Regolazione fine dell'orientamento di Caenorhabditis elegans su cuscinetti agar canalizzati per la neurorigenerazione dell'imaging

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per la fabbricazione di pad di agar canalizzati utilizzando stampi PDMS creati da dischi in vinile. I canali consentono agli utenti di orientare con precisione Caenorhabditis elegans per migliorare il contrasto dell'imaging e facilitare il confronto delle strutture. Queste capacità sono particolarmente utili negli studi di neurorigenerazione.

Abstract

Caenorhabditis elegans è un organismo modello ampiamente utilizzato per lo studio dei processi biologici. La sua trasparenza e le sue dimensioni ridotte lo rendono ideale per l'imaging di tessuti, cellule e strutture subcellulari. I tradizionali cuscinetti piatti in agar per l'imaging di C. elegans limitano il controllo sull'orientamento dell'animale, limitando la vista principalmente alle prospettive laterali. Questa limitazione complica la visualizzazione delle strutture dorso-ventrali e riduce la nitidezza dell'immagine, specialmente negli animali più anziani con maggiore pigmentazione e diametri maggiori. Per superare queste sfide, abbiamo sviluppato cuscinetti di agarosio canalizzati che consentono un controllo preciso dell'orientamento degli animali. Questi canali consentono ai ricercatori di ruotare e fissare C. elegans in posizioni specifiche, facilitando l'imaging simultaneo di più strutture e migliorando la risoluzione dell'immagine avvicinando le cellule bersaglio all'obiettivo del microscopio. Ciò è particolarmente utile per l'imaging di fibre neuronali rigenerate dopo l'intervento chirurgico, che possono crescere in direzioni difficili da catturare con i tradizionali cuscinetti di agar piatto. Questo metodo è accessibile, poiché la fabbricazione di tamponi di agar canalizzati richiede lo stesso tempo e gli stessi materiali dei tamponi piatti, il che lo rende un'opzione pratica per la maggior parte dei laboratori.

Introduzione

Il nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo modello ampiamente utilizzato per lo studio dei processi biologici come lo sviluppo e il comportamento grazie alla sua genetica fortemente conservata con le controparti dei mammiferi¹. I ricercatori coltivano C. elegans su una piastra di terreno di crescita per nematodi (NGM) in un ambiente strettamente controllato che standardizza le condizioni sperimentali e consente un'attribuzione più precisa dei risultati alle variabili sperimentali. L'animale è trasparente, consentendo un imaging chiaro di tessuti, cellule e strutture subcellulari. I C. elegans sono piccoli, con gli animali adulti di ~1 mm di lunghezza e 80 μm di diametro, il che consente il posizionamento di più animali su un singolo supporto per vetrini per l'imaging¹. Le loro piccole dimensioni consentono inoltre a una singola immagine di catturare l'intero organismo mentre si risolvono le singole cellule, il che è fondamentale per visualizzare la rigenerazione delle fibre neuronali. In sinergia con questi vantaggi per la microscopia, il rapido sviluppo, l'anatomia stereotipata e la facile genetica di C. elegans consentono studi su larga scala¹.

La procedura tipica per l'imaging delle cellule in C. elegans è stata stabilita decenni fa ed è rimasta in gran parte invariata. I ricercatori utilizzano cuscinetti piatti di agar su vetrini per montare e immobilizzare gli animali per la visualizzazione delle loro cellule². Un vetrino coprioggetti sulla parte superiore del cuscinetto tiene gli animali in posizione e protegge la lente del microscopio. È importante sottolineare che il vetrino coprioggetti ha un alto indice di rifrazione che aumenta l'apertura numerica della luce catturata e migliora la risoluzione dell'immagine. Inoltre, il vetrino coprioggetti riduce la distorsione nella trasmissione della luce. Pertanto, un vetrino coprioggetti migliora la visualizzazione delle cellule e delle strutture bersaglio.

Quando vengono utilizzati con un vetrino coprioggetti, tuttavia, i cuscinetti piatti in agar spesso limitano l'orientamento degli animali. C. elegans si piega lungo la loro direzione dorso-ventrale (DV) in modo da adottare un orientamento laterale su un cuscinetto di agar piatto. Tuttavia, anche dopo l'immobilizzazione, il raddrizzamento e la pre-rotazione in un orientamento DV, il posizionamento del vetrino coprioggetti riporta quasi tutti gli animali in una vista laterale (Figura 1). Riteniamo che questo riorientamento avvenga perché il vetrino coprioggetti spinge di lato la vulva sporgente di C. elegans . Gli animali più giovani senza vulva sono orientati in modo più casuale. Questo controllo limitato sull'orientamento è problematico per almeno due motivi. In primo luogo, potrebbe non consentire il posizionamento di due strutture in un unico campo visivo (ad esempio, bilaterale), il che complica il loro confronto. In secondo luogo, l'impostazione dell'orientamento è importante per ottimizzare la qualità dell'imaging, poiché le strutture di interesse vengono generalmente visualizzate al meglio quando sono vicine all'obiettivo. Ciò è dovuto al fatto che gli obiettivi riproducono una profondità limitata all'interno del campione (ad esempio, la distanza di lavoro) e perché la luce proveniente da posizioni più profonde subisce una maggiore dispersione e assorbimento.

Per C. elegans, il controllo limitato sull'orientamento è generalmente più grave con gli animali più anziani. Gli animali di età da L1 a L4 hanno un diametro più piccolo, rendendo visibile una frazione più alta del verme. Queste larve hanno anche una minore pigmentazione, con conseguente riduzione dell'assorbimento della luce visibile e della dispersione dei fotoni, che migliora la nitidezza e la risoluzione dell'immagine. Al contrario, gli animali adulti hanno un diametro maggiore e una maggiore pigmentazione, il che pone sfide per l'imaging nei piani z più profondi poiché il vetrino coprioggetti influisce sull'orientamento iniziale.

Nel 2008, abbiamo introdotto una strategia che utilizza cuscinetti di agar con canali per superare queste sfide mantenendo l'orientamento degli animali ^3,4. Come descritto di seguito, gli utenti ruotano gli animali immobilizzati nei canali all'orientamento desiderato annotando i punti di riferimento anatomici. I canali trattengono gli animali in depressioni tra le superfici di agar rialzate, riducendo al minimo la forza sull'animale durante il posizionamento del vetrino coprioggetti ed eliminando la rotazione dell'animale. Poiché la fabbricazione di tamponi canalizzati e comuni tamponi piatti segue quasi la stessa procedura e richiede lo stesso tempo, la nostra tecnica è altamente accessibile. Molti laboratori utilizzano la nostra tecnica per immobilizzare C. elegans per studiare le caratteristiche anatomiche, osservare lo sviluppo e analizzare i contributi neuronali al comportamento 5,6,7,8. La sezione seguente descrive l'intero processo per la produzione dell'agar canalizzato, a partire da un disco in vinile che è stato tagliato in quarti usando un coltello caldo. Innanzitutto, descriviamo la fabbricazione dello stampo in polidimetilsilossano (PDMS) utilizzato per fondere l'agar canalizzato. Quindi, mostriamo passo dopo passo come fabbricare l'agar canalizzato. L'intera procedura dovrebbe durare 3 ore senza esperienza. Seguendo la procedura di fabbricazione PDMS, i tamponi realizzati con lo stampo impiegheranno lo stesso tempo per essere realizzati come i tipici tamponi di agar (pochi minuti).

Protocollo

1. Preparazione del polidimetilsilossano (PDMS) per la fabbricazione

1. Versare un rapporto di 1:10 dell'agente a polimerizzazione rapida sulla base in un piatto di pesata monouso. Mescolare il liquido non polimerizzato per 45 s fino a quando il liquido è completamente integrato e pieno di bolle.
2. Posizionare il vassoio in un essiccatore sottovuoto inclinato. Ciclizzare la pressione tra -0,09 e -0,1 kPa 3 volte per consentire alle bolle d'aria di emergere.
3. Tenere l'aspirapolvere acceso per circa un'ora a una pressione compresa tra -0,09 e -0,1 kPa fino a quando non rimangono poche bolle visibili, che possono essere rimosse manualmente.

2. Fabbricazione di stampi PDMS di dischi in vinile

1. Sciacquare il disco in vinile e la lastra di vetro con acqua deionizzata (DI). Garantire l'assenza di polvere per ottenere lo stampo migliore. Lascia asciugare il disco in vinile all'aria fino al momento dell'uso.
2. Posizionare un foglio di carta stagnola sopra la piastra riscaldante per raccogliere il PDMS in eccesso.
3. Metti un vetrino su ciascuna estremità del disco in vinile per impostare lo spessore dello stampo sulla larghezza dei vetrini. Ciò garantisce un'altezza uniforme quando si preme la lastra di vetro sul PDMS non polimerizzato.
4. Versare il liquido PDMS non polimerizzato su un lato del disco in vinile.
5. Osservare le bolle utilizzando la riflessione della luce sulla superficie del liquido e rimuoverle con la punta di una pipetta. Inclinare la lastra di vetro e abbassarla lentamente lasciando fuoriuscire l'aria, evitando l'introduzione di bolle.
6. Polimerizzare il PDMS a 80 °C per 35 minuti.
7. Togliete il disco in vinile dalla piastra riscaldante e lasciatelo raffreddare. Staccare con cura il PDMS dal disco in vinile per evitare strappi.
8. Utilizzare un nuovo vetrino come guida per tagliare il PDMS con un rasoio affilato per creare uno stampo per agar canalizzato.

3. Fabbricazione di tamponi di agar canalizzati con NaN₃

NOTA: La procedura e i materiali per i tamponi di agar piatti sono stati precedentemente stabiliti⁹. Questa procedura è molto simile.

1. Aggiungere 0,6 g di agar agar e 30 ml di brodo liquido^{NGM 9} in un pallone. Aggiungere una barretta di agitazione e scaldare su una piastra calda a 120 °C.
2. Aggiungere 120 μl di stock NaN₃ (concentrazione stock di 1 M) dopo che il gel si è sciolto.
3. Lavare lo stampo PDMS con acqua e lasciarlo asciugare all'aria. Posizionate lo stampo PDMS tra due serie di coppie di diapositive.
4. Pipettare l'agar su e giù per riscaldare il puntale della pipetta. Pipettare 300 μl di agar fuso sullo stampo PDMS, distribuendo manualmente l'agar attraverso i canali, poiché il posizionamento del vetrino diffonderà l'agar lungo i canali.
5. Posizionare un vetrino da microscopio direttamente sull'agar, appoggiandolo sui vetrini ai lati. Rimuovere il vetrino dopo che l'agar si è raffreddato.

4. Montaggio di C. elegans

1. Una volta che le diapositive si sono raffreddate, sollevare la diapositiva direttamente dallo stampo senza tagliarla.
2. Sposta gli animali nei canali dopo che sono stati immobilizzati da NaN₃
3. Ruota gli animali nell'orientamento desiderato.
4. Posizionare un vetrino coprioggetti sul tampone. Inclinare il pad e spingere leggermente verso il basso da un lato all'altro per spingere l'aria di lato ed evitare di creare bolle.

Risultati

Fabbricazione di stampi PDMS
Il ciclo della pressione del vuoto durante la fabbricazione dello stampo fora e rimuove le bolle d'aria dal PDMS non polimerizzato, garantendo uno stampo privo di bolle. Come mostrato nella Figura 3D , le bolle salgono in superficie e si perforano. Gli stampi senza bolle possono produrre canali puliti.

Solidificazione dello stampo PDMS
Quando si posiziona la lastra di vetro sul disco in vinile, evitare di creare intercapedini d'aria. Questi spazi vuoti possono portare a spessori irregolari o difetti superficiali. Le bolle, se presenti, possono essere rilevate visivamente. Premendo la lastra di vetro da un lato all'altro si sposta l'aria, riducendo al minimo la formazione di bolle e garantendo uno spessore uniforme dello stampo mostrato nella Figura 4A.

Utilizzo di cuscinetti di agar canalizzati per l'orientamento preciso di C. elegans
I cuscinetti di agar canalizzati consentono un orientamento preciso di C. elegans. Impostiamo l'orientamento dell'animale facendo rotolare leggermente l'animale con un plettro di platino, verificando l'orientamento utilizzando punti di riferimento, come la vulva o l'intestino a forma di S (Figura 5A, C). Confermiamo l'orientamento sotto un microscopio da dissezione fluorescente prima di trasferire gli animali su un microscopio invertito mostrato nella Figura 5B, D.

Valutazione della rigenerazione delle fibre neuronali con cuscinetti di agar canalizzati
I cuscinetti di agar canalizzati migliorano la qualità dell'imaging della rigenerazione neuronale orientando in modo ottimale l'animale. Il posizionamento delle fibre di neuroni rigenerati più vicino alla lente dell'obiettivo riduce la dispersione e l'assorbimento della luce, migliorando la nitidezza dell'immagine. Le figure 5E, F mostrano che posizionare il sito di rigenerazione più vicino all'obiettivo migliora la qualità dell'imaging, facilitando un'analisi più accurata della ricrescita neuronale.

Figura 1: Caenorhabditis elegans su cuscinetti piatti e canalizzati. (A) Animale su piattaforma di agar piatta con orientamento DV; La vulva affronta il vetrino coprioggetti. (B) L'introduzione del vetrino coprioggetti spinge la vulva di lato, costringendo l'animale all'orientamento laterale. (C) Animale su un pad di agar canalizzato con orientamento DV. (D) Resti di animali in orientamento DV dopo l'introduzione del vetrino coprioggetti. (E) Immagine in campo chiaro del mutante roller su un pad di agar canalizzato con orientamento DV. (F) Immagine in campo chiaro con vetrino coprioggetti, lo stesso animale di E rimane in orientamento DV. Abbreviazioni: DV = dorso-ventrale; lat = laterale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Materiali e attrezzature per la fabbricazione di PDMS. (A) Kit di elastomeri siliconici SYLCAP 284-F. (b) Scala. (C) Siringa di plastica. (D) Essiccatore a vuoto. (E) Piastra riscaldante. (F) Disco in vinile da 12 pollici a riproduzione lunga, smontabile secondo necessità. (G) Lastra di vetro. Abbreviazione: PDMS = polidimetilsilossano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Miscelazione e aspirazione di PDMS non polimerizzati. (A) Mescolare la base e l'agente indurente nella teglia. (B) Posizionare il vassoio in una camera a vuoto. (C) Passare l'aspirapolvere tre volte per consentire alle bolle di affiorare. (D) Dopo un'ora, la maggior parte delle bolle è scoppiata. Si noti una migliore trasmissione tramite PDMS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Introduzione di una lastra di vetro al PDMS non polimerizzato senza bolle. (A) Introduzione di una lastra di vetro su disco in vinile senza bolle. (B) Stampo PDMS solidificato rimosso dal disco, con canali di dettaglio inseriti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini in campo chiaro e a fluorescenza di C. elegans montate su agar canalizzato. (A) Immagine in campo chiaro di un animale in orientamento DV bilaterale. Punto di riferimento anatomico per l'orientamento DV: intestino a spirale a forma di S (tessuto più scuro indicato da una freccia) che attraversa la linea mediana ~60% della distanza tra naso e coda. (B) Immagine a fluorescenza di neuroni in orientamento DV, stesso animale di A. (C) Immagine in campo chiaro di un animale in orientamento lat. Punto di riferimento anatomico per l'orientamento del ltelletto: lato rivolto verso la vulva. (D) Immagine a fluorescenza di neuroni in orientamento lat, stesso animale di C. (E) Orientamento con rigenerazione (freccia) nel lato più profondo (lontano) di un animale. (F) Orientamento con rigenerazione in animali laterali meno profondi più vicini all'obiettivo; Rigenerazione più chiara (freccia). Barre di scala = 20 μm. Abbreviazioni: DV = dorso-ventrale; lat = laterale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il vantaggio principale dei cuscinetti di agar canalizzati è la loro capacità di mantenere l'orientamento degli animali per l'imaging. I canali si adattano agli animali adulti, consentendo una rotazione controllata che viene mantenuta all'introduzione del vetrino. Abbiamo ripreso con successo animali selvatici, rotolanti e tozzetti. Orientiamo correttamente gli animali utilizzando punti di riferimento anatomici, che consentono l'imaging e il confronto di più strutture in un unico campo visivo e avvicinano le cellule bersaglio alla superficie. In particolare, questa rotazione facilita la visualizzazione nella dorsale o nella ventrale (viste bilaterali), che consentono il confronto del lato sinistro e destro dell'animale.

In precedenza, la visualizzazione e il confronto di queste strutture bilaterali richiedevano z-stack 3D e una potenziale normalizzazione dei segnali per tenere conto della ridotta trasmissione a profondità maggiori. Pertanto, l'orientamento definito consentito dall'agar canalizzato consente un imaging più coerente su più vermi e dovrebbe consentire misurazioni migliori. Ciò è particolarmente utile per la valutazione postoperatoria delle fibre neuronali rigenerate, che possono crescere in direzioni difficili da visualizzare, come la circonferenza².

Inoltre, l'agar canalizzato riduce lo stress sugli animali perché sono posti in una depressione che allevia la pressione del vetrino e promuove la normale fisiologia⁵. Mentre le deformazioni flaccide possono torcersi durante il montaggio, i canali incoraggiano una configurazione lineare dell'animale e la rotazione dell'intero animale. In un'implementazione diversa, il patterning può anche limitare il movimento dell'animale per ridurre la quantità di anestetico necessaria per l'imaging o l'osservazione dell'animale⁸.

Infine, anche la tecnica dell'agar canalizzato è altamente accessibile. Dopo la fabbricazione dello stampo, la creazione di tamponi di agar canalizzati richiede all'incirca la stessa quantità di tempo, esperienza e costi della realizzazione di normali tamponi di agar piatti. Tutti i componenti necessari per creare lo stampo PDMS sono comuni a molti laboratori accademici o acquistati online. La durata degli stampi PDMS li rende un'opzione conveniente per i laboratori, in grado di resistere a un uso prolungato nel tempo. Gli stampi PDMS possono durare per anni e centinaia di utilizzi. Continuiamo a utilizzare uno stampo di 17 anni con degradazione moderata. Si consiglia di conservare gli stampi a temperatura ambiente in un contenitore per mantenerli privi di detriti, che possono essere lavati via con acqua deionizzata se necessario.

Nonostante questi vantaggi, ci sono diverse limitazioni associate alla nostra tecnica. La forza del plettro utilizzato per posizionare gli animali sul pad può deformare i canali, influenzando potenzialmente il posizionamento dell'animale. Come per qualsiasi manipolazione fine, il posizionamento e la rotazione dell'animale nell'orientamento desiderato possono richiedere molto tempo, il che aumenta l'esposizione dell'animale all'anestetico e potenzialmente induce stress. I canali possono anche intrappolare l'aria e formare bolle durante il posizionamento del vetrino coprioggetti, che possono interferire con la nitidezza dell'imaging diffondendo la luce. Discutiamo i modi per ridurre al minimo le bolle nel protocollo. La nostra esperienza indica che la maggior parte degli svantaggi dell'agar canalizzato sono in gran parte evitati con un minimo di allenamento e pratica.

Le direzioni future per l'ottimizzazione di questi canali includono lo sviluppo di progetti su misura per specifiche esigenze sperimentali, tra cui dimensioni e forme diverse per diverse età e fenotipi di C. elegans. La fabbricazione di canali di dimensioni personalizzate mediante nanofabbricazione¹⁰ può ridurre l'impatto fisiologico sugli animali rispetto ai canali generici⁵. In conclusione, l'implementazione di cuscinetti di agar canalizzati consente l'imaging ad alta risoluzione di strutture oscure negli animali più anziani. Questi cuscinetti mantengono l'orientamento di C. elegans, portando a una migliore qualità dell'imaging e a una visualizzazione dettagliata, riducendo al contempo lo stress sugli animali grazie alla struttura di supporto dei canali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
125 mL Erlenmeyer pallone	Corning	4980-125
33 1/2 RPM o 12 pollici di riproduzione lunga (LP) disco in vinile.	N/A	N/A	Profondità del singolo canale: 50 µ m, larghezza: 200 µ m
30 mL siringa di plastica	Fisher Scientific	50-793-817
90% platino, 10% filo di iridio	Tritech Research	PT-9010	utilizzato per creare
un foglio di alluminio	Amazon	N / A
Cloruro di calcio	Fisher Scientific	AAL131910B
lastra di vetro	N / A	N / A	7 in x 5 in lastra di vetro prelevata dal telaio
pipetta in vetro	Fisher Scientific	13-678-20A	utilizzata per creare
la piastra calda per platino	Thermofisher	SP88857104
Solfato di magnesio	Fisher Scientific	AA3333736
vetrini per microscopio	Mckesson	938360
agar di grado di biologia molecolare	Benchmark Scientific	A1705
Fosfato di potassio bibasico	Fisher Scientific	P290-500
Fosfato di potassio monobasico	Fisher Scientific	P285-500
Azoturo di sodio	Fisher Scientific	AAJ2161022
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	BP358-212
di copertura quadrato	Fisher Scientific	12-541-016
SYLCAP 284-F (Fast Cure) Kit incapsulante in elastomero siliconico, trasparente, otticamente trasparente, miscela 10:1, 500 gm/ml (0,5 kg), più veloce di Sylgard 184 e simili	Essiccatore sottovuoto MicroLubrol	N/A
	Fisher Scientific	08-648-100
piatto di pesata	Fisher Scientifico	01-549-750

platino. vetro