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Articolo metodologico

Saggi di tolleranza al calore con il sistema di monitoraggio dell'attività della Drosophila : una guida a un'applicazione eseguibile per l'analisi dei dati

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DOI:

10.3791/67814

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13 dicembre 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Nebraska at Kearney, 2School of Computing, University of Nebraska-Lincoln, 3Department of Psychology, University of Nebraska at Kearney, 4School of Biological Sciences, University of Nebraska-Lincoln

In questo articolo

Sommario

Questo rapporto descrive un metodo per misurare il tempo di abbattimento della Drosophila melanogaster adulta utilizzando un monitor di attività della Drosophila (DAM2) in risposta a un fattore di stress del calore di conduzione dell'aria all'interno di una camera dell'incubatrice. Il DAM2 misura l'attività registrando i movimenti delle singole mosche mentre attraversano un raggio infrarosso. L'analisi dei dati è facilitata da un nuovo file eseguibile creato dagli autori.

Abstract

Lo studio della tolleranza al calore in Drosophila melanogaster è stato di particolare interesse per i ricercatori per decenni, con un approccio comune alla valutazione della tolleranza al calore che consiste nel monitorare il tempo di abbattimento (TKD) dopo l'esposizione a una temperatura elevata. Classicamente, le mosche sono alloggiate in fiale individuali e poste all'interno di un bagno d'acqua riscaldato. La TKD viene quindi monitorata manualmente dai ricercatori. Sebbene molto ben consolidati, permangono problemi di soggettività e di applicazione coerente di una definizione tangibile di cessazione di tutti i movimenti, compresi gli spasmi muscolari, quando si implementano questi test manuali. Abbiamo sviluppato un metodo ad alta produttività per automatizzare i saggi di tolleranza al calore utilizzando i monitor di attività della Drosophila TriKinetics (DAM2). Per accompagnare il sistema DAM2, abbiamo scritto un programma e creato un eseguibile di facile utilizzo per leggere automaticamente l'ultimo tempo di movimento dai dati di attività generati. Questo script scrive quindi in un file .csv il tempo di paralisi termica (TKD) per ogni mosca. I nostri dati mostrano che questo metodo DAM2 automatizzato è coerente e affidabile. Nel frattempo, i profili attività creati dai dati del conteggio delle attività sono interessanti. Questi profili di attività possono essere compilati e hanno il potenziale per espandere i saggi di tolleranza al calore per includere le componenti comportamentali relativamente non studiate della tolleranza al calore. Questo protocollo descriverà in dettaglio come utilizzare il sistema DAM2 e l'HoTDAM! software per stimare la tolleranza al calore in D. melanogaster.

Introduzione

Gli ectotermi rispondono tipicamente allo stress da calore con un aumento dell'attività locomotoria. Questo fenomeno è stato evidente ai ricercatori per decenni, con la caratteristica risposta comportamentale descritta da Cowles e Bogert nel 19441. Hanno descritto come un organismo sotto stress termico mostrerà per la prima volta un aumento del movimento locomotore. Con l'aumentare dello stress da calore, brevi esplosioni di attività sono intervallate da periodi di inattività. La temperatura alla quale l'organismo non può più mostrare un movimento coordinato è il massimo termico critico (CTmax). Seguono spammi muscolari e alla fine l'organismo collassa 1,2. Questo collasso è difficile da definire e rappresenta qualcosa di simile a "rigore da calore, coma o morte"2. Qui useremo il termine collasso fisiologico per riferirci teoricamente a questo punto finale sfocato dello stress da calore.

La Drosophila melanogaster e altri piccoli insetti sono stati modelli preziosi per studiare lo stress da calore. Per stimare almeno una parte della complessa collezione di tratti che costituiscono la tolleranza al calore, molti ricercatori hanno osservato manualmente il tempo e la temperatura alla quale si verifica il collasso fisiologico, che rappresentano rispettivamente il tempo di abbattimento (TKD) e CTmax. Sebbene molto consolidati, questi metodi di analisi manuale presentano alcuni inconvenienti. Una definizione operativa di collasso fisiologico può essere difficile da stabilire e applicare in modo appropriato a tutti i casi, soprattutto quando gli osservatori sono meno esperti. Ad esempio, a che punto l'organismo passa dagli spasmi muscolari al collasso? Il modello di spasmi muscolari e l'attività convulsiva prima del collasso possono essere imprevedibili e possono complicare l'osservazione accurata 2,3, minacciando l'accuratezza e la precisione. Nel frattempo, la difficoltà nell'osservazione limita anche il numero di organismi che possono essere analizzati contemporaneamente, limitando la scalabilità.

Poiché un aumento dell'attività è una risposta costante al calore e TKD e CTmax sono in definitiva il punto in cui l'attività cessa, abbiamo cercato di utilizzare i monitor di attività Drosophila (DAM2) di TriKinetics per automatizzare i saggi di tolleranza al calore. Di recente abbiamo pubblicato un metodo per un test automatizzato, insieme a un software di facile utilizzo, utilizzando il sistema DAM24. Il test è stato convalidato confrontando le misure di tolleranza al calore in termini di TKD con un classico test TKD manuale basato sull'osservazione in base a diversi fattori. Abbiamo anche esplorato la componente dell'attività locomotoria dei saggi TKD per caratterizzare ulteriormente il fenotipo di termotolleranza inducibile. Abbiamo chiamato il test e il software di accompagnamento HoTDAM! (Saggi di tolleranza al calore utilizzando il sistema di monitoraggio dell'attività della Drosophila). Qui forniamo una descrizione dettagliata del metodo di analisi automatizzato della tolleranza al calore utilizzando il sistema DAM2 e l'HoTDAM! software. Il test è facile da usare ed è facilmente scalabile per consentire la misurazione di più organismi contemporaneamente.

In questo manoscritto, abbiamo eseguito saggi TKD su mosche mutanti termosensoriali (potenziale recettore transitorio ankyrin 1; TRPA1) e i loro controlli genetici (bianco1118; w1118). Questi organismi sono stati scelti per sottolineare l'importanza dell'aumento dell'attività caratteristico osservato durante lo stress da calore per il saggio. Vale a dire, gli organismi TRPA1 non mostrano questo comportamento di fuga, illustrando la connessione intrinseca tra le risposte comportamentali conservate e le stime della tolleranza al calore, come la TKD. Abbiamo eseguito il test sia per le femmine che per i maschi, oltre a implementare un pretrattamento termoindurente. I risultati rappresentativi qui presentati sono dati provenienti da saggi completamente nuovi rispetto a quelli utilizzati nei saggi di convalida originali pubblicati in precedenza.

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Protocollo

1. Allevamento di mosche

  1. Scegli il ceppo o la lenza appropriata per l'indagine.
    NOTA: Per illustrare il test, abbiamo utilizzato il ceppo TRPA1 knockout del potenziale recettoriale transitorio e il suo controllo genetico, il ceppo w1118 .
  2. Mantenere gli stock di mosche in condizioni costanti, a seconda dei casi. Per seguire questo protocollo, allestire le scorte a 25 °C in un ciclo diurno 12:12 su alimenti standard (farina di mais, melassa e lievito di torula).
  3. Separare maschi e femmine con una leggera anestesia.
    NOTA: A seconda dell'esperimento, potrebbero essere utilizzate mosche vergini o accoppiate.
    1. Lasciare che i maschi e le femmine adulti (separatamente per entrambi gli stock) si accoppino e depongano le uova per 5 giorni. Togliete gli adulti dalle bottiglie.
    2. Quando gli adulti iniziano a chiudersi diversi giorni dopo, svuota di nuovo le bottiglie. Dopo 2 giorni, separare i maschi e le femmine utilizzando una leggera anestesia eterea e lasciarli maturare separatamente a una densità di 25 mosche per fiala.

2. Pretrattamento

  1. Applicare il pretrattamento o la variabile indipendente che definirà i gruppi sperimentali (genetici, ambientali, farmacologici o altro).
    1. Per seguire questo protocollo, separare gli adulti per sesso e, dopo 5 giorni, pretrattare metà degli adulti immergendo una fiala sigillata contenente gli organismi in un bagno d'acqua a 37 °C per 1 ora. Mantenere i comandi nell'incubatrice a 25 °C. Lasciare che le mosche si riprendano per 24 ore dopo il pretrattamento, prima del saggio di tolleranza al calore.

3. Configurazione del sistema DAM2

  1. Caricare le mosche nei tubi del monitor DAM2 e tappare i tubi su entrambe le estremità con del cotone. Se le mosche devono essere valutate immediatamente per la tolleranza al calore, non utilizzare alcun anestesia durante il caricamento degli organismi nei tubi del monitor per evitare potenziali effetti confondenti associati all'esposizione all'anestesia. Invece, aspirare i singoli moscerini dalle fiale di contenimento nei tubi del monitor.
  2. Inserire le provette nei monitor di attività, prendendo nota dei numeri di slot in cui vengono caricati i diversi gruppi.
    NOTA: Questi possono essere randomizzati a seconda dell'esperimento se la posizione all'interno del monitor può essere considerata una variabile confondente.
  3. Software di acquisizione dati DAM2
    NOTA: Il sistema e il software DAM2 sono descritti in modo approfondito nella scheda tecnica del software DAMSystem3 disponibile sul sito web dell'azienda (vedere la tabella dei materiali). Fare riferimento alle istruzioni DAM2 per la risoluzione dei problemi specifica e le funzionalità generali. Qui forniamo una guida per l'utilizzo del sistema nel contesto del nostro test di tolleranza al calore.
    1. Il sistema DAM2 monitora il numero di volte in cui una singola mosca all'interno di ciascun tubo rompe un raggio infrarosso. Il software di acquisizione dati indicizza e reimposta quindi questo conteggio ogni intervallo di tempo definito. In Preferenze, selezionare l'intervallo di lettura da utilizzare nel test. Abbiamo trovato un intervallo di lettura di 15 s per ottenere un buon equilibrio tra risoluzione ed errori di lettura.
      NOTA: Si raccomanda che l'intervallo di lettura non sia inferiore in secondi al numero di monitor utilizzati. Un intervallo di lettura più breve darà una migliore risoluzione temporale al saggio, ma aumenterà anche potenzialmente i casi di errori di lettura. Il software può rimanere indietro durante il tentativo di indicizzare le letture. Inoltre, un computer più recente e più veloce fa molto per prevenire gli errori di lettura.
    2. Durante la valutazione degli errori di lettura, assicurarsi che il computer utilizzato per eseguire il software di acquisizione dati DAM2 sia impostato su non dormire mai o ibernarsi per non interrompere il test. Inoltre, assicurarsi che gli aggiornamenti automatici (inclusi eventuali aggiornamenti di rete controllati dall'istituto) siano disattivati durante la raccolta dei dati.
    3. Verificare che tutti i monitor siano collegati e comunichino con il software. Verificare che lo stato di ciascun monitor sia verde nella scheda dei dati correnti .
      NOTA: Vedere la scheda tecnica del software DAMSystem3 per i dettagli sui problemi a cui si riferiscono i diversi codici colore.
    4. Il software di acquisizione dati scriverà automaticamente i conteggi delle attività nei file di testo nella cartella Dati all'interno dei file di sistema. Per semplificare l'analisi dei dati, eliminare tutti i file di testo all'interno di questa cartella Dati prima di avviare il software di acquisizione dati per qualsiasi test.
      NOTA: I file di testo verranno popolati automaticamente, quindi è consentito rimuoverli da questa cartella per cancellare i vecchi dati senza ostacolare il programma.

4. Saggio di tolleranza al calore

  1. Caricare i monitor nell'incubatore per saggi.
  2. Avviare il software di acquisizione e lasciare che il software indicizzi per un periodo di tempo definito (ad esempio, 40 indici o 10 min se l'intervallo di lettura è impostato su 15 s) prima di applicare lo stress termico.
    NOTA: Ciò consente una certa acclimatazione ai tubi e il recupero dal movimento dei monitor durante l'installazione. Soprattutto se l'attività durante il test viene analizzata, questo tempo di acclimatazione stabilirà un'attività di base prima dell'induzione dello stress termico. A seconda della natura specifica del test da eseguire, questa fase di acclimatazione potrebbe essere saltata, con i monitor posizionati direttamente nell'incubatore già alla temperatura di stress.
  3. Se si esegue un test statico (TKD), impostare l'incubatore in modo che raggiunga il più rapidamente possibile la temperatura nociva impostata dopo il periodo di acclimatazione. La variabile di risposta sarà operazionalizzata come l'ultimo tempo di movimento registrato (cioè l'ultimo indice diverso da zero) per stimare il TKD.
    1. Se si esegue un test dinamico, determinare la velocità con cui la temperatura aumenterà dopo il periodo di acclimatazione. In questo caso, la variabile di risposta misurata è tecnicamente di nuovo il tempo. L'ora in cui viene registrato l'ultimo movimento coinciderà con una temperatura (CTmax), a seconda della velocità di rampa.
    2. Monitora i conteggi delle attività in tempo reale sul display del sistema DAM nel software di acquisizione o esamina direttamente i file di testo nella cartella dei dati nei file di programma DAMSystem3. Copia i file di testo e apri la copia anziché il file originale all'interno della cartella dei dati per evitare di causare problemi con la registrazione dei dati in tempo reale.
    3. Dopo che non si vede alcun movimento in nessuna delle mosche per diversi minuti, arrestare il software di acquisizione.
      NOTA: Con i nostri test, abbiamo scoperto che da pochi a diversi minuti di inattività sono indicativi di un collasso fisiologico dovuto a stress termico simile a quello osservato nei classici test TKD manuali. Questo, tuttavia, dipende dal comportamento di fuga spontanea. Pertanto, considerare le possibili variabili confondenti se il trattamento specifico nell'indagine potrebbe alterare questa risposta comportamentale. Inoltre, a seconda dei parametri specifici del test (ad esempio, temperatura, trattamento), la lunghezza del test varierà ovviamente.

5. Organizzazione e analisi dei dati

NOTA: vedere il video supplementare S1 per una procedura dettagliata su come scaricare l'applicazione eseguibile da GitHub, nonché le funzionalità di base del software.

  1. Una volta acquisiti i dati, eseguire la scansione dei file di testo alla ricerca di errori utilizzando il software di riferimento (vedere la Tabella dei materiali) e selezionare i punti di inizio e fine specifici per i dati dell'attività di binning. Se è stato implementato un intervallo di acclimatazione di 10 minuti, avviare il binning 10 minuti nella registrazione dell'attività. Per ulteriori dettagli sul binning, vedere la discussione.
  2. Apri il file HoTDAM! software di analisi e importare i file di dati del monitor scansionato facendo clic su File | carica dati del monitor.
    NOTA: Il software e l'applicazione eseguibile sono disponibili da GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) o dal sito web dell'azienda all'interno della sezione Software di analisi . Si noti che l'applicazione eseguibile è compatibile solo con i sistemi operativi Windows in questo momento.
  3. Aggiungere le designazioni dei gruppi per indicare quali gruppi di trattamento corrispondono a quale cella all'interno dei monitor DAM2.
    NOTA: Il layout dell'interfaccia software corrisponde al layout dei monitor.
  4. Fare clic su Avvia definizione multigruppo per visualizzare una finestra di dialogo in cui aggiungere una designazione di gruppo che verrà applicata a più celle. Una volta accettata la designazione del gruppo, fare clic sulle celle per applicare la designazione del gruppo, quindi fare clic su Interrompi designazione multigruppo.
    NOTA: Il software organizza ed esporta i dati DAMSystem3 in file .csv da analizzare nel software di statistica.
  5. Esportare il TKD (ovvero l'ultimo indice diverso da zero) per ogni mosca all'interno dei monitor in un file .csv facendo clic su File | Esportazione dei dati di abbattimento | Esporta tutti i monitor o esporta i monitor selezionati. Il TKD per ogni mosca sarà organizzato nell'output per designazione del gruppo.
  6. Esporta i dati dell'attività per ogni mosca facendo clic su File | Esportazione dei dati delle attività | Esporta tutti i monitoraggi o esporta i monitoraggi selezionati in un file .csv, mantenendo solo i dati di timestamp e conteggio, semplificando l'utilizzo del file di dati e assegnando anche etichette di gruppo designate per ogni volo.
    NOTA: Le prime colonne dei file di dati DAMSystem3 corrispondono ai dati interni dei monitor (ad esempio, monitoraggio della luce o messaggi di errore) durante l'acquisizione. I dati di conteggio si trovano nelle colonne 11-42 (vedere la scheda tecnica di DamSystem3 per i dettagli). L'esportazione dei dati dell'attività con il software di analisi rimuoverà tutte le colonne tranne il timestamp e le colonne dei dati di conteggio.
  7. Se si esegue un esperimento CTmax, utilizzare il TKD per determinare il CTmax utilizzando la velocità di rampa della temperatura.
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    NOTA: Il software di analisi è stato scritto in modo orientato agli oggetti in C# (codice sorgente disponibile su GitHub; https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) in modo che gli aspetti del programma possano essere facilmente modificati per consentire la personalizzazione per soddisfare scopi specifici.

6. Statistiche

NOTA: È possibile utilizzare molti test diversi per analizzare i dati TKD, a seconda delle specifiche della configurazione sperimentale.

  1. Utilizzare l'analisi della sopravvivenza (ad esempio, regressione di Cox, Kaplan-Meier) per concettualizzare l'abbattimento come un evento che ogni mosca all'interno del test sperimenterà.
    NOTA: Per una revisione dettagliata, vedere la serie di 4 articoli di Bradburn e Clark che discutono l'analisi della sopravvivenza e la sua attuazione 5,6,7,8.
  2. Utilizza l'ANOVA per valutare le differenze di gruppo e confrontare le modalità, soprattutto quando si convalida il test automatizzato per condizioni specifiche.
  3. Analizza i dati TKD utilizzando l'analisi di sopravvivenza Kaplan-Meier. Dividi il file per stock in modo che l'analisi venga eseguita separatamente (ad esempio, per le linee di stock TRPA1 e w1118 ). Scegli la variabile tempo come TKD (in min), knockdown come evento, pretrattamento come fattore e sesso come strati.
  4. Eseguire i test log-rank, Breslow e Tarone-Ware per confrontare il pretrattamento per ogni strato (cioè il sesso), a scopo illustrativo mostrando diversi metodi.
  5. Costruisci trame di sopravvivenza.

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Risultati

Le analisi per gli stock di TRPA1 e w1118 sono state eseguite separatamente. I tempi percentili TKD e altri elementi descrittivi sono riportati nella Tabella 1.

Percentilia
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Discussione

Il metodo di saggio della tolleranza al calore che descriviamo qui è versatile e scalabile. In precedenza abbiamo pubblicato uno studio di convalida in cui abbiamo confrontato l'HoTDAM! metodo a un classico test TKD basato sull'osservazione e ha riscontrato che il test automatizzato mostra la stessa tendenza generale in diversi fattori4 (Figura 3). In altre parole, allo stesso modo del classico test TKD manuale, il test automatizzato DAM2 è stato in grado di differenz...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Il progetto descritto è stato sostenuto da sovvenzioni Institutional Development Award (IDeA) dell'Istituto Nazionale di Scienze Mediche Generali del National Institutes of Health (5P20GM103427 e 1U54GM115458). Il programma UNK Undergraduate Research Fellows e il programma di ricerca estiva per studenti di medicina UNMC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette in polistirene da 14 mlFalcon352057
Acquario da 30 galloniWal-mart
Bottiglie da 8 onceGenesee32-129F
Camera climatica costanteMemmertHPP750eco
farina di maisLab ScientificFLY801010
DAM2  Monitor di attività DrosophilaTriKineticsDAM2(Scheda tecnica DAMSystem3) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf
Software di acquisizione dati DAMSystemgratuitodi
Drosophila agarLab ScientificFLY80201
etanoloFisher ScientificBP82011
EtherFisher ScientificE134-4
Software FileScanTriKineticsper la scansione di errori di testo, dati di binning e output
Trikineticshttps://github.com/MatthewR47/HoTDAM
Riscaldatore a circolazione ad immersionePolyScienceMX-CA11B
melassaLab ScientificFLY80084
acido propionicoFisher ScientificA258-500
Pyrex Tubi di vetro 5 x 65 mm per DAM2TriKineticsPGT 5x65https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf
piccolo pennelloWal-mart
SPSS StatisticsIBM
tegoseptLab ScientificFLY55015
lievito di torulaMP Biomedicals290308505
TRPA1 mutante stockBloomington Stock center26504w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1]
w1118 stockBloomington Stock center3605
Download FlyStuff Flugs per bottiglie Genesee 49-100 FlyStuff Flugs per fiale Genesee 49-102 FlyStuff fiale Genesee 32-113RL HoTDAM software Github o

Riferimenti

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