Articolo metodologico

Modello murino con ferita da taglio per lo studio dell'emorragia e dell'infiammazione nella lesione cerebrale traumatica

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DOI:

10.3791/67797

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21 febbraio 2025

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1Institute for Human Life Science, Ochanomizu University, 2Kitasato University School of Frontier Engineering

In questo articolo

Sommario

I modelli semplificati di lesione cerebrale traumatica (TBI) hanno facilitato lo sviluppo di approcci terapeutici. Questo protocollo delinea la creazione di una corteccia di topo con l'uso di aghi, che consente l'analisi di emorragie e infiammazioni. Il modello di topo TBI a pugnalata offre il vantaggio di essere eseguito senza richiedere attrezzature specializzate.

Abstract

La lesione cerebrale traumatica (TBI) deriva da danni fisici, spesso causati da incidenti o incidenti sportivi. Le cause del trauma cranico sono diverse, tra cui commozioni cerebrali, contusioni cerebrali, ematomi e fratture del cranio. Per replicare queste diverse cause, sono stati sviluppati vari modelli murini di TBI utilizzando protocolli distinti. La lesione cerebrale fisica porta a lesioni cerebrali sia primarie che secondarie, che esacerbano la perdita neuronale. La lesione primaria si verifica immediatamente dopo il danno, spesso a causa di un'emorragia, e successivamente innesca lesioni secondarie, inclusa l'infiammazione intorno alla lesione. Lo sviluppo di un modello di trauma cranico adatto a valutare l'estensione dell'emorragia e la gravità dell'infiammazione è quindi fondamentale. Questo protocollo introduce un metodo per imitare la lesione cerebrale penetrante, denominato modello murino di trauma cranico con ferita da taglio, per studiare i meccanismi di emorragia, infiammazione e perdita neuronale associati alla patologia del trauma cranico. Questo modello è stato creato perforando il cranio e il cervello con aghi ed è semplice da eseguire senza la necessità di attrezzature sperimentali specializzate. Inoltre, la piccola lesione inflitta alla corteccia cerebrale del topo utilizzando un ago non influisce sul comportamento dell'animale dopo l'intervento chirurgico. Questa funzione consente ai ricercatori di studiare gli effetti localizzati delle lesioni cerebrali senza preoccuparsi delle conseguenze comportamentali più ampie. I dati del campione di cortecce cerebrali di topo ferite da pugnalata dimostrano l'efficacia del modello nel valutare la perdita di sangue nel parenchima, l'attivazione gliale e la produzione di citochine infiammatorie. Inoltre, questo protocollo facilita la valutazione dei coagulanti del sangue e dei composti antinfiammatori, aiutando nello sviluppo di agenti terapeutici per il trauma cranico.

Introduzione

La lesione cerebrale traumatica (TBI) è causata da danni fisici, spesso derivanti da incidenti, inclusi incidenti stradali e incidenti di caduta. Il trauma cranico è classificato in due tipi: lesione cerebrale penetrante, che si verifica quando un oggetto appuntito perfora il cranio e il cervello, e lesione cerebrale chiusa, che è causata da un violento scuotimento del cervello all'interno senza una rottura nel cranio1.

Le cause del trauma cranico sono molto diverse, tra cui commozioni cerebrali, contusioni cerebrali, ematomi e fratture del cranio; pertanto, sono stati sviluppati modelli murini di TBI utilizzando vari protocolli per replicare queste diverse cause. Ad esempio, un modello di trauma cranico concussivo ripetitivo prevede lo scuotimento del cervello, in cui i topi vengono bloccati più volte utilizzando un impattatore di gomma controllato elettromagneticamente2. Inoltre, nel modello TBI a caduta di peso, una forte forza esterna viene esercitata sulla testa da un dispositivo standardizzato per la caduta del peso, causando una lesione contusiva focale con un cranio intatto3. Inoltre, il modello di trauma cranico con ferita da taglio viene preparato perforando il cranio e il cervello utilizzando un ago4 (Figura 1A). Poiché sono stati sviluppati diversi modelli di TBI, è importante scegliere un modello basato sulla patologia specifica che deve essere osservata.

Le lesioni cerebrali causate da danni fisici portano a lesioni cerebrali primarie e secondarie, che aggravano ulteriormente la perdita neuronale. La lesione primaria si verifica immediatamente dopo il danno, derivante dalla rottura della barriera emato-encefalica (BEE), dall'emorragia e dall'ematoma. Pertanto, ridurre al minimo l'emorragia e l'espansione dell'ematoma è fondamentale, poiché questi fattori possono esacerbare la gravità dei sintomi del trauma cranico. La lesione secondaria è innescata dai componenti del sangue intraparenchimale, che successivamente portano all'infiammazione intorno alla lesione5. La prognosi dopo una lesione cerebrale dipende dalla dinamica infiammatoria; Pertanto, è fondamentale mitigare rapidamente sia le lesioni primarie che quelle secondarie per una prognosi favorevole 6,7,8.

La BBB è composta da periciti, giunzioni strette tra le cellule endoteliali e le estremità degli astrociti, che lavorano insieme per limitare la fuoriuscita di sostanze dai vasi sanguigni nel cervello sano9. Nel sistema a coltellata presentato, la BBB viene fisicamente interrotta. I metodi comuni per valutare l'integrità della BBB includono la colorazione per le immunoglobuline G (IgG) e la valutazione della perdita di traccianti di fluorescenza, come il blu di Evans e il destrano10,11. La colorazione IgG etichetta i componenti del sangue che fuoriescono dal sito della lesione e si depositano nel cervello. Man mano che la BBB si riprende, la perdita di componenti del sangue nel cervello diminuisce e questi depositi vengono gradualmente degradati. Pertanto, la colorazione IgG viene utilizzata per valutare l'entità del recupero della BBB dopo una lesione cerebrale. Inoltre, il livello di perdita di tracciante somministrato per via endovenosa nel parenchima cerebrale riflette il recupero della BEE. Questo metodo fornisce una valutazione più chiara della dinamica della BEE, poiché la perdita di tracciante indica direttamente la transizione dei componenti del sangue dal flusso sanguigno al parenchima cerebrale. Inoltre, ridurre al minimo l'emorragia porta a una lesione primaria più lieve, supportata da una pronta coagulazione del sangue e da una fibrinolisi tempestiva. Pertanto, quantificare l'espressione dei regolatori della coagulazione del sangue e della fibrinolisi è un modo efficace per analizzare questo processo. Per quanto riguarda il meccanismo molecolare alla base della coagulazione, l'emorragia dopo una lesione cerebrale viene fermata dalla formazione di fibrina. Successivamente, il trombo ricco di fibrina viene degradato dall'attivatore del plasminogeno tissutale (tPA) e dall'attivatore del plasminogeno urochinasi (uPA). Nel modello murino con trauma cranico da taglio, la formazione di fibrina raggiunge il picco 1 giorno dopo la lesione e si riduce successivamentedi 10. Pertanto, il livello di recupero della BBB può essere previsto quantificando i componenti del sangue e lo stravaso del tracciante nel parenchima cerebrale, nonché l'espressione dei fattori della coagulazione del sangue.

I metodi di quantificazione dell'infiammazione nel processo di lesione secondaria includono l'attivazione gliale e l'espressione di citochine infiammatorie. L'infiammazione prolungata è indotta principalmente da un eccessivo accumulo di microglia e astrociti intorno al sito della lesione. Ad esempio, in un modello di trauma cranico con ferita da taglio, le ferite da taglio stimolano la riattivazione delle cellule gliali attorno alla lesione per rimuovere i detriti cellulari e i componenti del sangue. Questa riattivazione gliale raggiunge tipicamente il picco 3 giorni dopo la coltellata12,13. Oltre alla loro funzione di fagocitosi, le cellule gliali riattivate secernono eccessive citochine infiammatorie, con conseguente perdita neuronale intorno alla lesione14. È stato riportato che l'attenuazione dell'infiammazione gliale contribuisce a una prognosi favorevole dopo una lesione cerebrale12,14. Determinare il livello di infiammazione è utile per valutare la gravità e la prognosi. Pertanto, è essenziale sviluppare un modello di trauma cranico adatto a valutare l'estensione dell'emorragia e la gravità dell'infiammazione. Questo studio introduce un modello murino a coltellata che imita la lesione cerebrale penetrante, con l'obiettivo di studiare i meccanismi di emorragia, infiammazione e perdita neuronale nella patologia del trauma cranico.

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Protocollo

Tutti i protocolli per la cura degli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Ochanomizu, in Giappone, e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida stabilite dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e della Cultura in Giappone. Sono stati utilizzati topi femmina adulti C57BL/6J di sei settimane (20-25 g). A tutti i topi è stato fornito l'accesso ad libitum al cibo e all'acqua in un ambiente pulito. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Chirurgia con coltellata alla corteccia cerebrale

  1. Preparazione dei reagenti
    NOTA: Il protocollo anestetico è simile a quello precedentemente descritto15. Se la struttura per animali raccomanda un anestetico specifico, si prega di seguire le sue istruzioni. È stato precedentemente confermato che il pentobarbital sodico è efficace per la chirurgia della coltellata nella corteccia cerebrale 4,13,16,17.
    1. Combinazione di anestetico MMB: sciogliere 1,875 mL di 1 mg/mL di medetomidina, 2,0 mL di 5 mg/mL di midazolam e 2,5 mL di 5 mg/mL di butorfanolo tartrato in 18,625 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per creare un volume totale di 25 mL. Questa miscela avrà una concentrazione di 75 mg/L di medetomidina, 400 mg/L di midazolam e 500 mg/L di miscela di butorfanolo tartrato. Conservare a 4 °C per un massimo di 8 settimane prima dell'uso.
    2. Antagonista dell'anestesia: Sciogliere 150 μL di 5 mg/mL di atipamezolo cloridrato in 9,85 mL di PBS per creare un volume totale di 10 mL, con una concentrazione di 75 mg/L di atipamezolo cloridrato. Conservare a 4 °C, al riparo dalla luce, fino a 8 settimane prima dell'uso.
  2. Procedura chirurgica
    1. Anestesia del topo: anestetizzare temporaneamente i topi usando una carta imbevuta di soluzione per inalazione di isoflurano fino a quando non si addormentano. Quindi, iniettare 10 μL/g di combinazione di anestetico MMB intraperitoneale utilizzando una siringa da 1 ml con un ago da 27 G x 3/4". Dopo 3-5 minuti, confermare l'efficacia dell'anestesia eseguendo un pizzicamento delle dita dei piedi e controllando il riflesso di raddrizzamento.
      NOTA: Assicurarsi di prestare molta attenzione a non somministrare un sovradosaggio di anestesia quando si utilizza la soluzione per inalazione di isoflurano.
    2. Metti il mouse sul lato ventrale in un tovagliolo di carta. Dopo il trasferimento, riconfermare che il mouse è ancora anestetizzato con un pizzico di dita.
    3. Radere il pelo sulla pelle della regione occipitale. Sterilizzare il pelo sulla parte posteriore della testa del topo con etanolo al 70% utilizzando un batuffolo di cotone. Afferrare la pelle occipitale con una pinza smussata e praticare un'incisione larga 1,0-1,5 mm per esporre l'osso occipitale senza danneggiare il cranio o qualsiasi organo. Aprire delicatamente e lentamente l'incisione per osservare il confine tra la corteccia cerebrale e il cervelletto attraverso il cranio (Figura 1B).
      NOTA: Assicurarsi che non si verifichino danni al cranio o al cervello per il topo senza ferite.
    4. Craniotomia del topo: creare un piccolo foro nell'emisfero destro dell'osso occipitale utilizzando un ago da 19 G x 1•1/2". Ruotare delicatamente l'ago per creare un punto di inserimento per l'agugliatura della pugnalata, facendo attenzione a non danneggiare il parenchima cerebrale. Il foro deve essere posizionato sul punto medio della linea interaurale dell'emisfero destro tra lambda e bordo (Figura 1B). Questo foro funge da guida per l'inserimento dell'ago da pugnalata nella fase successiva.
    5. Pugnalata: inserire un ago da 27 G x 3/4" dal punto di inserimento e pugnalare la corteccia cerebrale lungo l'asse rostrocaudale (Figura 1B, C). L'ago viene inserito fino a quando non tocca la parte anteriore del cranio, quindi ritirato delicatamente. La profondità appropriata è quella in cui l'ago può essere visto attraverso la superficie della corteccia cerebrale. Il lato sinistro della corteccia cerebrale viene utilizzato come controllo non danneggiato.
    6. Sutura l'incisione cutanea utilizzando una sutura in nylon 3-0 con un ago rotondo da 1/2.
    7. Somministrare 10 μL/g di antagonista dell'anestesia per via intraperitoneale come l'anestetico combinato MMB. Il topo dovrebbe essere in grado di camminare entro 8-16 ore dall'iniezione dell'antagonista dell'anestesia.

2. Valutazione dell'emorragia e recupero dalla rottura della BBB

  1. Colorazione immunoenzimatica di una sezione cerebrale ferita da taglio per perdita di IgG di topo
    NOTA: Qui sono state utilizzate sezioni di cervello congelate montate su vetrino. Anche le sezioni di cervello congelate fluttuanti sono adatte a questo protocollo.
    1. Anestesia del topo: indurre l'anestesia posizionando il topo vicino a una carta imbevuta di soluzione per inalazione di isoflurano fino a quando non si addormenta. Quindi, somministrare immediatamente 100 μL/kg di anestetico combinato MMB per via intraperitoneale. Confermare l'effetto dell'anestesia con un pizzico di dita dei piedi e un riflesso raddrizzante.
    2. Posiziona il mouse sul retro e fissa entrambe le braccia e i piedi sulla tavola di dissezione.
    3. Toracotomia del topo: afferrare la pelle addominale usando una pinza smussata e praticare un'incisione di 1,0-1,5 cm attraverso la pelle e il peritoneo per esporre la gabbia toracica. Aprire con cautela la gabbia toracica con le forbici evitando di danneggiare il cuore per esporlo alla perfusione cardiaca.
    4. Fissazione della perfusione cardiaca: preparare una pompa di perfusione peristaltica e collegare un tubo con un ago da 19 G x 1•1/2" a un'estremità. Riempire il tubo con PBS accendendo la pompa prima dell'uso. Quindi, mentre la pompa è in funzione, inserire la punta dell'ago nel ventricolo sinistro e fissarla con una pinza. Praticare un'incisione di 0,5-1,0 mm nell'atrio destro. Perfondere il topo18 a una velocità di 4-6 ml/min per 5 minuti con almeno 20 ml di PBS per rimuovere il sangue.
    5. Arrestare la pompa e trasferire il tubo in una soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS. Riavviare la pompa a una velocità di 4-6 ml/min per 5 minuti con almeno 20 ml di PFA al 4% in PBS per la fissazione18.
      NOTA: Se la pompa non è disponibile, è anche possibile utilizzare una siringa da 50 ml con un ago da 19 G x 1•1/2" per la perfusione.
    6. Dissezione cerebrale: posizionare il topo sul lato ventrale sulla tavola di dissezione ed esporre il cranio praticando un'incisione attraverso la linea mediana della pelle dall'area occipitale al naso. Esporre con cura il cervello completamente rimuovendo il cranio con le forbici, facendo attenzione a non danneggiare il cervello. Sollevare il cervello con una pinza curva e trasferirlo in una provetta da 15 ml riempita con 10 ml di PFA al 4% in PBS.
    7. Incubare il cervello sezionato per una notte nel PFA al 4% in PBS a 4 °C per una fissazione completa. Successivamente, incubare il cervello per una notte in 10 ml di saccarosio al 15% in PBS e trasferirlo in 10 ml di saccarosio al 30% in PBS per un ulteriore giorno su un agitatore altalena. Questa graduale sostituzione del saccarosio aiuta a prevenire i danni ai tessuti causati dal ghiaccio quando il cervello viene successivamente conservato in un congelatore.
    8. Incorporamento del cervello: incorporare il cervello coronalmente in un mezzo di inclusione all'interno di uno stampo per l'inclusione dei tessuti e quindi congelare utilizzando 2-metilbutano con ghiaccio secco19.
    9. Sezioni cerebrali congelate: utilizzando un criostato, montare sezioni coronali seriali (20 μm di spessore) del cervello incorporato su un vetrino a carica positiva. Le sezioni cerebrali vengono essiccate completamente all'aria a temperatura ambiente per una notte e conservate in un congelatore a -80 °C.
    10. Preparazione del tampone bloccante: Mescolare il 10% di siero di vitello neonato, 30 mg/mL di albumina bovina, 10 mg/mL di glicina e lo 0,4% di Triton X-100 in TBS per creare il tampone bloccante. Conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane prima dell'uso.
    11. Colorazione delle IgG di topo: dopo che le sezioni della corteccia cerebrale ferite da pugnalata sono state asciugate all'aria a temperatura ambiente per 1 ora, post-fissarle con 500 μL di PFA al 4% per vetrino per 30 minuti. Quindi, lavare la sezione con PBS (500 μL/vetrino) per 5 minuti, seguiti da due lavaggi con soluzione salina tamponata Tris (TBS, 500 μL/vetrino) per 5 minuti ciascuno.
      NOTA: Eseguire tutte le procedure in una scatola idratante per evitare che i tamponi evaporino.
    12. Estinguere l'attività enzimatica endogena in sezioni con il 10% di metanolo e il 3% di perossido di idrogeno in TBS per 5 minuti, seguiti da due lavaggi con soluzione salina tamponata con Tris (TBS, 500 μL/vetrino) per 5 minuti ciascuno.
    13. Eseguire il blocco utilizzando un tampone bloccante (500 μL/vetrino) per 1 ora a temperatura ambiente per evitare il legame non specifico dell'anticorpo. Quindi, incubare le sezioni con un anticorpo IgG di topo coniugato con biotina (diluizione 1:300 con il tampone bloccante, 300 μL/vetrino) per 1 ora a temperatura ambiente.
    14. Durante l'incubazione con l'anticorpo IgG di topo, preparare la miscela di 1 μL di reagente A e 1 μl di reagente B dal kit del sistema perossidasi a base di avidina/biotina in 300 μl di tampone bloccante. Incubare questa miscela per 30 minuti a temperatura ambiente prima dell'uso. Al termine dell'incubazione degli anticorpi IgG di topo, lavare le sezioni con TBS per 5 minuti, tre volte. Quindi, incubare le sezioni con la miscela preparata di reagenti A e B (300 μl/vetrino) per 1 ora a temperatura ambiente.
    15. Lavare le sezioni con Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 per 5 minuti, tre volte, nel corso di 1 ora. Quindi, sviluppare il colore utilizzando 3,3'-diaminobenzidina (DAB) allo 0,05% in 0,05% di perossido di idrogeno aggiunto 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 (500 μL/vetrino) per 5 minuti a 1 ora (Figura 2A). Osservare al microscopio il cambiamento di colore prima di interrompere la reazione.
    16. Lavare le sezioni con Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 per 5 minuti tre volte e asciugare le sezioni all'aria per 15 minuti. Successivamente, disidratare le sezioni immergendole in etanolo al 95% per 2 minuti due volte, seguito da etanolo al 100% per 2 minuti, due volte. Elimina le sezioni in xilene per 5 minuti due volte. Applicare un vetrino coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio insolubile in acqua e lasciarle asciugare.
    17. Analisi dell'intensità di colorazione delle IgG di topo: Acquisizione di immagini delle sezioni utilizzando un microscopio con un obiettivo 20x.
    18. Utilizzando il software ImageJ, è possibile quantificare l'intensità della colorazione misurando i valori medi di grigio in cinque campi selezionati casualmente (8 × 8 μm,2 per ciascuno) dalle regioni colorate immunoenzimaticamente in ciascuna sezione. Normalizzare l'intensità della colorazione utilizzando il valore medio di grigio di ciascun controlaterale; Non c'è una regione ferita come correzione dello sfondo. Calcolare la media dei valori medi di grigio normalizzati dai cinque campi per determinare il valore medio di grigio della colorazione IgG di topo per ciascuna sezione.
  2. Valutazione della perdita di blu di Evans nel parenchima cerebrale
    NOTA: Il protocollo blu di Evans è simile al metodo precedentemente descritto11. Il destrano marcato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) funziona anche per il recupero dalla degradazione della BBB10.
    1. Iniezione di blu di Evans: somministrare il 2% di blu di Evans in PBS (3 ml/kg) al topo ferito attraverso la vena caudale 1 ora prima della dissezione.
    2. Estrazione di cervello fresco: 1 ora dopo la somministrazione di Evans blue, perfondere il topo con PBS come descritto nei passaggi 2.1.1-2.1.4. Quindi, sezionare e tagliare il cervello fresco coronalmente in sezioni spesse 1 mm usando un'affettatrice cerebrale. Selezionare quattro fette e ritagliare pezzi di cervello (1 mm2 quadrati, ciascuno) che includano la regione della pugnalata o le regioni intatte nella corteccia cerebrale senza ferita, secondo la carta millimetrata (Figura 1D).
    3. Quantificazione del blu di Evans: raccogliere i quattro pezzi di cervello in una provetta da 1,5 ml e omogeneizzarli con 200 μl di acido tricloroacetico utilizzando un trituratore di tessuti. Centrifugare l'omogeneizzato a 10.000 x g a 4 °C per 20 minuti. Quindi, raccogliere il surnatante con una pipetta e diluirlo con 600 μL di etanolo. Preparare una curva standard di blu di Evans, compresa tra 0 e 1,0 ng/mL, per quantificarne la concentrazione. Misurare l'intensità della fluorescenza a 680 nm con una lunghezza d'onda di eccitazione di 620 nm utilizzando un lettore di piastre.

3. Valutazione del livello di infiammazione nel cervello dopo la coltellata

  1. Colorazione immunoenzimatica della sezione cerebrale ferita da taglio per cellule gliali
    1. Preparazione delle sezioni cerebrali: Realizzare i vetrini montati sulle sezioni cerebrali come descritto nei passaggi 2.1.1-2.1.9.
    2. Colorazione gliale: Dopo aver asciugato all'aria le sezioni della corteccia cerebrale ferite da taglio per 1 ora, fissare nuovamente le sezioni con PFA al 4% (500 μL/vetrino) per 30 minuti. Quindi, lavare le sezioni con PBS (500 μL/vetrino) per 5 minuti, seguito da due lavaggi con TBS (500 μL/vetrino) per 5 minuti ciascuno.
    3. Estinguere l'attività enzimatica endogena in sezioni con il 10% di metanolo e il 3% di perossido di idrogeno in TBS per 5 minuti, seguiti da due lavaggi con soluzione salina tamponata con Tris (TBS, 500 μL/vetrino) per 5 minuti ciascuno.
    4. Eseguire il blocco utilizzando un tampone bloccante (500 μL/vetrino) per 1 ora a temperatura ambiente per evitare il legame non specifico dell'anticorpo.
    5. Incubare le sezioni per una notte con l'anticorpo primario (300 μL/vetrino). Utilizzare le seguenti diluizioni per l'anticorpo primario: diluizione 1:3.000 per Iba1 e diluizione 1:1.000 per GFAP, diluita nel tampone bloccante.
    6. Lavare la sezione tre volte con TBS per 5 minuti ciascuna. Quindi, incubare con l'anticorpo secondario coniugato con biotina (diluizione 1:300 con il tampone bloccante, 300 μL/vetrino) per 1 ora a temperatura ambiente.
    7. Durante l'incubazione con l'anticorpo secondario, preparare la miscela di 1 μL di Reagente A e 1 μL di Reagente B dal kit del sistema perossidasi a base di avidina/biotina in 300 μL di tampone bloccante. Quindi incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell'uso.
    8. Al termine dell'incubazione dell'anticorpo secondario, lavare le sezioni tre volte con TBS per 5 minuti ciascuna e incubare le sezioni con la miscela preparata di reagenti A e B (300 μL/vetrino) per 1 ora a temperatura ambiente.
    9. Lavare le sezioni con Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 per 5 minuti, tre volte, nel corso di 1 ora. Quindi, sviluppare il colore utilizzando DAB allo 0,05% in Tris-HCl 0,1 M di Tris-HCl aggiunto allo 0,05% per 30 minuti-3 ore. Osservare al microscopio il cambiamento di colore prima di interrompere la reazione.
    10. Lavare le sezioni con Tris-HCl 0,1 M pH 8,0 per 5 minuti tre volte e asciugare le sezioni all'aria per 15 minuti. Successivamente, disidratare le sezioni immergendole in etanolo al 95% per 2 minuti due volte, seguito da etanolo al 100% per 2 minuti, due volte. Elimina le sezioni in xilene per 5 minuti due volte. Applicare un vetrino coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio insolubile in acqua e lasciarle asciugare. Cattura le immagini della sezione utilizzando il microscopio con un obiettivo di 20x.
  2. Colorazione immunofluorescente della sezione cerebrale ferita da pugnalata per cellule gliali
    1. Preparazione delle sezioni cerebrali: Realizzare i vetrini montati sulle sezioni cerebrali come descritto nei passaggi 2.1.1-2.1.9.
    2. Colorazione gliale: Dopo aver asciugato all'aria le sezioni della corteccia cerebrale ferite da taglio per 1 ora, fissare nuovamente le sezioni con PFA al 4% (500 μL/vetrino) per 30 minuti. Quindi, lavare le sezioni con PBS (500 μL/vetrino) per 5 minuti, seguito da due lavaggi con TBS (500 μL/vetrino) per 5 minuti ciascuno. Eseguire il blocco utilizzando un tampone bloccante (500 μL/vetrino) per 1 ora a temperatura ambiente per evitare il legame non specifico dell'anticorpo.
    3. Incubare le sezioni per una notte con l'anticorpo primario (300 μL/vetrino). Utilizzare le seguenti diluizioni per l'anticorpo primario: diluizione 1:3.000 per Iba1 e diluizione 1:1.000 per GFAP, diluita in tampone bloccante.
    4. Lavare la sezione tre volte con TBS per 5 minuti ciascuna. Quindi, incubare con l'anticorpo secondario coniugato fluorescente (diluizione 1:300 con il tampone bloccante, 300 μL/vetrino) per 1 ora a temperatura ambiente.
    5. Lavare le sezioni tre volte con TBS per 5 minuti ciascuna e incubare le sezioni con 0,4 μg/mL di soluzione DAPI in TBS (500 μL/vetrino) per 5 minuti a temperatura ambiente.
    6. Lavare le sezioni con TBS (500 μL/vetrino) per 5 minuti e con acqua distillata (500 μL/vetrino) per 5 minuti. Dopo aver asciugato le sezioni all'aria per 15 minuti, coprirle con un mezzo di montaggio a base d'acqua e lasciarle asciugare. Cattura le immagini delle sezioni utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 20x.
  3. QPCR in tempo reale per marcatori di cellule gliali e citochine infiammatorie
    NOTA: Le sequenze di primer 16,20,21,22 utilizzate nel protocollo presentato sono elencate nella Tabella 1.
    1. Preparazione del tessuto cerebrale fresco: perfondere il topo con PBS come descritto nei passaggi 2.1.1-2.1.4. Quindi, estrarre e tagliare il cervello fresco coronalmente in sezioni spesse 1 mm usando un'affettatrice per cervelli. Seleziona quattro fette e ritaglia pezzi di cervello (1 mm2 quadrati, ciascuno) che includono la regione della ferita da taglio o le regioni intatte sul lato controlaterale della corteccia cerebrale, secondo la carta millimetrata. Determinare la regione da tagliare, che include la lesione al centro (Figura 1D).
    2. Estrazione dell'RNA: raccogliere i quattro pezzi di cervello in una provetta da 1,5 ml e omogeneizzarli con 1 ml di reagente TRIzol mediante pipettaggio. Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 200 μL di cloroformio, agitare bene e incubare per altri 2 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la miscela a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Trasferire con cura lo strato superiore trasparente in una nuova provetta da 1,5 mL, evitando precipitati bianchi che contengono DNA e proteine.
    3. Aggiungere 500 μl di isopropanolo allo strato superiore raccolto, mescolare bene e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C, rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di etanolo al 70% per lavare il pellet di RNA. Centrifugare a 7.500 x g per 5 minuti a 4 °C, rimuovere completamente il surnatante e asciugare il pellet all'aria per 10 minuti. Sciogliere il pellet di RNA in 15 μL di acqua priva di RNasi e denaturare l'RNA per 10 minuti a 55°C.
    4. Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume. Conservare immediatamente l'RNA a -80 °C.
    5. Sintesi del cDNA: per la sintesi del cDNA, utilizzare un kit di sintesi del DNA disponibile in commercio. Preparare un totale di 10 μl di tampone di reazione in una provetta da 1,5 μl per ogni campione, che include 2 μl di 5 tampone RT, 0,5 μl di miscela enzimatica RT, 0,5 μl di miscela di primer, 1 μg di RNA e acqua priva di nucleasi. Incubare a 37 °C per 15 minuti per la reazione di trascrizione inversa e a 98 °C per 5 minuti per la reazione di inattivazione enzimatica. Quindi, aggiungere 90 μL di acqua priva di nucleasi nel tampone e mescolare bene. Conservare la soluzione di cDNA a -20°C.
    6. Quantificazione dell'espressione dell'RNA: per l'analisi qPCR in tempo reale, utilizzare un kit di master mix qPCR disponibile in commercio. Preparare la soluzione di miscelazione per ciascun campione combinando 5 μl di KOD SYBR qPCR Mix, 0,4 μl di primer diretto da 5 μM, 0,4 μl di primer inverso da 5 μM e 0,2 μl di 50 x ROX in 2 μl di acqua priva di nucleasi.
    7. Preparare una miscela di 2 μl di soluzione di cDNA e 8 μl di soluzione Mix in una provetta da 8 strisce, mescolare bene e centrifugare.
    8. Avviare la reazione PCR con le seguenti condizioni cicliche: 98 °C per 2 minuti, seguiti da 40 cicli di 98 °C per 10 s, 60 °C per 10 s e 68 °C per 30 s. Eseguire la fase di analisi della curva di fusione/dissociazione utilizzando una macchina qPCR in tempo reale.
    9. Analisi dell'espressione dell'mRNA: Analizzare il livello di espressione dell'mRNA utilizzando il metodo 2-Delta-Delta-Ct, che viene eseguito mediante normalizzazione con un gene housekeeping, Gapdh, quindi con quello del lato controlaterale23.

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Risultati

Per analizzare il recupero dalla rottura della BEE, il livello di emorragia nelle cortecce cerebrali ferite da pugnalata è stato valutato misurando il livello di stravaso di IgG sieriche a 1, 3, 5 e 7 giorni dopo la lesione cerebrale. Le immagini di colorazione delle IgG di topo hanno rivelato perdite di sangue e deposizione nelle cortecce cerebrali a seguito di lesioni cerebrali. Questo si è ridotto dopo più di 7 giorni, quando la BBB si è ripresa e la proteina IgG si è degradata (Figura 2B...

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Discussione

In questo caso, è stato introdotto un protocollo per la creazione di un modello murino di TBI utilizzando gli aghi. Questo protocollo consente una valutazione quantitativa del recupero dalla rottura della BBB e dall'infiammazione dopo una lesione cerebrale utilizzando approcci istologici e biologici molecolari. Protocolli alternativi, come il modello di trauma cranico concussivo ripetitivo e il modello di trauma cranico a caduta di peso, possono essere utilizzati anche per analizzare la ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Ayana Hamano, Minori Yamashita, Misaki Endo, Hirono Kobayashi e Nito Nakahira per l'aiuto con l'immunoistochimica e la qPCR in tempo reale. Questo lavoro è stato sostenuto da JSPS KAKENHI 19K16122, Takeda Science Foundation, Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders, The Mitsubishi Foundation, Brain Science Foundation e The Uehara Memorial Foundation to K.H.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
19 G x 1& toro; Ago da 1/2"TERUMONN-1938R 
Ago da 27 G x 3/4TERUMONN-2719S
anticorpo anti-GFAPSigma-AldrichG9269
anti-Iba1 anticorpoWako019-19741
Atipamezolo cloridratoNippon Zenyaku KogyoNome del prodotto: Antisedan Anticorpo
IgG di topo coniugato con biotinaVector LaboratoriesBA-9200
Anticorpo IgG di coniglio coniugato con biotinaVector LaboratoriesBA-1000
Albumina bovinaNacalai tesque01860-07
Affettatrice cerebraleVisikolBSLM-2
Butorphanol TartratoMeiji SaluteNome del prodotto: Vetorphale 5 mg
Microscopio confocaleZeissLSM700
Criostato LeicaCM1520
DABSigma-AldrichD5637-1G
DAPIRoche 10236276001
Evans bluWako056-04061
Anticorpo IgG di coniglio coniugato fluorescenteInvitrogenA-21206
Fluoromount-GInvitrogen4958-02Mezzo
Soluzione per inalazione di isofluranoViatrisv002139
KOD SYBR qPCR MixTOYOBOQKD-201qPCR master mix kit
MedetomidinaNippon Zenyaku KogyoNome del prodotto: Domitor
MicroscopioOlympusFSX100
Spettrofotometro per microvolumiThermoFisher ScientificNanoDrop One
Midazolam 10 mg/2 mLSandoz1124401A1060
MOUNT QUICKDaido SangyoDM01Terreno di montaggio insolubile
in acqua Siero di vitello neonatoComposto Gibco16010159
O.C.T. SakuraFinetek Japan45833Terreno di inclusione
Peel-A-Way, troncato 22 mm Square TopTed Pella27118Stampo per inclusione di tessuti
Pompa di perfusione peristalticaATTOSJ-1211
Lettore di piastreFisher ScientificCytation 3
Macchina qPCR in tempo realeThermoFisher ScientificStepOne Plus
ReverTra Ace qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101Kit di sintesi di cDNA
Superfrost Plus Slide GlassFisher Scientific12-550-15Sutura in vetro scorrevole a carica positiva
con ago AlfresaHT2003NA75-KF2
TRIzol ReagenteInvitrogen15596026
VECTASTAIN ABC Kit standardVector LaboratoriesPK-4000Kit del sistema di perossidasi a base di avidina/biotina
" animale di montaggio a base d'acqua

Riferimenti

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