Questo rapporto descrive un metodo per misurare il tempo di abbattimento della Drosophila melanogaster adulta utilizzando un monitor di attività della Drosophila (DAM2) in risposta a un fattore di stress del calore di conduzione dell'aria all'interno di una camera dell'incubatrice. Il DAM2 misura l'attività registrando i movimenti delle singole mosche mentre attraversano un raggio infrarosso. L'analisi dei dati è facilitata da un nuovo file eseguibile creato dagli autori.
Articolo metodologico
Saggi di tolleranza al calore con il sistema di monitoraggio dell'attività della Drosophila : una guida a un'applicazione eseguibile per l'analisi dei dati
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio della tolleranza al calore in Drosophila melanogaster è stato di particolare interesse per i ricercatori per decenni, con un approccio comune alla valutazione della tolleranza al calore che consiste nel monitorare il tempo di abbattimento (TKD) dopo l'esposizione a una temperatura elevata. Classicamente, le mosche sono alloggiate in fiale individuali e poste all'interno di un bagno d'acqua riscaldato. La TKD viene quindi monitorata manualmente dai ricercatori. Sebbene molto ben consolidati, permangono problemi di soggettività e di applicazione coerente di una definizione tangibile di cessazione di tutti i movimenti, compresi gli spasmi muscolari, quando si implementano questi test manuali. Abbiamo sviluppato un metodo ad alta produttività per automatizzare i saggi di tolleranza al calore utilizzando i monitor di attività della Drosophila TriKinetics (DAM2). Per accompagnare il sistema DAM2, abbiamo scritto un programma e creato un eseguibile di facile utilizzo per leggere automaticamente l'ultimo tempo di movimento dai dati di attività generati. Questo script scrive quindi in un file .csv il tempo di paralisi termica (TKD) per ogni mosca. I nostri dati mostrano che questo metodo DAM2 automatizzato è coerente e affidabile. Nel frattempo, i profili attività creati dai dati del conteggio delle attività sono interessanti. Questi profili di attività possono essere compilati e hanno il potenziale per espandere i saggi di tolleranza al calore per includere le componenti comportamentali relativamente non studiate della tolleranza al calore. Questo protocollo descriverà in dettaglio come utilizzare il sistema DAM2 e l'HoTDAM! software per stimare la tolleranza al calore in D. melanogaster.
Introduzione
Gli ectotermi rispondono tipicamente allo stress da calore con un aumento dell'attività locomotoria. Questo fenomeno è stato evidente ai ricercatori per decenni, con la caratteristica risposta comportamentale descritta da Cowles e Bogert nel 19441. Hanno descritto come un organismo sotto stress termico mostrerà per la prima volta un aumento del movimento locomotore. Con l'aumentare dello stress da calore, brevi esplosioni di attività sono intervallate da periodi di inattività. La temperatura alla quale l'organismo non può più mostrare un movimento coordinato è il massimo termico critico (CTmax). Seguono spammi muscolari e alla fine l'organismo collassa 1,2. Questo collasso è difficile da definire e rappresenta qualcosa di simile a "rigore da calore, coma o morte"2. Qui useremo il termine collasso fisiologico per riferirci teoricamente a questo punto finale sfocato dello stress da calore.
La Drosophila melanogaster e altri piccoli insetti sono stati modelli preziosi per studiare lo stress da calore. Per stimare almeno una parte della complessa collezione di tratti che costituiscono la tolleranza al calore, molti ricercatori hanno osservato manualmente il tempo e la temperatura alla quale si verifica il collasso fisiologico, che rappresentano rispettivamente il tempo di abbattimento (TKD) e CTmax. Sebbene molto consolidati, questi metodi di analisi manuale presentano alcuni inconvenienti. Una definizione operativa di collasso fisiologico può essere difficile da stabilire e applicare in modo appropriato a tutti i casi, soprattutto quando gli osservatori sono meno esperti. Ad esempio, a che punto l'organismo passa dagli spasmi muscolari al collasso? Il modello di spasmi muscolari e l'attività convulsiva prima del collasso possono essere imprevedibili e possono complicare l'osservazione accurata 2,3, minacciando l'accuratezza e la precisione. Nel frattempo, la difficoltà nell'osservazione limita anche il numero di organismi che possono essere analizzati contemporaneamente, limitando la scalabilità.
Poiché un aumento dell'attività è una risposta costante al calore e TKD e CTmax sono in definitiva il punto in cui l'attività cessa, abbiamo cercato di utilizzare i monitor di attività Drosophila (DAM2) di TriKinetics per automatizzare i saggi di tolleranza al calore. Di recente abbiamo pubblicato un metodo per un test automatizzato, insieme a un software di facile utilizzo, utilizzando il sistema DAM24. Il test è stato convalidato confrontando le misure di tolleranza al calore in termini di TKD con un classico test TKD manuale basato sull'osservazione in base a diversi fattori. Abbiamo anche esplorato la componente dell'attività locomotoria dei saggi TKD per caratterizzare ulteriormente il fenotipo di termotolleranza inducibile. Abbiamo chiamato il test e il software di accompagnamento HoTDAM! (Saggi di tolleranza al calore utilizzando il sistema di monitoraggio dell'attività della Drosophila). Qui forniamo una descrizione dettagliata del metodo di analisi automatizzato della tolleranza al calore utilizzando il sistema DAM2 e l'HoTDAM! software. Il test è facile da usare ed è facilmente scalabile per consentire la misurazione di più organismi contemporaneamente.
In questo manoscritto, abbiamo eseguito saggi TKD su mosche mutanti termosensoriali (potenziale recettore transitorio ankyrin 1; TRPA1) e i loro controlli genetici (bianco1118; w1118). Questi organismi sono stati scelti per sottolineare l'importanza dell'aumento dell'attività caratteristico osservato durante lo stress da calore per il saggio. Vale a dire, gli organismi TRPA1 non mostrano questo comportamento di fuga, illustrando la connessione intrinseca tra le risposte comportamentali conservate e le stime della tolleranza al calore, come la TKD. Abbiamo eseguito il test sia per le femmine che per i maschi, oltre a implementare un pretrattamento termoindurente. I risultati rappresentativi qui presentati sono dati provenienti da saggi completamente nuovi rispetto a quelli utilizzati nei saggi di convalida originali pubblicati in precedenza.
Protocollo
1. Allevamento di mosche
- Scegli il ceppo o la lenza appropriata per l'indagine.
NOTA: Per illustrare il test, abbiamo utilizzato il ceppo TRPA1 knockout del potenziale recettoriale transitorio e il suo controllo genetico, il ceppo w1118 . - Mantenere gli stock di mosche in condizioni costanti, a seconda dei casi. Per seguire questo protocollo, allestire le scorte a 25 °C in un ciclo diurno 12:12 su alimenti standard (farina di mais, melassa e lievito di torula).
- Separare maschi e femmine con una leggera anestesia.
NOTA: A seconda dell'esperimento, potrebbero essere utilizzate mosche vergini o accoppiate.- Lasciare che i maschi e le femmine adulti (separatamente per entrambi gli stock) si accoppino e depongano le uova per 5 giorni. Togliete gli adulti dalle bottiglie.
- Quando gli adulti iniziano a chiudersi diversi giorni dopo, svuota di nuovo le bottiglie. Dopo 2 giorni, separare i maschi e le femmine utilizzando una leggera anestesia eterea e lasciarli maturare separatamente a una densità di 25 mosche per fiala.
2. Pretrattamento
- Applicare il pretrattamento o la variabile indipendente che definirà i gruppi sperimentali (genetici, ambientali, farmacologici o altro).
- Per seguire questo protocollo, separare gli adulti per sesso e, dopo 5 giorni, pretrattare metà degli adulti immergendo una fiala sigillata contenente gli organismi in un bagno d'acqua a 37 °C per 1 ora. Mantenere i comandi nell'incubatrice a 25 °C. Lasciare che le mosche si riprendano per 24 ore dopo il pretrattamento, prima del saggio di tolleranza al calore.
3. Configurazione del sistema DAM2
- Caricare le mosche nei tubi del monitor DAM2 e tappare i tubi su entrambe le estremità con del cotone. Se le mosche devono essere valutate immediatamente per la tolleranza al calore, non utilizzare alcun anestesia durante il caricamento degli organismi nei tubi del monitor per evitare potenziali effetti confondenti associati all'esposizione all'anestesia. Invece, aspirare i singoli moscerini dalle fiale di contenimento nei tubi del monitor.
- Inserire le provette nei monitor di attività, prendendo nota dei numeri di slot in cui vengono caricati i diversi gruppi.
NOTA: Questi possono essere randomizzati a seconda dell'esperimento se la posizione all'interno del monitor può essere considerata una variabile confondente. - Software di acquisizione dati DAM2
NOTA: Il sistema e il software DAM2 sono descritti in modo approfondito nella scheda tecnica del software DAMSystem3 disponibile sul sito web dell'azienda (vedere la tabella dei materiali). Fare riferimento alle istruzioni DAM2 per la risoluzione dei problemi specifica e le funzionalità generali. Qui forniamo una guida per l'utilizzo del sistema nel contesto del nostro test di tolleranza al calore.- Il sistema DAM2 monitora il numero di volte in cui una singola mosca all'interno di ciascun tubo rompe un raggio infrarosso. Il software di acquisizione dati indicizza e reimposta quindi questo conteggio ogni intervallo di tempo definito. In Preferenze, selezionare l'intervallo di lettura da utilizzare nel test. Abbiamo trovato un intervallo di lettura di 15 s per ottenere un buon equilibrio tra risoluzione ed errori di lettura.
NOTA: Si raccomanda che l'intervallo di lettura non sia inferiore in secondi al numero di monitor utilizzati. Un intervallo di lettura più breve darà una migliore risoluzione temporale al saggio, ma aumenterà anche potenzialmente i casi di errori di lettura. Il software può rimanere indietro durante il tentativo di indicizzare le letture. Inoltre, un computer più recente e più veloce fa molto per prevenire gli errori di lettura. - Durante la valutazione degli errori di lettura, assicurarsi che il computer utilizzato per eseguire il software di acquisizione dati DAM2 sia impostato su non dormire mai o ibernarsi per non interrompere il test. Inoltre, assicurarsi che gli aggiornamenti automatici (inclusi eventuali aggiornamenti di rete controllati dall'istituto) siano disattivati durante la raccolta dei dati.
- Verificare che tutti i monitor siano collegati e comunichino con il software. Verificare che lo stato di ciascun monitor sia verde nella scheda dei dati correnti .
NOTA: Vedere la scheda tecnica del software DAMSystem3 per i dettagli sui problemi a cui si riferiscono i diversi codici colore. - Il software di acquisizione dati scriverà automaticamente i conteggi delle attività nei file di testo nella cartella Dati all'interno dei file di sistema. Per semplificare l'analisi dei dati, eliminare tutti i file di testo all'interno di questa cartella Dati prima di avviare il software di acquisizione dati per qualsiasi test.
NOTA: I file di testo verranno popolati automaticamente, quindi è consentito rimuoverli da questa cartella per cancellare i vecchi dati senza ostacolare il programma.
- Il sistema DAM2 monitora il numero di volte in cui una singola mosca all'interno di ciascun tubo rompe un raggio infrarosso. Il software di acquisizione dati indicizza e reimposta quindi questo conteggio ogni intervallo di tempo definito. In Preferenze, selezionare l'intervallo di lettura da utilizzare nel test. Abbiamo trovato un intervallo di lettura di 15 s per ottenere un buon equilibrio tra risoluzione ed errori di lettura.
4. Saggio di tolleranza al calore
- Caricare i monitor nell'incubatore per saggi.
- Avviare il software di acquisizione e lasciare che il software indicizzi per un periodo di tempo definito (ad esempio, 40 indici o 10 min se l'intervallo di lettura è impostato su 15 s) prima di applicare lo stress termico.
NOTA: Ciò consente una certa acclimatazione ai tubi e il recupero dal movimento dei monitor durante l'installazione. Soprattutto se l'attività durante il test viene analizzata, questo tempo di acclimatazione stabilirà un'attività di base prima dell'induzione dello stress termico. A seconda della natura specifica del test da eseguire, questa fase di acclimatazione potrebbe essere saltata, con i monitor posizionati direttamente nell'incubatore già alla temperatura di stress. - Se si esegue un test statico (TKD), impostare l'incubatore in modo che raggiunga il più rapidamente possibile la temperatura nociva impostata dopo il periodo di acclimatazione. La variabile di risposta sarà operazionalizzata come l'ultimo tempo di movimento registrato (cioè l'ultimo indice diverso da zero) per stimare il TKD.
- Se si esegue un test dinamico, determinare la velocità con cui la temperatura aumenterà dopo il periodo di acclimatazione. In questo caso, la variabile di risposta misurata è tecnicamente di nuovo il tempo. L'ora in cui viene registrato l'ultimo movimento coinciderà con una temperatura (CTmax), a seconda della velocità di rampa.
- Monitora i conteggi delle attività in tempo reale sul display del sistema DAM nel software di acquisizione o esamina direttamente i file di testo nella cartella dei dati nei file di programma DAMSystem3. Copia i file di testo e apri la copia anziché il file originale all'interno della cartella dei dati per evitare di causare problemi con la registrazione dei dati in tempo reale.
- Dopo che non si vede alcun movimento in nessuna delle mosche per diversi minuti, arrestare il software di acquisizione.
NOTA: Con i nostri test, abbiamo scoperto che da pochi a diversi minuti di inattività sono indicativi di un collasso fisiologico dovuto a stress termico simile a quello osservato nei classici test TKD manuali. Questo, tuttavia, dipende dal comportamento di fuga spontanea. Pertanto, considerare le possibili variabili confondenti se il trattamento specifico nell'indagine potrebbe alterare questa risposta comportamentale. Inoltre, a seconda dei parametri specifici del test (ad esempio, temperatura, trattamento), la lunghezza del test varierà ovviamente.
5. Organizzazione e analisi dei dati
NOTA: vedere il video supplementare S1 per una procedura dettagliata su come scaricare l'applicazione eseguibile da GitHub, nonché le funzionalità di base del software.
- Una volta acquisiti i dati, eseguire la scansione dei file di testo alla ricerca di errori utilizzando il software di riferimento (vedere la Tabella dei materiali) e selezionare i punti di inizio e fine specifici per i dati dell'attività di binning. Se è stato implementato un intervallo di acclimatazione di 10 minuti, avviare il binning 10 minuti nella registrazione dell'attività. Per ulteriori dettagli sul binning, vedere la discussione.
- Apri il file HoTDAM! software di analisi e importare i file di dati del monitor scansionato facendo clic su File | carica dati del monitor.
NOTA: Il software e l'applicazione eseguibile sono disponibili da GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) o dal sito web dell'azienda all'interno della sezione Software di analisi . Si noti che l'applicazione eseguibile è compatibile solo con i sistemi operativi Windows in questo momento. - Aggiungere le designazioni dei gruppi per indicare quali gruppi di trattamento corrispondono a quale cella all'interno dei monitor DAM2.
NOTA: Il layout dell'interfaccia software corrisponde al layout dei monitor. - Fare clic su Avvia definizione multigruppo per visualizzare una finestra di dialogo in cui aggiungere una designazione di gruppo che verrà applicata a più celle. Una volta accettata la designazione del gruppo, fare clic sulle celle per applicare la designazione del gruppo, quindi fare clic su Interrompi designazione multigruppo.
NOTA: Il software organizza ed esporta i dati DAMSystem3 in file .csv da analizzare nel software di statistica. - Esportare il TKD (ovvero l'ultimo indice diverso da zero) per ogni mosca all'interno dei monitor in un file .csv facendo clic su File | Esportazione dei dati di abbattimento | Esporta tutti i monitor o esporta i monitor selezionati. Il TKD per ogni mosca sarà organizzato nell'output per designazione del gruppo.
- Esporta i dati dell'attività per ogni mosca facendo clic su File | Esportazione dei dati delle attività | Esporta tutti i monitoraggi o esporta i monitoraggi selezionati in un file .csv, mantenendo solo i dati di timestamp e conteggio, semplificando l'utilizzo del file di dati e assegnando anche etichette di gruppo designate per ogni volo.
NOTA: Le prime colonne dei file di dati DAMSystem3 corrispondono ai dati interni dei monitor (ad esempio, monitoraggio della luce o messaggi di errore) durante l'acquisizione. I dati di conteggio si trovano nelle colonne 11-42 (vedere la scheda tecnica di DamSystem3 per i dettagli). L'esportazione dei dati dell'attività con il software di analisi rimuoverà tutte le colonne tranne il timestamp e le colonne dei dati di conteggio. - Se si esegue un esperimento CTmax, utilizzare il TKD per determinare il CTmax utilizzando la velocità di rampa della temperatura.
NOTA: Il software di analisi è stato scritto in modo orientato agli oggetti in C# (codice sorgente disponibile su GitHub; https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) in modo che gli aspetti del programma possano essere facilmente modificati per consentire la personalizzazione per soddisfare scopi specifici.
6. Statistiche
NOTA: È possibile utilizzare molti test diversi per analizzare i dati TKD, a seconda delle specifiche della configurazione sperimentale.
- Utilizzare l'analisi della sopravvivenza (ad esempio, regressione di Cox, Kaplan-Meier) per concettualizzare l'abbattimento come un evento che ogni mosca all'interno del test sperimenterà.
NOTA: Per una revisione dettagliata, vedere la serie di 4 articoli di Bradburn e Clark che discutono l'analisi della sopravvivenza e la sua attuazione 5,6,7,8. - Utilizza l'ANOVA per valutare le differenze di gruppo e confrontare le modalità, soprattutto quando si convalida il test automatizzato per condizioni specifiche.
- Analizza i dati TKD utilizzando l'analisi di sopravvivenza Kaplan-Meier. Dividi il file per stock in modo che l'analisi venga eseguita separatamente (ad esempio, per le linee di stock TRPA1 e w1118 ). Scegli la variabile tempo come TKD (in min), knockdown come evento, pretrattamento come fattore e sesso come strati.
- Eseguire i test log-rank, Breslow e Tarone-Ware per confrontare il pretrattamento per ogni strato (cioè il sesso), a scopo illustrativo mostrando diversi metodi.
- Costruisci trame di sopravvivenza.
Risultati
Le analisi per gli stock di TRPA1 e w1118 sono state eseguite separatamente. I tempi percentili TKD e altri elementi descrittivi sono riportati nella Tabella 1.
| Percentilia | ||||||||
| Sesso | Trattamento | 25.00% | 50.00% | 75.00% | ||||
| N | Valutare | Errore standard | Valutare | Errore standard | Valutare | Errore standard | ||
| W1118 | ||||||||
| Femmina | Controllo | 16 | 42.50 | 0.43 | 40.75 | 2.00 | 38.75 | 0.43 |
| Temprato | 16 | 48.75 | 4.55 | 43.25 | 2.50 | 38.50 | 1.95 | |
| Maschio | Controllo | 16 | 43.25 | 1.88 | 39.75 | 0.25 | 37.00 | 2.38 |
| Temprato | 16 | 46.50 | 5.63 | 35.50 | 2.00 | 30.75 | 3.03 | |
| TRPA1 | ||||||||
| Femmina | Controllo | 16 | 34.25 | 2.17 | 29.25 | 7.50 | 21.50 | 0.72 |
| Temprato | 15 | 37.25 | 4.84 | 28.75 | 1.77 | 25.75 | 0.86 | |
| Maschio | Controllo | 15 | 38.25 | 3.29 | 32.00 | 1.29 | 24.50 | 7.92 |
| Temprato | 16 | 27.50 | 0.72 | 25.75 | 1.00 | 22.75 | 6.06 | |
Tabella 1: Statistiche descrittive per le analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier delle mosche w1118 e TRPA1 . I valori percentili TKD sono espressi in minuti. Indurito si riferisce a un pretrattamento a 37 °C seguito da un recupero di 24 ore prima dello shock termico a 39 °C. I controlli sono stati mantenuti a 25 °C per tutta la durata del pretrattamento. NOTA: Nelle analisi di sopravvivenza, il 75° percentile è l'ultimo momento in cui il 75% del campione continua a mostrare attività.
Per le mosche w1118, il test log-rank ha rilevato una differenza significativa nella probabilità di knockdown tra le femmine indurite e quelle di controllo (p = 0,026), in modo tale che le femmine indurite avevano una minore probabilità di essere abbattute dal fattore di stress termico nel corso del test. Nel frattempo, i test log-rank non hanno riscontrato differenze significative nella probabilità di knockdown tra maschi induriti e di controllo w1118 (p = 0,798). Per le femmine di TRPA1 , non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nella probabilità di knockdown tra organismi induriti e di controllo (p = 0,547) utilizzando il test del rango logaritmico. Infine, per i maschi TRPA1 , il test log-rank ha trovato una differenza significativa nella probabilità di knockdown tra organismi induriti e di controllo (p = 0,014), tale che gli organismi di controllo avevano una minore probabilità di essere abbattuti dal fattore di stress termico. Vedere la Tabella 2 per tutti i risultati delle analisi di sopravvivenza (compresi i test generalizzati di Wilcoxon e Tarone-Ware) e la Figura 1 per le curve di sopravvivenza.
| Sesso | χ2 | Df | Valore p | |
| W1118 | ||||
| Femmina | Rango del registro (Mantel-Cox) | 4.96 | 1 | 0.026 |
| Breslow (Wilcoxon generalizzato) | 1.72 | 1 | 0.190 | |
| Tarone-Ceramica | 3.07 | 1 | 0.080 | |
| Maschio | Rango del registro (Mantel-Cox) | 0.07 | 1 | 0.798 |
| Breslow (Wilcoxon generalizzato) | 0.86 | 1 | 0.353 | |
| Tarone-Ceramica | 0.32 | 1 | 0.572 | |
| TRPA1 | ||||
| Femmina | Rango del registro (Mantel-Cox) | 0.36 | 1 | 0.547 |
| Breslow (Wilcoxon generalizzato) | 0.45 | 1 | 0.503 | |
| Tarone-Ceramica | 0.36 | 1 | 0.549 | |
| Maschio | Rango del registro (Mantel-Cox) | 6.01 | 1 | 0.014 |
| Breslow (Wilcoxon generalizzato) | 4.19 | 1 | 0.041 | |
| Tarone-Ceramica | 5.20 | 1 | 0.023 |
Tabella 2: Test di significatività che confronta la probabilità di rimanere attivi tra i moscerini femmina e maschio w1118 pretrattati e quelli di controllo e TRPA1 . Indurito si riferisce a un pretrattamento a 37 °C seguito da un recupero di 24 ore prima dello shock termico a 39 °C. Gli organismi di controllo sono stati mantenuti a 25 °C per tutta la durata del pretrattamento.
Figura 1: Curve di sopravvivenza che illustrano la proporzione di organismi con attività residua nel corso del test TKD per le mosche w1118 e TRPA1 . Indurito si riferisce a un pretrattamento a 37 °C seguito da un recupero di 24 ore prima dello shock termico a 39 °C. Gli organismi di controllo sono stati mantenuti a 25 °C per tutta la durata del pretrattamento. Il TKD è in pochi minuti dall'introduzione del fattore di stress termico a 39 °C. Abbreviazioni: TKD = tempo di abbattimento; TRPA1 = potenziale recettoriale transitorio ankirina 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'attività media tracciata in funzione del tempo può essere vista nella Figura 2 per i maschi e le femmine di TRPA1 e w1118 induriti e di controllo.
Figura 2: Attività media rispetto al tempo per le mosche w1118 e TRPA1 per la durata del test TKD. Abbreviazioni: TKD = tempo di abbattimento; TRPA1 = potenziale recettoriale transitorio ankirina 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Ci sono probabilmente innumerevoli e nuovi modi per analizzare i dati dell'attività, specialmente quando si considerano gli effetti di gruppo e si incorporano la TKD. Poiché l'analisi dell'attività durante la tolleranza al calore è relativamente poco studiata, non abbiamo esplorato approcci statistici potenzialmente nuovi per analizzare i dati di attività. Tali test statistici giustificherebbero una revisione e una discussione della letteratura molto più ampia di quanto sia appropriato in questa sede. Invece, abbiamo semplicemente rappresentato graficamente l'attività media per ciascun gruppo (pretrattamento o controllo) rispetto al tempo, perché abbiamo precedentemente pubblicato questo metodo per illustrare l'attività con un'appropriata revisione della letteratura.
Video supplementare S1: procedura dettagliata per il download dell'applicazione eseguibile da GitHub e funzionalità di base del software. La versione più recente (al momento compatibile solo con Windows) è disponibile su GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) di riferimento o tramite un collegamento indicizzato nella sezione Software di analisi del sito Web dell'azienda. Una volta scaricata la versione, i file dovranno essere estratti e il file HoTDAM! l'applicazione può essere aperta. Il software antivirus potrebbe impedire l'esecuzione dell'applicazione; Potrebbe essere necessario concedere autorizzazioni all'applicazione. Una volta che l'interfaccia è in esecuzione, è possibile caricare il DAM2 (File Scan Software) scansionato (File | Carica dati di monitoraggio). L'interfaccia di designazione del gruppo rappresenta il layout del monitor dell'attività e consente all'utente di designare i gruppi di trattamento in tubi singolarmente uno alla volta o più di uno contemporaneamente con la funzione di definizione del gruppo a selezione multipla . Tutti i monitoraggi si escludono a vicenda per quanto riguarda la funzionalità di designazione del gruppo e devono essere definiti separatamente. I dati TKD e attività possono quindi essere esportati in file .csv (File | Esportazione di dati o file di knockdown | Esporta dati attività) per un monitor selezionato singolarmente o per tutti i monitor contemporaneamente. Se tutti i monitor vengono esportati contemporaneamente, i dati TKD o di attività verranno esportati in un singolo file .csv, ma i dati per ciascun monitor verranno separati all'interno del file. I file TKD esportati raggrupperanno le mosche in gruppi che visualizzano l'indice dell'ultima attività diverso da zero per ogni tubo. I file di attività manterranno tutte le provette separate, ma assoceranno le designazioni dei gruppi e rimuoveranno tutte le informazioni dai file, ad eccezione dei dati di timestamp e conteggio per ciascuna provetta. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussione
Il metodo di saggio della tolleranza al calore che descriviamo qui è versatile e scalabile. In precedenza abbiamo pubblicato uno studio di convalida in cui abbiamo confrontato l'HoTDAM! metodo a un classico test TKD basato sull'osservazione e ha riscontrato che il test automatizzato mostra la stessa tendenza generale in diversi fattori4 (Figura 3). In altre parole, allo stesso modo del classico test TKD manuale, il test automatizzato DAM2 è stato in grado di differenziare gli organismi in base al sesso, alla temperatura del test, al pretrattamento di indurimento e al tempo di recupero dopo il pretrattamento di indurimento prima del test. Mentre si presume che il test automatizzato sia più oggettivo in quanto la TKD non si basa sull'osservazione del ricercatore, i nostri dati non suggerirebbero che questo renda il test DAM2 notevolmente superiore al test manuale in termini di scoperta di un effetto. Abbiamo riscontrato che i saggi sono abbastanza simili in termini di precisione e, se non altro, le dimensioni dell'effetto all'interno del saggio automatizzato sono leggermente più piccole (vedi materiale supplementare di Rokusek et al.4 per dati statistici descrittivi dettagliati e ANOVA sia per il DAM2 automatizzato che per i saggi manuali basati sull'osservazione dai nostri studi di convalida). La ragione di ciò ha probabilmente a che fare con la differenza intrinseca in ciò che i test misurano in termini di TKD, che viene discussa in dettaglio di seguito.
Figura 3: Confronto tra il test DAM2 automatizzato e un classico test TKD basato sull'osservazione. I grafici mostrano il TKD medio in minuti e le barre di errore sono l'errore standard della media. I fattori indipendenti confrontati sono (A) il sesso in base alla temperatura del saggio, (B) l'indurimento in base alla temperatura del saggio, (C) il sesso in base al tempo di recupero, (D) l'indurimento in base al sesso, (E) la temperatura del saggio in base al tempo di recupero e (F) l'indurimento in base al tempo di recupero. La TKD assoluta tende ad essere più lunga nel test automatizzato, ma le tendenze generali tra i fattori sono coerenti tra i test. Questa cifra è stata presa da Rokusek et al. 4. Abbreviazione: TKD = tempo di abbattimento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
I dati illustrativi qui presentati rappresentano esperimenti completamente separati dalle nostre prove di verifica originali, che utilizzavano anche diverse linee di mosca. Il test (TKD e attività) è risultato sensibile agli effetti del pretrattamento di indurimento nel ceppo w1118 (abbiamo utilizzato un ceppo di tipo selvatico Canton S negli esperimenti originali) fornendo supporto al fatto che la funzionalità di base del test è stabile in condizioni variabili, anche se finora sono state testate solo poche linee. Il test è versatile in quanto non si limita alla misurazione della TKD. Poiché la TKD nel nostro test è definita come la cessazione dell'attività locomotoria, il CTmax può essere determinato se la velocità di rampa della temperatura è nota. Infine, il test è completamente automatizzato e può essere facilmente scalato aggiungendo più monitor di attività, consentendo di ottenere campioni di dimensioni molto più grandi di quanto sarebbe fattibile utilizzando un metodo di osservazione manuale.
Alcuni punti chiave da considerare durante l'esecuzione del saggio e dell'analisi sono i seguenti. Utilizzare un'incubatrice in grado di raggiungere rapidamente una temperatura impostata, in modo tale che i monitor possano essere caricati nell'incubatrice alla temperatura di allevamento e lasciati riposare silenziosamente per acclimatarsi al nuovo ambiente prima di applicare il fattore di stress termico. Se la temperatura aumenta troppo lentamente, il test inizia ad assomigliare più a un test CTmax dinamico che a un test TKD statico. Ad esempio, se il software è stato autorizzato a indicizzare 40x prima dell'induzione dello stress termico per stabilire una linea di base, il software può emettere il file di dati a partire dall'indice 40 per la determinazione del TKD e l'analisi dei dati. Il punto di partenza è in termini di timestamp registrato dal software, quindi fai attenzione all'intervallo di indice (ad esempio, 40 indici sono 10 minuti se l'intervallo di indice è 15 s).
Il software di scansione file può essere utilizzato anche per "raccogliere" gli indici e può sommare o calcolare la media dei conteggi. Ad esempio, quando abbiamo rappresentato graficamente i dati dell'attività (vedi sotto) abbiamo raggruppato ogni quattro indici sommando i conteggi (ad esempio, abbiamo esportato l'attività ogni minuto anziché ogni 15 secondi). Si noti che il software di scansione dei file non consentirà orari di avvio parziali di minuti durante il binning, in termini di timestamp. Ad esempio, se il primo indice è alle 12:10:15, con l'intervallo dell'indice impostato su 15 s, il binning a 1 minuto inizierà al minuto successivo più vicino (ad esempio, 12:11:00). Pertanto, se l'attività in incrementi di minuti verrà utilizzata per l'analisi ma si desidera la risoluzione di intervalli di 15 s per TKD, avviare il software di acquisizione entro 15 s dal minuto intero più vicino (ad esempio, dopo le 12:09:45 e prima delle 12:10:00). Questa complicazione è dovuta al fatto che il software di acquisizione dati utilizza l'orologio del sistema informatico come timestamp, poiché il DAMSystem3 è stato probabilmente costruito pensando agli studi sul sonno.
In termini di approcci statistici al confronto dei TKD, sosteniamo che l'analisi della sopravvivenza offre più informazioni rispetto al semplice confronto dei tempi di knockdown medi o mediani tra i gruppi. Le curve di sopravvivenza possono offrire una visione visiva del decorso temporale dell'abbattimento per le popolazioni durante il saggio. Allo stesso modo, i test statistici possono essere adattati alla domanda specifica posta all'interno dello studio. Ad esempio, i test di Wilcoxon generalizzati attribuiscono un peso maggiore agli eventi iniziali, mentre i test log-rank danno lo stesso peso a tutti i punti temporali e sono più sensibili alle differenze nei punti temporali successivi. Se i rapporti di rischio non sono proporzionali (cioè le curve di sopravvivenza si incrociano) la Tarone-Ware è più rigorosa. Dal momento che non ci dovrebbe essere alcuna censura dei dati poiché tutti gli organismi avranno sperimentato l'evento (knockdown), si potrebbe argomentare per l'uso di test di ordinamento dei ranghi non parametrici come Mann-Whitney U e Kruskal-Wallis insieme alle curve di sopravvivenza di Kapan-Meier9. Se un'indagine è interessata all'abbattimento dopo un determinato periodo di tempo piuttosto che alla TKD dopo che tutti gli organismi sono stati abbattuti, l'uso dell'analisi di sopravvivenza e dei test log-rank o generalizzati di Wilcoxon sarebbe robusto per i dati censurati (cioè, uno scenario in cui non tutti gli organismi avrebbero smesso di muoversi o collassato entro la fine del saggio). Abbiamo fornito i risultati del log-rank, del Wilcoxon generalizzato e del Tarone-Ware nella Tabella 2 per illustrare.
Durante lo stress da calore e prima della CTmax, le alterazioni comportamentali (ad esempio, il comportamento di fuga) fungono da meccanismi di coping. Queste strategie comportamentali innate sono conservate in tutto il regno animale, ma sono particolarmente importanti per gli ectotermi data la loro minore capacità di termoregolazione metabolica10,11. Chiaramente, il comportamento è un aspetto importante del fenotipo dello stress da calore ectotermico, ma una ricerca relativamente scarsa ha esaminato questi aspetti comportamentali della tolleranza al calore. Dato che il test che descriviamo si basa sull'aumento caratteristico dell'attività locomotoria in risposta allo stress termico, è adatto per esplorare gli aspetti locomotori delle risposte allo stress termico. Allo stesso tempo, questa dipendenza dall'attività spontanea porta con sé alcune limitazioni. È importante ricordare, soprattutto quando si esplorano i componenti delle risposte locomotorie allo stress termico, che sia la TKD che l'attività sono intrinsecamente correlate. Per dimostrare una situazione in cui questo sarebbe limitante per il nostro test, abbiamo fornito qui i dati di organismi TRPA1 che sono carenti di termosensazione. Quando gli organismi sono carenti per il recettore TRPA1, i moscerini non mostrano la caratteristica risposta locomotoria al calore12. Nei dati rappresentativi qui mostrati, la risposta all'attività negli organismi TRPA1 è attenuata. Le misurazioni della TKD non sarebbero facilmente paragonabili a quelle degli organismi selvatici poiché la misura rappresenta una diversa risposta locomotoria.
Anche la generalizzabilità e il confronto diretto dei risultati, in particolare con i classici saggi di tolleranza al calore, sono una potenziale limitazione (Figura 3). Spesso, i saggi basati sull'osservazione coinvolgono uno stimolo meccanico o di altro tipo per garantire che un organismo immobile stia effettivamente sperimentando un collasso fisiologico e non mostri semplicemente una mancanza di attività spontanea 3,13. Poiché il nostro test si basa sull'attività spontanea, esiste una differenza intrinseca nella definizione operativa di TKD che potrebbe complicare il confronto. In altre parole, abbiamo definito la TKD come la cessazione dell'attività locomotoria, mentre i saggi classici generalmente definiscono la TKD come collasso fisiologico. Inoltre, i saggi automatizzati come quello che descriviamo si basano sull'aria riscaldata, mentre i saggi manuali generalmente comportano un bagno d'acqua e, quindi, un trasferimento di calore più efficiente. Tutte queste limitazioni al confronto tra le modalità di analisi rappresentano aspetti negativi per la generalizzabilità del metodo automatizzato. Allo stesso tempo, è stato riportato che i metodi basati sull'osservazione soffrono di complicanze con confronti diretti tra le indaginie 2,14,15. Sosteniamo che, nonostante le limitazioni, i saggi automatizzati sono un mezzo praticabile per stimare la tolleranza al calore in termini di TKD o CTmax.
Altri saggi automatizzati di tolleranza al calore per TKD e CTmax sono stati implementati e descritti in precedenza in letteratura 16,17,18,19, con alcuni che utilizzano i monitor di attività DAM218,19. Inoltre, almeno alcune indagini hanno utilizzato metodi basati su video 16,20,21, nonché i monitor di attività DAM2 20, per esaminare i profili di attività del moscerino della frutta in relazione alla tolleranza al calore nel contesto di stress da calore acuto. Pertanto, l'automazione dei saggi di tolleranza al calore, anche con il sistema DAM2, non è un'idea nuova. Ciò che è nuovo e di valore nel nostro test è la facilità di gestione dei dati, facilitata dal metodo HoTDAM! (di analisi). I dati delle attività sono difficili da lavorare e può essere dispendioso in termini di tempo e ingombrante estrarre anche le misure più semplici (ad esempio, TKD) da set di dati di grandi dimensioni senza l'uso di software o script che devono essere personalizzati per ogni scenario. HoTDAM! è gratuito e disponibile come applicazione eseguibile completamente funzionale con un'interfaccia semplice e facile da usare. Non è necessaria alcuna esperienza precedente nella programmazione. Inoltre, il software è stato scritto in modo orientato agli oggetti con documentazione per facilitare la modifica. Pertanto, HoTDAM! Può essere facilmente personalizzato per soddisfare esigenze specifiche. Il codice sorgente è disponibile insieme all'applicazione eseguibile. La nostra speranza è che HoTDAM! può servire i laboratori che non conoscono i saggi di tolleranza al calore offrendo un mezzo semplice per misurare TKD e CTmax, oltre a servire i laboratori esperti con i saggi di tolleranza al calore offrendo un software personalizzabile per facilitare la gestione dei dati.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il progetto descritto è stato sostenuto da sovvenzioni Institutional Development Award (IDeA) dell'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali del National Institutes of Health (5P20GM103427 e 1U54GM115458). Il programma UNK Undergraduate Research Fellows e il programma di ricerca estiva per studenti di medicina UNMC.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette in polistirene da 14 ml | Falcon | 352057 | |
| Acquario da 30 galloni | Wal-mart | ||
| Bottiglie da 8 once | Genesee | 32-129F | |
| Camera climatica costante | Memmert | HPP750eco | |
| farina di mais | Lab Scientific | FLY801010 | |
| DAM2 Monitor di attività Drosophila | TriKinetics | DAM2 | (Scheda tecnica DAMSystem3) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| Software di acquisizione dati DAMSystem | gratuito | di | |
| Drosophila agar | Lab Scientific | FLY80201 | |
| etanolo | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Ether | Fisher Scientific | E134-4 | |
| Software FileScan | TriKinetics | per la scansione di errori di testo, dati di binning e output | |
| Trikinetics | https://github.com/MatthewR47/HoTDAM | ||
| Riscaldatore a circolazione ad immersione | PolyScience | MX-CA11B | |
| melassa | Lab Scientific | FLY80084 | |
| acido propionico | Fisher Scientific | A258-500 | |
| Pyrex Tubi di vetro 5 x 65 mm per DAM2 | TriKinetics | PGT 5x65 | https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| piccolo pennello | Wal-mart | ||
| SPSS Statistics | IBM | ||
| tegosept | Lab Scientific | FLY55015 | |
| lievito di torula | MP Biomedicals | 290308505 | |
| TRPA1 mutante stock | Bloomington Stock center | 26504 | w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1] |
| w1118 stock | Bloomington Stock center | 3605 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
