione STL, intitolato 'JoVE_Square', dal file supplementare 2 di questo documento.
    2. Carico. STL nel software di slicing.
    3. Posiziona il pezzo sulla superficie piana e spostalo alle coordinate 65, 42,5, 0 (X, Y, Z) mm. Creare due copie facendo clic sul pulsante . Nome del file STL nell'elenco degli oggetti e selezionando l'opzione Moltiplica selezionati. Spostali alle seguenti coordinate: 16, 42,5, 0 mm e -33, 42,5, 0 mm (X, Y, Z).
      NOTA: Non è possibile definire automaticamente l'ordine di stampa a meno che non venga modificato manualmente direttamente nel file gcode finale. Le coordinate sono definite per una piastra a 6 pozzetti multipli.
    4. Vai alle Impostazioni di stampa nel menu stage . Nella sezione Muri , metti 0 come conteggio delle linee del muro. Metti 0 come valore di spessore superiore/inferiore nella sezione superiore/inferiore . Nel pannello Riempimento , inserire i seguenti valori: Motivo di riempimento: Griglia, Distanza linea di riempimento: 5 mm, Direzioni linea di riempimento: [0].
      NOTA: È possibile ridurre la velocità di traslazione nella sezione Velocità di stampa per migliorare la precisione dell'asse X.
    5. Disabilitare la retrazione nella sezione Corsa e il raffreddamento della stampa nella sezione Raffreddamento .
    6. Nella sezione Adesione piastra di stampa , selezionare Nessuno come Tipo di adesione piastra di stampa, mentre nella sezione Modalità speciali , selezionare l'opzione Uno alla volta come Sequenza di stampa.
    7. Fare clic sul pulsante Slice per generare il g-code.
    8. Apri il file g-code con l'applicazione Blocco note e rimuovi le righe "M104 S200", "M105" e "M109 S200" nella riga 12 dopo la frase "; Generato con Cura_SteamEngine 4.9.0".
    9. Aggiungere "G1 Z25" prima della riga successiva"; MAGLIA: JoVE_Square_rev. STL(6)" e dividere il successivo in due: (1) G0 F3600 X142.46 Y7.499 e (2) G1 Z0.3.
      NOTA: Le coordinate X e Y sono solo esempi.
    10. Modificare il valore Z in Z25 in ogni riga presente dopo "; TIME_ELAPSED" commenta ogni ultima istruzione di strato di ogni pezzo.
      NOTA: Per la stampa di un solo pezzo, il passaggio 2.3.10 non è necessario.

3. Test di rigonfiamento/degradazione

  1. Fasi preparatorie
    1. Assumere una siringa di vetro sterile da 1 ml (terminale TLL) e un ugello conico sterile da 25 G. Assemblali e metti la siringa assemblata in frigorifero.
    2. Mettere i puntali delle pipette e la fiala della matrice SBMe in frigorifero per una notte il giorno prima dell'esperimento.
    3. Stampa tre griglie in PLA (Φ = 20 mm) con pori circolari di 1 mm x 1 mm e un pilastro verticale laterale per afferrarle.
  2. Costrutti di stampa
    1. Prendere la siringa assemblata e il flaconcino della matrice SBMe dal frigorifero. Aspirare 500 μL della matrice SBMe e metterla nell'incubatore per 15 minuti per consentire la gelificazione.
    2. Prendere la siringa dall'incubatrice e inserirla nella testina di stampa del bioprinter. Assicurarsi che lo stantuffo della siringa sia correttamente a contatto con il blocco spintore.
    3. Fissare lo stantuffo di fissaggio della siringa e la flangia del cilindro della siringa con i fermi del pistone della siringa e il cilindro della siringa con il morsetto della siringa.
    4. Calibrare il sistema utilizzando l'impostazione Auto-home nel menu della biostampante per rilevare automaticamente l'origine degli assi.
    5. Spostare l'estrusore utilizzando il comando Sposta assi fino a quando la punta dell'ago tocca la griglia PLA per definire manualmente Z0.
    6. Avviare la stampa selezionando il file g-code da stampare nel menu della biostampante.
    7. Mettere la piastra multipozzetto nell'incubatore per 2 minuti per consentire all'SBMe di stabilizzarsi dopo l'estrusione.
    8. Prendere la piastra multipozzetto e inserire 2 mL di terreno di coltura cellulare nei tre pozzetti contenenti le griglie biostampate. Inserire la piastra multipozzetto nell'incubatore.
    9. Ad ogni punto temporale (t0, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 1, 3, 7, 10 e 14 giorni), prelevare ogni griglia dalla lastra e asciugarla con carta pulita per rimuovere l'eccesso di fluido e peso su una bilancia. Rimetti la griglia nella piastra e poi nell'incubatrice per continuare l'esperimento. Stimare il rapporto di rigonfiamento e il tasso di degradazione utilizzando le seguenti formule:
      figure-protocol-2
      Dove Wt è il peso dei costrutti in ogni punto temporale e Wt0 il peso dei costrutti essiccati.
      figure-protocol-3
      Dove Wi è il peso alla fine della prova di rigonfiamento.

4. Bioprinting di costrutti SBMe

  1. Fasi preparatorie
    1. Prendere una siringa di vetro sterile da 1 ml (terminale TLL) e un ugello conico sterile da 25 G e assemblarli sotto la cappa di biosicurezza. Mettili in una scatola sterile in frigorifero.
    2. Mettere i puntali della pipetta e il flaconcino della matrice SBMe in frigorifero per una notte (4 °C con ghiaccio) il giorno prima dell'esperimento.
    3. Aggiungere 20 μl di blu di tripano in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
    4. Impostare la centrifuga a 345 × g, 4 °C e lasciarla raffreddare (~3-4 h).
    5. Assumere 5 mL di acqua in una provetta da centrifuga da 15 mL come bilancia per la centrifuga.
    6. Soluzione tampone fosfato calda (PBS) e terreno a bagnomaria.
      NOTA: Il terreno di coltura cellulare è costituito da un terreno di Eagle's modificato con Dulbecco (DMEM) completo integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), penicillina-streptomicina e L-glutammina.
    7. Posizionare il bioprinter sotto la cabina di sicurezza biologica. Sterilizzare sotto luce UV per 20 min.
      NOTA: Per garantire il corretto funzionamento della biostampante, eseguire la funzione Auto-home e verificare i movimenti corretti di ciascun asse e il funzionamento dei finecorsa.
  2. Preparazione Bioink
    1. Prendi il pallone nell'incubatrice contenente cellule di cancro alla prostata murino in commercio e mettilo sotto la cabina di biosicurezza.
    2. Estrarre il terreno di coltura cellulare dal pallone.
      NOTA: I volumi riportati in questo protocollo si applicano ai matracci per colture cellulari T25.
    3. Lavare le cellule una volta con 2 ml di PBS e poi aspirarle.
    4. Aggiungere 500 μl di tripsina e mettere il pallone nell'incubatore per 5 minuti per consentire il distacco delle cellule dalla piastra.
    5. Controllare la tripsinizzazione delle celle e, se necessario, picchiettare delicatamente il fondo del pallone.
    6. Aggiungere 4,5 ml di terreno al pallone. Lavare accuratamente la piastra per assicurarsi che tutte le cellule staccate galleggino nel terreno di coltura cellulare.
    7. Aspirare il terreno e aggiungerlo a una provetta da centrifuga da 15 mL.
    8. Prelevare un'aliquota da 20 μL e mescolarla con l'aliquota del blu di tripano. Quindi, mettere 10 μl di questa miscela nella camera di conteggio delle cellule per contare le cellule vive utilizzando la seguente formula:
      figure-protocol-4
      dove f è il fattore di diluizione per la sospensione di blu di tripano (rapporto 1:1); V è il volume di sospensione cellulare [mL].
    9. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente per 5 minuti (345 × g, 4 °C).
    10. Rimuovere il surnatante e risospendere nella matrice SBMe fredda alla densità cellulare desiderata (10,6 cellule/mL)
    11. Aspirare 800 μl della sospensione della matrice contenente le cellule con la siringa fredda.
    12. Rimuovere le bolle d'aria che potrebbero essere intrappolate nella siringa e metterla in una scatola sterile. Quindi, metterlo nell'incubatrice per 15 minuti per consentire la gelificazione.
  3. Processo di bioprinting
    1. Prendere la siringa dall'incubatrice e inserirla nella testina di stampa del bioprinter. Assicurarsi che lo stantuffo della siringa sia correttamente a contatto con il blocco spintore.
      NOTA: Il modello e il volume devono essere gli stessi della siringa utilizzata per l'esperimento.
    2. Fissare lo stantuffo di fissaggio della siringa e la flangia del cilindro della siringa con i fermi del pistone della siringa e il cilindro della siringa con il morsetto della siringa.
    3. Utilizzare i dadi M4 nella parte inferiore dell'estrusore per regolare la pressione della molla e bloccare la siringa in posizione.
      NOTA: I passaggi da 4.3.1 a 4.3.4 sono mostrati nella Figura 7.
    4. Calibrare il sistema utilizzando l'impostazione Auto-home nel menu della biostampante per rilevare automaticamente l'origine degli assi.
      NOTA: Questo passaggio garantisce sempre le corrette impostazioni iniziali indipendentemente dal tipo di supporto che utilizziamo per la stampa.
    5. Posizionare una piastra a 6 pozzetti sul piano di stampa.
    6. Spostare l'estrusore utilizzando il comando Sposta assi fino a quando la punta dell'ago tocca il fondo del pozzetto per definire manualmente Z0.
    7. Seleziona il file gcode nell'opzione di menu del menu bioprinter e avvia la stampa. In ogni pozzetto verrà stampata una griglia quadrata a sei strati (lato 2,6 cm).
    8. Dopo il processo di bioprinting, utilizzare un microscopio invertito per assicurarsi che il processo di stampa sia andato a buon fine e mettere la piastra multipozzetto nell'incubatore per 2 minuti per consentire all'SBMe di stabilizzarsi dopo l'estrusione.
    9. Mettere 2 mL di terreno di coltura cellulare in ciascun pozzetto.
      NOTA: Il volume deve coprire completamente i costrutti.

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Risultati

In questo articolo, presentiamo un protocollo per i costrutti di bioprinting realizzati in SBMe utilizzando una biostampante volumetrica a basso costo, personalizzata e personalizzata. Forniamo una descrizione dettagliata e la stampa 3D*. STL per costruire il sistema e dimostriamo il suo potenziale utilizzo nella ricerca sul cancro stampando strutture a strato singolo e multistrato. Ogni componente stampato in 3D è stato adeguatamente pulito dalla struttura di supporto o dai residui di stampa indesiderati prima dell'asse...

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Discussione

Nella ricerca traslazionale, le SBMe sono particolarmente preziose in una varietà di campi di ricerca, dall'ingegneria tissutale ai test farmacologici 2,3. In particolare, sono diventati fondamentali nella ricerca sul cancro, in quanto replicano le caratteristiche meccaniche e biochimiche del microambiente tumorale, consentendo lo sviluppo di modelli che riflettono meglio la crescita tumorale, le metastasi e le risposte al tratta...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dall'Accelerator Award n° A26815 dal titolo: "Single-cell cancer evolution in the clinic" finanziato attraverso una partnership tra Cancer Research UK e Fondazione AIRC (n° 22790) e dall'Unione Europea - Next Generation EU, Mission 4, Component 1, CUP D53D23003310006.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra 12 multipozzettiSigma-AldrichCLS351143
Stampante 3D FDMFlashforgeAdventurer 5M Pro
Stampante 3D Scheda madreGEETECHGT2560 REV Piastra A+
6 multipozzettiSigma-AldrichM8687
Presa CAHiLetgohttps://www.amazon.it/HiLetgo-Terminal-Socket
-Holder-Switch/dp/B0814PT3YG/ref=sr_1_1?__
mk_it_IT=%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3%
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socket+hiletgo%2Caps%2C173& sr=8-1		15 A 250 V
Piedini regolabiliEXIN DEHCENhttps://www.amazon.it/gp/product/
B0CPLTSNQB/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& psc=1		Altezza 27-40 mm
Cuscinetto a sfere 4 mmQUARKZMAN684ZZDimensioni 4 x 9 x 4 mm
Cuscinetto a sfere 5 mmXiKe625-2RSDimensioni 5 x 16 x 5 mm
Cinghia chiusaTurmberg3Dhttps://www.amazon.it/gp/product/
B09B2FJQBV/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& psc=1		Larghezza 6 mm
Cintura apertaFajoedahttps://www.amazon.it/gp/product/
B09QCTVPTH/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& th=1		Larghezza 6 mm
Ugello per bioprintingFisher Scientific17780789Corning  Ugelli conici standard per bioprinting
Bü rker Camera di conteggio delle celluleGLASWARENFABRIK KARL HECHT
CentrifugaEppendorf5702 R
Provetta da centrifugaSigma-AldrichCLS43147015 mL
Provetta da centrifugaSigma-AldrichEP00301200861,5 mL
DisplaySigma-AldrichBR718905
DMEM Gibco Thermofisher11965092
FBSSigma-AldrichF7524
Cuscinetto a sfere lineare flangiatoMappa di approvvigionamentohttps://www.amazon.it/gp/product/
B07S6LZHM7/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& psc=1		LMF8UU
Siringa in vetroFisher Scientific11520062Hamilton GasTight 1 mL (terminale TLL)
CerniereYASQZhttps://www.amazon.it/gp/product/
B09DNXGDGG/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& psc=1
IncubatoreFisher Scientific15481374Eppendorf  Galaxy 48 R CO2  Incubatrice, 48 L, Acciaio Inox
Microscopio invertitoNikonEclipse Ti2-U
PonticelliIverntechhttps://www.amazon.it/Iverntech-XH2
-54-Terminale-Stampante-Stepper/dp/
B07Q12B6K5/ref=pd_ci_mcx_mh_
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J& content-id=amzn1.sym.57a351cf-
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66cb-4977-48ce-b095-0dcedf8c372f&
pd_rd_i=B07Q12B6K5& th=1
unità LCDParadisetronic.comhttps://www.amazon.it/Display-controller
-conduttori-adattatore-stampante/dp/B01
DUR4064/ref=sr_1_9?__mk_it_IT=%C3
%85M%C3%85%C5%BD%C3%95%C3
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2B3D%2Bprinter%2Bprusa%2Bi3& nsdO
ptOutParam=true& qid=1734714093& s=
industriale& sprefix=display%2B3d%2B
stampante%2Bprusa%2Bi3%2Cindustrial%
2C143& sr=1-9& th=1		unità LCD Old Prusa i3. Link all'alternativa disponibile in commercio
Madrevite M8RS PRO280-408
Madrevite M8Comiokehttps://www.amazon.it/dp/B0C7QB13C4?
ref=ppx_yo2ov_dt_b_fed_asin_title& th=1		Dado per viti M8
Dado per vite T8Aipaidehttps://www.amazon.it/gp/product/B086QJCX1M/ref
=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8& psc=1		Dado per viti T8
Madrevite T8VBESTLIFEhttps://www.amazon.it/gp/product/B07CXRB52Y/ref
=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8& th=1		Lunghezza 15 mm
L-GlutamminaSigma-AldrichG7513
FinecorsaCESFONJERhttps://www.amazon.it/gp/product/B07SPX492J/ref
=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8& psc=1
Cuscinetto lineare a sfere (LM4UU)A ABSOPROhttps://www.amazon.it/gp/product/B0CB3M5GHJ/ref
=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8& psc=1		Dimensioni 4 x 8 x 12 mm
Cuscinetto lineare a sfere (LM8LUU)Fdithttps://www.amazon.it/LM8LUU-Linear
-Motion-cuscinetti-stampante/dp/B07N
58W3GZ/ref=sr_1_1_sspa?__mk_it_IT
=%C3%85M%C3%85%C5%BD%C3%
95%C3%91& crid=33VNCCCSIFJRP&
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CPY& dib_tag=se& keywords=LM8LUU+
Fdit& nsdOptOutParam=true& qid=17347
04494& s=industriale& sprefix=lm8luu+fdit+
%2Cindustrial%2C136& sr=1-1-spons& sp
_csd=d2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGY& psc=1		Dimensioni 8 x 15 x 45 mm
Cuscinetto lineare a sfere (LM8UU)ARCELIhttps://www.amazon.it/gp/product/
B07BV3YBP2/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& psc=1		Dimensioni 8 x 15 x 24 mm
MagnetiOCEUMAOAhttps://www.amazon.it/gp/product/
B0CB6C2RF4/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& th=1		8 x 3 mm
MatrigelGibco ThermofisherLOTTO 0202003Driver motore SBMe
 Longrunerhttps://www.amazon.it/gp/product/
B071P41ZBW/ref=ppx_yo_dt_b_search
_asin_title?ie=UTF8& psc=1		Driver A4988
PBSMicroGem, VWRTL1006-500ML
Penicillina-StreptomicinaGibco Thermofisher15070063
Punte per pipetteSigma-AldrichZ740058MARCA  Puntali filtranti, in rack, TipBox (volume 50-1000 μ L)
Lastre in plexiglassMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti-
plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0CF
Q4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9.bf7
Mp7I5m2qAR1Fp1V6DoYF2erUlNQUK_NuF
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E& dib_tag=se& parole chiave=lastra+plexiglass+
2+mm& nsdOptOutParam=true& qid=1734702823& sr=8-14		mm di spessore, lastra trasparente, 21 x 32,5 cm
Lastre di plexiglassMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti
-plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C
FQ4BHQZ/ref=sr_1_14?dib=eyJ2IjoiMSJ9.b
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nfLG7hwytqHQG2.ApKq8MVs8Xihn_zcA3
9nML-2lpjnagGhXIx0clcJN_E& dib_tag=se
& parole chiave=lastra+plexiglass+2+mm& nsd
OptOutParam=true& qid=1734702823& sr=8-15		2 lastre trasparenti, spessore 2 mm, 20 x 20 cm
Lastre di plexiglassMVQPERhttps://www.amazon.it/MVQPER-trasparenti
-plexiglass-trasparente-decorazione/dp/B0C
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8MVs8Xihn_ zcA39nML-2lpjnagGhXIx0clcJ
N_E& dib_tag=se& Parole chiave=Lastra+Plexigl
CULO+2+MM& nsdOptOutParam=true& qid=1
734702823& sr=8-16		2 fogli trasparenti, spessore 2 mm, 20 x 30 cm
Filamento di acido polilattico (PLA)FlashforgeBlack 100102
AlimentatoreSQUADOhttps://www.amazon.it/SQUADO-Alimentatore
-stabilizzato-dissipatore-efficienza
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=eyJ2IjoiMSJ9.1vVze6Zt6fhKCvFb
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o_7tzyU6MQ9vAEozXkLTaTTMX
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S3Zh1y_JPQijbMAIuvuYflhh6JlPB
W6-fpW6QXl9v5wNEs_YwjzP9Sf
RKxRmchzZhgsK-34XJeaEmjbRq
H3piM0Zx.MfPYUNvCEhDBqLDh
C-iqBEu-vjIVgsrQmOjeLuGo9YQ&
dib_tag=se& parole chiave=potenza+sup
ply+AC+INPUT%3A+110-220V%2
C+DC+OUTPUT%3A+12V+15A& n
sdOptOutParam=true& qid=173471
4722& sr=8-6		Alimentatore Old Prusa i3 (INGRESSO CA: 110-220 V, USCITA CC: 12 V 15 A). Link alla puleggia alternativa disponibile in commercio
5 mmVooGenzekhttps://www.amazon.it/gp/product/
B0B8H16KWX/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& psc=1		Alesaggio 5 mm, Larghezza spazio cinghia 6 mm
Puleggia 8 mmYxtaiihttps://www.amazon.it/gp/product/
B07X852RFN/ref=ppx_yo_dt_b_
search_asin_title?ie=UTF8& sp=1		Foro 8 mm, Larghezza spazio nastro 6 mm
Cavi a nastroQUARKZMANhttps://www.amazon.it/sspa/click?ie
=UTF8& spc=MTo0NDgyNTkwNzU
wNjM5NzM5OjE3MzQ3MTQ1OTE6
c3BfbXRmOjMwMDEyMjk4NTMzN
TYzMjo6MDo6& url=%2FQUARKZM
AN-connettore-Lunghezza-Comput
er-confezione%2Fdp%2FB0CQRM
DQNG%2Fref%3Dsr_1_15_sspa%
3F__mk_it_IT%3D%25C3%2585M
%25C3%2585%25C5%25BD%25
C3%2599 5%25C3%2591%26crid%3
D3BZ8Q05YA50TX%26dib%3Dey
J2IjoiMSJ9.zoYnL2ViiarlDS_7165D
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UvMyTm8mpAdZSaOritwHRgwu2
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ULfZusvGX28S1K5kJdTa_YOwJY
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YAE%26dib_tag%3Dse%26keywords
%3DCavo%2Bflessibile%2Ba%2Bna
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