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Articolo metodologico

Incroci sessuali con il Mucoromicete Phycomyces blakesleeanus

824 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/67790

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6 giugno 2025

 , 
1Organismal Biology and Ecology Department, Colorado College

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo di base per l'induzione dell'accoppiamento di P. blakesleeanus .

Abstract

Il Phycomyces blakesleeanus, un fungo filamentoso all'interno del phylum Mucoromycota, si distingue per la sua notevole capacità di percezione ambientale e risposte adattative. Mentre il lavoro passato ha dimostrato che gli stimoli ambientali, tra cui la gravità, la luce, l'umidità e la disponibilità di nutrienti, influenzano le dinamiche di crescita e le strategie riproduttive, i meccanismi sottostanti rimangono un'area focale della ricerca. I segnali ambientali innescano la riproduzione sessuale o asessuata. La riproduzione sessuale inizia con la segnalazione dei feromoni, che innesca la chemioattrazione ifale, portando infine a transizioni morfologiche seriali che culminano nella formazione di una zigospora.

In un ambiente di laboratorio, gli incroci di P. blakesleeanus provocano miceli complementari che subiscono il ciclo sessuale in diverse fasi. Il nostro lavoro mira a verificare se i segnali ambientali possono innescare l'accoppiamento attraverso i miceli di P. blakesleeanus. Gli incroci di P. blakesleeanucoltivati su terreni con nutrienti limitati saranno sottoposti ad agar con nutrienti limitati per innescare una risposta sessuale in conformità con la privazione di nutrienti. L'innesco riuscito dell'accoppiamento in P. blakesleeanus faciliterà gli studi futuri che richiedono una grande quantità di miceli che si riproducono sessualmente in fasi specifiche. Il risultato di questa ricerca migliorerà ulteriormente la nostra comprensione di come i meccanismi riproduttivi di P. blakesleeanus siano influenzati da fattori ambientali, contribuendo alla più ampia base di conoscenze sulla riproduzione sessuale dei funghi filamentosi.

Introduzione

L'induzione dell'accoppiamento nei sistemi fungini in condizioni di laboratorio ha fatto progredire la comprensione della genetica eucariotica, della biologia cellulare, della biologia evolutiva e della biotecnologia. I funghi dikarya, in particolare gli Ascomycota, presentano le più ampie conoscenze sull'induzione dell'accoppiamento in un ambiente di laboratorio1. È interessante notare che il primo fungo in cui è stata proposta la riproduzione sessuale, Syzygites megalocarpus, non è un membro di Ascomycota, ma piuttosto un membro del phylum Mucoromycota2. Il phylum Mucoromycota è un gruppo divergente precoce precedentemente classificato come "Zygomycota" ma ora considerato fratello dei lignaggi Dikarya 3,4. I Mucoromycota, insieme a Zoopagomycota, sono evolutivamente significativi in quanto questi phyla rappresentano la transizione dei funghi agli ecosistemi terrestri 4,5. Come altri funghi, i mucoromiceti usano strategie riproduttive asessuate e sessuali in risposta al loro ambiente 3,6. In condizioni di nutrienti limitati, i mucoromiceti inizieranno il ciclo sessuale6. I mucoromiceti mostrano meccanismi di accoppiamento sia omotallici che eterotallici, in cui la compatibilità è determinata dai geni di tipo accoppiato sexM e sexP, designati rispettivamente come (-) e (+) 7,8,9.

Blakeslee10 ha sottolineato la sensibilità del ciclo sessuale del mucoromicete alle condizioni esterne, osservando che l'umidità è fondamentale per la loro formazione e che la disponibilità di nutrienti nel substrato gioca un ruolo significativo. I tipi di accoppiamento complementari iniziano il ciclo sessuale attraverso la sintesi cooperativa di acidi trisporici (TA) utilizzando il beta-carotene come precursore 11,12,13. In seguito alla rilevazione di TA, le ife vegetative che rispondono si ispessiscono e diventano zigofori altamente ramificati 14,15,16. Gli zigofori continuano la produzione di TA e si attraggono. In P. blakesleeanus, gli zigofori si differenziano all'interno del substrato e non sono facilmente visibili su terreni solidi di agar17. Al momento del contatto, gli zigofori si intrecciano e diventano zigofori aerei.

Mentre il ciclo sessuale continua, le punte degli zigofori si attaccano e il centro delle cellule si spinge verso l'esterno per formare una struttura ad anello con rigonfiamento coralloide alla base, completando la transizione al progametangio. Le punte delle cellule che formano il progametangio iniziano a fondersi e a svilupparsi nel gametangio. Nella fase di gametangia, gli zigofori mostrano ornamenti simili a spine. La parete cellulare alle punte si dissolve e compaiono setti avventizi, delimitando l'area in cui si formerà la zigospora, e gli zigofori agiscono come sospensori simili a pinze18. La zigospora diventerà pigmentata man mano che la sua parete cellulare si ispessisce e acquisisce ulteriori ornamenti simili a spine17,18. Una volta formata, la zigospora entrerà in un periodo di dormienza prima di ricominciare il ciclo di crescita.

Phycomyces blakesleeanus è un mucoromicete eterotalico noto per le sue grandi cellule e gli sporangiofori sensibili all'ambiente 6,8,18. Questo organismo è facilmente coltivabile in laboratorio e le porzioni del ciclo sessuale che portano alla formazione di zigospore possono essere osservate nell'arco di 8-10 giorni. Come modello, P. blakesleeanus è stato esaminato per la sua capacità di percepire la luce nel suo ambiente17,19. La facilità di coltivazione e la capacità di indurre l'accoppiamento lo hanno reso anche un modello ideale per studiare il meccanismo alla base della sua capacità di percepire la luce20; Questi risultati hanno anche evidenziato la conservazione evolutiva dei meccanismi di rilevamento della luce nei funghi. In P. blakesleeanus, è stato dimostrato che la luce inibisce la riproduzione sessuale attraverso queste proteine sensibili alla luce conservate21. Recenti studi evolutivi sullo sviluppo hanno cercato di capire quali geni contribuiscono alla differenziazione cellulare durante il ciclo sessuale di P. blakesleeanus 6. La correlazione della morfogenesi con geni specifici richiederebbe l'isolamento di una quantità sufficiente di tessuto degli stessi tipi di cellule per eseguire studi di espressione genica.

Sebbene siano stati precedentemente descritti protocolli per indurre l'accoppiamento di P. blakesleeanus in un ambiente di laboratorio, alcuni menzionano solo il tipo di terreno da utilizzare e i ceppi pertinenti18. Alcune descrizioni del protocollo non includono una formulazione specifica dei terreni, ma descrivono dove posizionare i presunti tipi di accoppiamento complementari su una piastra10. Protocolli più recenti consentono di aumentare la produzione di zigospore mescolando spore di ciascun tipo di accoppiamento e inoculandole con la sospensione di spore miste21 o posizionando i tipi di accoppiamento a una certa distanza l'uno dall'altro e lasciando incubare la coltura per 20 giorni22. Questi approcci sono utili per generare ampie cellule differenziate, in particolare zigospore, ma potrebbero non essere adatti per osservare un andamento temporale dello sviluppo o selezionare strutture sessuali che si formano prima delle zigospore per la trascrittomica a singola cellula. Altri lavori hanno affrontato questo problema posizionando tipi di accoppiamento complementari a distanza l'uno dall'altro su mezzi solidi per consentire l'osservazione delle transizioni morfologiche seriali all'inizio del ciclo sessuale 6,22,23. Come nel caso di altri funghi, il micelio di P. blakesleeanus si espande radialmente24,25. Pertanto, quando i tipi di accoppiamento complementari vengono coltivati sulla stessa piastra, diverse porzioni dei loro miceli entreranno in contatto in momenti diversi. Poiché il contatto tra i miceli è uno dei primi passi nel ciclo sessuale di P. blakesleeanus, ciò significa che diverse porzioni di miceli interagenti si troveranno in fasi diverse del ciclo sessuale. Questa asincronia potrebbe influire sull'esito di uno studio sull'espressione genica, in modo tale che se i tipi di cellule differenziate sono mescolati e se hanno programmi di espressione genica distinti, allora sarebbe difficile attribuire il ruolo di un gene a una particolare struttura.

Oltre al valore di P. blakesleeanus come modello per l'esame dei geni coinvolti nella morfogenesi durante il ciclo sessuale, la sua crescita vigorosa e la capacità di differenziarsi nell'arco di pochi giorni lo rendono un fungo ideale per la formazione di studenti interessati a funghi filamentosi divergenti precocemente e per l'uso in una classe universitaria per conoscere la diversità dei funghi e i loro processi di sviluppo. Il protocollo qui presentato utilizza tre concentrazioni di due diversi tipi di terreni per dimostrare l'effetto della disponibilità di nutrienti sull'aspetto del micelio, l'induzione dell'accoppiamento e l'arricchimento per particolari strutture sessuali, sia per la quantificazione, l'osservazione o la potenziale trascrittomica di singole cellule.

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Protocollo

1. Preparazione dei terreni

  1. Sospendere l'agar di farina di mais in polvere (CMA) o l'agar destrosio di patate (PDA) in acqua deionizzata. Per CMA o PDA al 100%, seguire le istruzioni del produttore e sospendere 17 g di CMA in 1 L di acqua deionizzata o 39 g di PDA in 1 L di acqua deionizzata. Per N% CMA o PDA, sospendere 1/N della quantità raccomandata dal produttore e integrare con agar aggiuntivo per ottenere una concentrazione di agar del 7,5% (p/v).
    NOTA: Passaggio facoltativo: prima della sterilizzazione in autoclave, aggiungere 25 μg/mL di cloramfenicolo se la contaminazione batterica è un problema.
  2. Sterilizzare il terreno in autoclave, a 121 °C per 15 minuti.
  3. Raffreddare il fluido a ~60 °C mettendolo per 30 minuti in un bagnomaria impostato a 60 °C.
    NOTA: Se il flacone caldo di terreno può essere tenuto per 6 secondi con poco o nessun disagio, è pronto per essere versato.
  4. Versare le piastre in condizioni asettiche in una cappa a flusso laminare o in una cappa di sicurezza biologica. Inclinare la bottiglia di terreno su una capsula di Petri aperta e vuota e versare quanto basta per coprire completamente il fondo.
    1. In alternativa, utilizzare una pipetta sierologica di vetro e pipettare 20 mL di terreno in ciascuna piastra.
      NOTA: Questo approccio aumenta il tempo in cui il flacone del terreno si trova a una temperatura più bassa e aumenta il rischio di solidificare prematuramente l'agar.
  5. Lasciare che il supporto si risolidifichi. Conservare le piastre a 4 °C se non vengono utilizzate immediatamente.

2. Preparazione di spore fungine o tessuti

  1. Ottenere colture di ogni tipo di accoppiamento di P. blakesleeanus (ad esempio, NRRL 1555 (-), NRRL 1554 (+), NRRL 1464 (-) e NRRL 1465 (+)). Per inoculare gli incroci con le spore, prima coltiva ogni tipo di accoppiamento in coltura pura su CMA o PDA al 100%
  2. Tagliare una porzione di micelio all'avanguardia da colture esistenti e posizionare il micelio asportato su una piastra CMA/PDA al 100%. Incubare colture pure per 1 settimana a 27 °C con un ciclo di luce di 12 ore.
  3. Una volta presenti gli sporangiofori, inondare una coltura pura sporulante con lo 0,01% di Tween 20 in acqua sterilizzata e deionizzata utilizzando una tecnica asettica. Con una micropipetta P1000, aspirare 1,0 mL della miscela di 20 spore Tween dalla piastra e in una provetta per microcentrifuga.
  4. Centrifugare in una mini centrifuga per 30 s, quindi decantare il surnatante.
    1. Se sono necessarie più spore, continuare ad aggiungere 1,0 ml della miscela di spore Tween 20 nella stessa provetta da microcentrifuga e ripetere il passaggio 2.4. Dopo aver ottenuto una quantità adeguata di spore, decantare il surnatante e sostituirlo con 500 μL di acqua deionizzata sterile.
    2. Opzionale: utilizzare un ematocitometro per stimare la concentrazione di spore, che indicherà se è necessario aggiungere più acqua o se le spore devono essere ricentrifugate.
  5. In alternativa, inoculare gli incroci con miceli all'avanguardia provenienti da colture pure.
    1. Utilizzare una lama di rasoio sterilizzata o una trivella per asportare il tessuto e piastrare immediatamente l'inoculo.
  6. Impostare le croci come croci a 2 vie, croci a 4 vie o croci a 8 vie (Figura 1).
    NOTA: Se le croci vengono impostate per il lavoro trascrittomico, si consiglia di installare 1-2 piastre aggiuntive per condizione/supporto che fungano da piastre indicatrici. Le piastre indicatrici consentono agli investigatori di limitare l'esposizione alla luce alle piastre sperimentali, poiché la luce inibisce la riproduzione sessuale in P. blakesleeanus.
    1. Per un incrocio a 2 vie, posizionare i tipi di accoppiamento complementari uno di fronte all'altro (Figura 1A).
      1. Posizionare i miceli del tipo (-) di accoppiamento, NRRL 1555 o NRRL 1464, ad almeno 1 cm di distanza dal bordo di una capsula di Petri su PDA o CMA.
      2. Sulla stessa piastra, di fronte a dove è stato posizionato il tipo di accoppiamento (-) e a 1 cm di distanza dal bordo della piastra di Petri, posizionare il tipo di accoppiamento (+), NRRL 1554 o NRRL1465 (Figura 1A).
        NOTA: La distanza tra i tipi di accoppiamento complementari influenzerà le dimensioni del tessuto che partecipa al ciclo sessuale. I tipi di accoppiamento più distanti consentono ai miceli di espandersi di più, il che aumenterà il numero di interazioni sessuali tra i due partner.
    2. Per un incrocio a 4 vie, posizionare i tipi di accoppiamento simili uno di fronte all'altro ma vicini a un tipo di accoppiamento complementare (Figura 1B).
      1. Posizionare le spore o i miceli dei tipi di accoppiamento (-), NRRL 1555 e NRRL 1464, uno di fronte all'altro ad almeno 1 cm di distanza dal bordo di una capsula di Petri su PDA o CMA.
      2. Sulla stessa piastra, scegliere una posizione tra i due tipi di accoppiamento (-) e ad almeno 1 cm di distanza dal bordo della piastra e inoculare il sito con spore o miceli del tipo di accoppiamento (+), NRRL 1554 o 1465.
      3. Sulla stessa piastra, di fronte a quella in cui è stato inoculato il primo tipo di accoppiamento (+) e ad almeno 1 cm di distanza dalla piastra, posizionare l'altro tipo di accoppiamento (+).
    3. Per un incrocio a 8 vie, alternare i tipi di accoppiamento lungo la periferia della capsula di Petri, con quattro di ogni tipo di accoppiamento (Figura 1C).
  7. Dopo l'inoculazione, sigillare le piastre con parafilm o (lasciarle non sigillate) e metterle in un contenitore secondario prima di incubarle a 22 °C al buio. Osserva le piastre ogni giorno per trovare prove di accoppiamento, durante il quale scatta fotografie da sotto la piastra e traccia i miceli man mano che le colture crescono.
    NOTA: Dopo 24 ore dall'inoculazione, aspettatevi di vedere i miceli espandersi su tutti i tipi di terreno, ma è improbabile che gli individui siano in contatto in questa fase.
  8. A seconda del tipo di terreno (PDA o CMA) e della formulazione (25%, 50%, 100%), se i miceli iniziano a entrare in contatto, ispezionare i miceli dei tipi di accoppiamento complementari che sono in contatto sotto un cannocchiale di dissezione per prove di accoppiamento. Scatta foto di miceli interagenti con una fotocamera o uno smartphone montato sul cannocchiale da dissezione.
    1. Acquisire immagini di miceli e unirle (ad esempio, utilizzando l'applicazione Panorama Stitcher). Utilizzare ImageJ per stimare l'area dei miceli (vedere le esercitazioni online).

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Risultati

A seguito di un incrocio a 4 vie, ogni ceppo variava leggermente nel suo tasso di crescita come determinato dal cambiamento di area del micelio (Figura 2). Sebbene non sia statisticamente significativo, NRRL 1555 ha avuto un cambiamento più rapido nell'area quando è stato placcato su 25% CMA, 25% PDA o 100% PDA. Allo stesso modo, NRRL 1465 ha avuto una variazione di area più elevata quando è stato coltivato con il 50% di PDA o CMA. NRRL 1464 ha avuto l'aumento più rapido dell'area quando è s...

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Discussione

Qui viene presentato un semplice protocollo per indurre la riproduzione sessuale in P. blakesleeanus in un ambiente di laboratorio. Una delle considerazioni più critiche per questo protocollo è la limitazione dei nutrienti. Si ipotizza che i funghi abbiano cooptato la riproduzione sessuale in risposta a condizioni ambientali difficili come la limitazione dei nutrienti 6,28,29,30,31,32.<...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il Comitato Esecutivo di Scienze Naturali del Colorado College, il Dipartimento di Biologia ed Ecologia degli Organismi e l'Hevey Family Fund for Student Research per aver finanziato questo lavoro. Estendiamo anche la nostra gratitudine ad Alice Keller e Tia Hutchens per il loro supporto tecnico.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agar in polvereThermoFisher3453PK
cloramfenicoloFisherSciBP904-100
Farina di mais agarCarolina742460
Panorama StitcherApple App Store
Phycomyces blakesleeanus (-) NRRL 1555Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti - Servizio di ricerca agricola1555USDA-ARS spedirà solo a ricercatori accademici; vedi sotto per alternative
Phycomyces blakesleeanus (-) NRRL 1564Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti - Servizio di Ricerca Agricola1564USDA-ARS spedirà solo a ricercatori accademici; vedi sotto per alternative
Phycomyces blakesleeanus (-) Tube CultureCarolina Biological Supply156183Cultura di livello educativo disponibile per l'acquisto; NRRL 1555
Phycomyces blakesleeanus (+) NRRL 1554Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti - Servizio di Ricerca Agricola1554USDA-ARS spedirà solo a ricercatori accademici; vedi sotto per alternative
Phycomyces blakesleeanus (+) NRRL 1565Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti - Servizio di Ricerca Agricola1565USDA-ARS spedirà solo a ricercatori accademici; vedi sotto per alternative
Phycomyces blakesleeanus (+) Tube CultureCarolina156182Cultura di livello educativo disponibile per l'acquisto; NRRL 1554
Destrosio di patate agarFisherSciDF0013-17-6
Sprout Plus Mini centrifugaHeathrow ScientificSKU 120610
Tween 20Sigma-AldrichP6585-10ML

Riferimenti

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