Method Article

Identificazione e classificazione delle varianti missenso della subunità del recettore GABAA posizionate per il loro ruolo nei neuroni piramidali dell'ippocampo

DOI:

10.3791/67833

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June 6th, 2025

 , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Engineering and Natural Sciences, Üsküdar University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio introduce un quadro multiscala, che spazia dal DNA alla funzione delle proteine e al comportamento neurale. Presenta un nuovo approccio per lo studio delle mutazioni patogene previste nella subunità del recettore GABAA , ipotizzando che le mutazioni epilettogene e le mutazioni prossimali, previste come patogene, possano produrre effetti simili sul modello di neurone piramidale CA1.

Abstract

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Comprendere gli effetti di varianti funzionalmente sconosciute nei geni associati all'epilessia è fondamentale per chiarire la fisiopatologia della malattia e sviluppare terapie personalizzate. Con un quadro multiscala, che spazia dalla sequenza del DNA alla funzione proteica e al comportamento neurale, descriviamo un nuovo approccio per prevedere e studiare le mutazioni patogene, ipotizzando che le mutazioni epilettogene nella subunità del recettore GABAA e le mutazioni predette vicine possano produrre effetti simili sul modello di neurone piramidale CA1. Esplorando le relazioni caratteristiche tra mutazioni patogene previste e mutazioni epilettogene prossimali, lo studio mira a stimare gli effetti delle mutazioni predette sulla base degli effetti delle mutazioni epilettogene sulle simulazioni dei neuroni piramidali dell'ippocampo.

La metodologia inizia con la raccolta dei dati genetici della subunità γ2 del recettore GABAA , seguita dalla pulizia e dalla formattazione dei dati eseguita in R utilizzando uno script personalizzato. Successivamente, verranno applicati predittori d'insieme per identificare e dare priorità alle varianti missenso patogene della subunità γ2 . Verrà illustrata la mappatura di una specifica variante patogenetica (predicted) ai domini strutturali delle subunità condivisi dalle mutazioni epilettogene, accompagnata da modelli molecolari dei loro effetti e dalla considerazione della conservazione evolutiva. Successivamente, verrà eseguita la meta-analisi variant-specifica e la normalizzazione dei parametri, seguita dall'analisi di correlazione per identificare eventuali relazioni significative tra mutazioni previste e mutazioni epilettogene prossimali. Utilizzando un simulatore neurale basato su Python, verrà descritto un modello neuronale multicompartimentale basato sulla conduttanza, che riflette l'effetto dei mutanti wild-type ed epilettogeni. La simulazione delle risposte neurali generate dal sottotipo epilettogeno del recettore GABAA sarà presa in considerazione per la stima approssimativa dell'effetto delle varianti patogene previste sulla risposta neurale. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo che esplora un framework multiscala per stimare gli effetti delle varianti del recettore GABAA sul comportamento neuronale, cruciale per la ricerca sull'epilessia. Questo protocollo può servire come base per migliorare le previsioni dei fenotipi cellulari causati da varianti potenzialmente patogene dei recettori GABAA associate all'epilessia.

Introduction

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Per quasi tutte le malattie umane, la variazione genetica gioca un ruolo significativo nella suscettibilità individuale. Pertanto, comprendere in che modo le variazioni di sequenza sono correlate al rischio di malattia offre un modo prezioso per scoprire i processi chiave coinvolti nello sviluppo della malattia e identificare nuovi approcci per la prevenzione e il trattamento1. Questo vale anche per i disturbi del neurosviluppo, che si collocano tra le condizioni mediche croniche più diffuse nelle cure primarie pediatriche2. Condizioni come il disturbo dello spettro autistico, la disabilità intellettiva e l'epilessia illustrano come la variazione genetica influenzi in modo significativo la suscettibilità individuale durante lo sviluppo3.

Il cervello in via di sviluppo è più suscettibile alle crisi epilettiche rispetto al cervello adulto a causa della mancata corrispondenza dello sviluppo neurologico geneticamente programmata nell'equilibrio critico tra eccitazione e inibizione4. Poiché il GABA (acido gamma-aminobutirrico), il principale neurotrasmettitore inibitorio nel cervello adulto, è eccitatorio durante lo sviluppo embrionale e postnatale precoce, ciò non è favorevole alla stabilità necessaria per prevenire le convulsioni nei cervelli giovani. Questo stato temporaneo, causato dalla mancanza di una sufficiente espressione dei co-trasportatori K-Cl5, può contribuire ad aumentare il rischio di attività convulsiva in presenza di recettori GABAA disfunzionali. I recettori GABAA mediano le azioni eccitatorie e inibitorie del GABA, a seconda della concentrazione intracellulare dello ione Cl- 6. Pertanto, man mano che il cervello matura, le mutazioni nei geni codificanti il recettore GABAA , così come in altri canali ionici, distorcono l'eccitabilità e le mutazioni nei geni coinvolti nel metabolismo neuronale, nella segnalazione cellulare e nella formazione delle sinapsi7, possono causare condizioni come l'epilessia infantile8.

Gli interventi clinici sfruttano sempre più l'analisi genetica per migliorare la precisione nel trattamento dei disturbi del neurosviluppo2. I test genetici nell'epilessia pediatrica presentano potenziali bersagli per gli approcci della medicina di precisione9, evidenziando l'importanza delle varianti genetiche nel guidare le decisioni terapeutiche. Inoltre, ~25% dei pazienti con epilessia con mutazioni de novo riceve diagnosi genetiche che identificano potenziali bersagli per la medicina di precisione, sottolineando il valore significativo delle varianti genetiche nel guidare le decisioni terapeutiche10. Ciò è stato alimentato dai progressi nelle tecnologie di sequenziamento di nuova generazione, come i pannelli genici mirati, il sequenziamento dell'intero esoma e il sequenziamento dell'intero genoma, che hanno notevolmente accelerato le scoperte genetiche11. Tuttavia, il numero crescente di nuove scoperte genetiche comporta una sfida quando i risultati producono una variante di significato sconosciuto (VUS), una classificazione che riflette prove contrastanti o informazioni insufficienti riguardo al ruolo molecolare della variante nella patogenesi della malattia. Le varianti classificate come VUS corrispondono a una categoria all'interno del sistema di classificazione delle varianti a cinque livelli proposto dall'American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) e dall'Association for Molecular Pathology (AMP)12.

Affrontare la sfida delle varianti genetiche funzionalmente sconosciute richiede sforzi in due dimensioni chiave: la pratica clinica e la ricerca. Clinicamente, l'incertezza che circonda la VUS può complicare la gestione del paziente e il processo decisionale13. Dal punto di vista della ricerca scientifica, è fondamentale identificare le varianti patogene tra il crescente numero di varianti di incerta significatività e determinare il loro ruolo nella fisiopatologia della malattia e negli effetti fenotipici1. Uno scenario ideale comporterebbe la previsione accurata degli effetti molecolari, neuronali e a livello di rete di tutte le varianti funzionalmente non caratterizzate, riducendo così al minimo le risorse, il tempo e lo sforzo necessari per le indagini di laboratorio. Questi aspetti sottolineano l'importanza di classificare accuratamente le varianti genetiche per consentire una diagnosi precisa delle epilessie genetiche, supportare un trattamento personalizzato e facilitare la scoperta di potenziali bersagli farmacologici. Gli attuali strumenti predittivi 14,15,16,17 sono relativamente accurati, ma in genere forniscono solo classificazioni binarie (patogeni vs. benigni) e mancano di informazioni specifiche sulla fisiopatologia molecolare, sulle conseguenze fenotipiche e sui meccanismi sottostanti. Concentrandosi sulle varianti missenso sconosciute di geni selezionati che codificano per le subunità del recettore GABAA, questo articolo presenta un quadro volto a migliorare le linee guida della ricerca incorporando fattori contestuali di varianti come aspetti molecolari, evolutivi e strutturali, nonché simulazioni di patologia neurale derivate da dati biofisici in vitro di mutazioni associate all'epilessia. La nostra metodologia affronta l'identificazione di varianti patogene sconosciute della subunità γ2 del recettore GABAA, una subunità chiave coinvolta nella fisiopatologia dell'epilessia 18,19,20. Segue l'esplorazione della corrispondenza posizione-specifica di queste varianti predette con le mutazioni associate all'epilessia caratterizzate da dati strutturali ed elettrofisiologici. Questi dati vengono poi utilizzati per stimare l'effetto variante su un modello di neurone piramidale ippocampale che esprime un sottotipo di recettore GABAA, composto da subunità γ2, α1 e β3 (recettori γ2-GABAA), responsabili dell'inibizione sinaptica veloce6. È importante notare che i recettori GABAA si assemblano da un ampio pool di subunità (α1-α6, β1-β3, γ1-γ3, δ, Ε, θ, π e ρ1-ρ3) e, a seconda della composizione delle subunità, i recettori GABAA differiscono per la loro modulazione, caratteristiche biofisiche, nonché modelli di espressione regionali, cellulari e subcellulari accoppiati con funzioni specifiche 6,21,22,23, 24,25. Pertanto, il presente studio si concentra solo sui recettori γ2-GABAA o sui recettori GABAA contenenti γ2.

Le subunità del recettore GABAA sono composte da caratteristiche strutturali: un lungo dominio extracellulare N-terminale (ECD), quattro domini transmembrana che si estendono (da TM1 a TM4), un linker intracellulare che collega TM1 e TM2, un linker extracellulare che collega TM2 e TM3, un grande loop intracellulare tra TM3 e TM4 (TM3-TM4 loop) e un breve terminale C extracellulare 6,26, 27. Si suggerisce che il recettore GABAA funzioni attraverso un complesso meccanismo di "blocco e trazione", in cui il legame GABA blocca le subunità β e α, inducendole a tirare i domini extracellulari (ECD) delle subunità, ruotandole in senso antiorario27. Questo movimento piega i domini transmembrana (TMD), aprendo così il canale ionico27. Pertanto, l'attività del canale sembra essere coordinata insieme alle cassette strutturali all'interno dei recettori GABAA. Si scopre che le mutazioni dell'epilessia causano disfunzione nell'attività del canale attraverso la distorsione di queste cassette strutturali28. Di conseguenza, il nostro studio si basa sull'idea che varianti patogene predette in prossimità di mutazioni epilettogene funzionalmente identificate nelle specifiche cassette strutturali delle subunità del recettore GABAA possano mostrare modelli simili di distorsione elettrofisiologica o biofisica nella funzione del canale, come osservato nei casi di queste mutazioni epilettogene. Mentre la presenza di cassette strutturali epilettogene nelle subunità28 del recettore GABAA supporta indirettamente questa nozione, il nostro studio dimostra la complessità e la sfida di correlare i parametri biofisici delle mutazioni epilettogene con quelli delle mutazioni patogene previste. Per smascherare queste complesse relazioni, il nostro quadro è significativo in quanto evidenzia un approccio multiscala che va dal DNA alla funzione delle proteine e al comportamento neurale critico per la ricerca sull'epilessia. Questo approccio integra la genetica computazionale con la modellazione molecolare e le simulazioni neurali, sottolineando anche l'importanza di metodi complementari, come l'apprendimento automatico addestrato su grandi set di dati, che potrebbero catturare gli effetti delle mutazioni sulla struttura del canale, sull'attività e sull'eccitabilità neurale. Inoltre, la simulazione dell'attività epilettogena del recettore γ2-GABAA sul modello di neurone piramidale ippocampale consente la replicazione del fenotipo cellulare in vitro associato alla canalopatia del recettore GABAA e la dimostrazione di risposte alterate a singolo neurone al centro della disfunzione di rete.

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Protocol

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1. Predizione in silico di varianti patogene

  1. Raccolta dei dati sulle varianti
    1. Utilizzando il database ClinVar29, è possibile cercare varianti di significato incerto (VUS) nella regione codificante del gene di interesse tramite il sito web: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/. Inserisci il simbolo del gene (ad esempio, GABRG2) nella barra di ricerca e filtra i risultati per includere solo i tipi di varianti desiderati, come le varianti missenso a singolo nucleotide con significato incerto. Scaricare e salvare i dati come data.xlxs (File supplementare 4: Tabella supplementare S1). Registra la data dei dati scaricati.
      NOTA: Nel presente protocollo, verrà analizzata la subunità γ2 umana del recettore GABAA, in particolare la subunità gamma2 del recettore dell'acido gamma-aminobutirrico A dell'acido gamma A (GABRG2), variante di trascrizione 1, mRNA (NCBI Ref. seq.: NM_198904.4), nota anche come γ2L. È importante registrare il trascritto di riferimento del gene di interesse e altri identificatori corrispondenti in diversi database (UniProt, ENSEMBL, PDB) poiché diversi metodi computazionali possono richiedere identificatori diversi (Supplementary File 4: Supplementary Table S2). Nel caso in cui il database o lo strumento computazionale non riconosca i numeri di versione degli identificatori di sequenza, provare sia l'ID con il numero di versione (NM_198904.4) che senza il numero di versione (NM_198904).
    2. Informazioni di base sulla proteina di riferimento
      1. Nella https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ del database NCBI, selezionare Nucleotide nelle opzioni di ricerca e inserire l'ID NCBI del gene di interesse (NM_198904.4). Quindi, scorrendo verso il basso sulla colonna di destra, fare clic su Proteina sotto la categoria Informazioni correlate per trovare la proteina (NP_944494.1) codificata dalla trascrizione NM_198904.4. Utilizzando le informazioni fornite per la proteina NP_944494.1, registrare le posizioni di sequenza delle regioni specifiche sotto forma di tabella (File supplementare 4: Tabella supplementare S3).
        NOTA: È importante determinare le informazioni preliminari note per la posizione della sequenza di regioni, motivi o residui funzionalmente e strutturalmente critici come domini proteici, siti di fosforilazione, siti di legame del ligando e interfacce di interazione molecolare. Ciò può essere ottenuto combinando banche dati (NCBI, ENSEMBL, UniProt...) e ricerche bibliografiche.
  2. Organizzazione dei dati delle varianti
    1. Organizzare i dati in modo da soddisfare i requisiti di input per i predittori scelti. Assicurarsi che il formato dei dati recuperati sia organizzato in modo da soddisfare i requisiti del server dbNSFP http://database.liulab.science/dbNSFP. A tale scopo, rimuovere le colonne non necessarie dal file data.xlsx (File supplementare 4: Tabella supplementare S1 dal passaggio 1.1.1), mantenendo solo le colonne seguenti nell'ordine specificato:
      "Cromosoma GRCh38", "Posizione GRCh38", "Nome", "Cambiamento proteico".
    2. Salvare il file con un nuovo nome: "data1.xlsx" (Tabella supplementare S4). Formattare il file data1.xlsx in R eseguendo il codice (File supplementare 1: Data_GABAA. R), che salverà i dati formattati come data1_output.xlsx (File supplementare 4: Tabella supplementare S5) nella directory di lavoro relativa al progetto R.
      NOTA: Diversi metodi computazionali richiedono diversi tipi e formati di dati. La raccolta e l'organizzazione dei dati in base a requisiti di formato specifici, anche per una dozzina di varianti, può essere soggetta a errori e richiedere molto tempo, quindi questo passaggio è importante a meno che il pool di varianti non sia composto solo da poche varianti. Quindi, potrebbe essere possibile l'organizzazione manuale dei dati.
  3. Previsione della patogenicità
    1. Trasferisci il contenuto del file data1_output.xlsx nella versione accademica del server dbNSFP30,31 accessibile tramite http://database.liulab.science/dbNSFP. Per fare ciò, copia/incolla o carica direttamente il file in formato .txt.
    2. Assicurati che le seguenti opzioni siano preselezionate e confermate nel server: HG38 (build del genoma), ClinPred32 e BayesDEL33 prima dell'invio. Entro pochi minuti, il server genererà i risultati.
      NOTA: Nel presente protocollo, due predittori d'insieme, vale a dire BayesDEL33 e ClinPred32, sono stati selezionati per l'elevata precisione34 e la praticità. Tuttavia, è possibile selezionare anche altri predittori, come AlphaMissense, disponibile nel database dbNSFP 30,31. La selezione di strumenti in silico dipende da diversi fattori, tra cui la generazione di sufficienti linee multiple di evidenza computazionale per una potente previsione12. I predittori d'insieme che integrano l'analisi di più algoritmi predittivi possono servire a questo scopo.
    3. Scaricare il file di output (in formato .txt) e salvarlo come data2.xlsx (File supplementare 4: Tabella supplementare S6).
    4. Impostare i filtri in data2.xlsx (File supplementare 4: Tabella supplementare S6) facendo clic sull'opzione di filtro nel menu e determinando le varianti di consenso in entrambe le colonne filtrando per D. Questo darà l'elenco delle varianti più patogene; salvarlo (vedere la scheda Consenso nella Tabella Supplementare S6 [ File Supplementare 4]).
  4. Selezione delle varianti
    1. Tra le previsioni patogenetiche consensuali, determinare le varianti in prossimità di mutazioni epilettogene ottenute dalla letteratura. Assicurarsi che questi ultimi abbiano parametri strutturali e biofisici adatti alla modellazione dei neuroni.
      NOTA: Questa fase è esplorativa ed è anche correlata all'indagine della proteina di interesse in termini di parametri strutturali, fisico-chimici e biofisici. Nel presente studio, questi dati sono stati ottenuti da Brünger et al.35 e Guo et al.36 in aggiunta a un'indagine sulle mutazioni associate all'epilessia. Inoltre, come opzione, i punteggi AlphaMissense37 sono stati accessibili dal database dbNSFP30,31 ripetendo il passaggio 1.3 (File supplementare 4: Tabella supplementare S7). Maggiori dettagli sono forniti nelle sezioni 2.1.1 e 2.1.2 del protocollo e nei risultati (vedere "Varianti di clustering per parametri strutturali e biofisici").
    2. Per la visualizzazione di base, utilizzare i server Protter38 ((https://wlab.ethz.ch/protter/start/) e HOPE39 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/) per esaminare le varianti del passaggio precedente nel contesto di mutazioni genetiche GABRG2 selezionate: P302L40 e K328M (o K289M41, se si esclude il peptide segnale 39-residue).
      NOTA: A causa dell'enorme complessità, la valutazione strutturale degli effetti delle varianti dovrebbe essere condotta a più livelli di analisi. Strumenti come Protter38 consentiranno una chiara visualizzazione delle varianti nel contesto delle caratteristiche topologiche della proteina e server di facile utilizzo come HOPE39 forniranno informazioni sull'effetto della variante mediante modellazione molecolare. Inoltre, una revisione completa della letteratura sulla proteina di interesse è fondamentale per identificare e integrare le informazioni sulle mutazioni associate all'epilessia.
    3. Analisi della conservazione evolutiva e intuizioni strutturali
      1. Apri Jalview 42,43,44, un programma open source per l'editing, la visualizzazione e l'analisi delle proteine.
      2. Importare sequenze per l'allineamento. Clicca su File nel menu in alto | Recupera sequenze; selezionare il database nella finestra di dialogo (ad esempio UniProt); fare clic sulla scheda recupera ID; e come descritto nella finestra di dialogo, immettere gli ID di adesione UniProt del gene di interesse (GABRG2) dall'uomo e da altre specie vertebrate: P18507, P22723, Q6PW52, A0A2I3TKX0, F1RR72, A0A8I3MDZ2, A0A8M1P4D6. Fare clic su OK.
        NOTA: I numeri di accesso UniProt delle proteine codificate da GABRG2 sono i seguenti: P18507 (P18507-2) per Homo sapiens, P22723 per Mus musculus, A0A2I3TKX0 per Pan troglodytes, F1RR72 per Sus scrofa, A0A8I3MDZ2 per Canis familiaris e A0A8M1P4D6 per Danio rerio.
      3. A seconda del gene di interesse, alcune sequenze potrebbero non essere annotate; pertanto, eseguire una ricerca BLAST per identificare le informazioni rilevanti e i potenziali omologhi per una migliore comprensione contestuale. In questo caso, caricare il formato FASTA delle sequenze proteiche tramite l'opzione Aggiungi sequenze/Da casella di testo nel menu File per produrre allineamenti multipli delle sequenze desiderate.
      4. Una volta caricato l'allineamento, osservare le sequenze visualizzate per il confronto di più sequenze. Ogni riga rappresenta una sequenza e ogni colonna rappresenta una posizione nell'allineamento. Per determinare il miglior metodo di allineamento, utilizzare diversi approcci; ad esempio, fare clic su Web services nel menu Sequenza e selezionare l'opzione Esegui T-Coffee con preimpostazione , che consente un allineamento ottimale.
      5. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza P18507 Homo sapiens (la sequenza di riferimento nel presente studio) e impostarla come sequenza di riferimento. Scegli Formato nel menu in alto e fai clic su Avvolgi per visualizzare l'allineamento completo sullo schermo. Nello stesso menu Formato, fare clic sulla scala in alto per migliorare la visualizzazione dei numeri di residui specifici. Per migliorare ulteriormente la visualizzazione, regola le combinazioni di colori andando su Colore e selezionando diverse opzioni (ad esempio, Colore Clustal, Proprietà chimica); Se necessario, modificare la dimensione del carattere.
      6. Fare clic su Calcola nella barra dei menu e selezionare Calcola automaticamente consenso per evidenziare le regioni conservate.
      7. Concentrarsi sulla posizione delle varianti di interesse identificate nella fase di previsione in-silico ed esaminare le posizioni specifiche delle varianti. Annota residui specifici facendo clic con il pulsante destro del mouse su di essi e selezionando Aggiungi annotazione. Scrivi l'etichetta (ad es. ID variante) con il codice colore appropriato e salva.
        NOTA: Nella presente analisi, P302L (viola) e A303T (rosso) sono stati selezionati per visualizzarli nell'allineamento a sequenza multipla insieme ai dati strutturali (vedere la sezione successiva).
    4. Ricostruzione tridimensionale dell'intera proteina con i residui conservati selezionati
      1. Nel file ottenuto dal passaggio precedente, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza di riferimento (GABRG2 umano) e selezionare Dati struttura 3D.
      2. Identificare i dati strutturali appropriati (7QNE, Catena C)26 dal menu a discesa e selezionare Apri nuova vista struttura con Jmol.
        NOTA: Ciò consentirà l'incorporazione dei residui selezionati nell'allineamento di sequenze multiple nei dati strutturali di Jmol, un visualizzatore open-source basato su Java per strutture chimiche 3D.

2. Selezione dei parametri e modellazione biofisica

  1. Meta-analisi variant-specifica e normalizzazione dei parametri
    1. Esaminare la letteratura attuale per raccogliere varianti di subunità identificate con conduttanza elettrofisiologica del canale dati (gGABAA), tempo di disattivazione (disattivazione τ), tempo di salita (aumentoτ) e ampiezza massima di corrente (Imax). Fornire le composizioni delle subunità, il tipo di cella e le misure wild-type per ogni caso. Etichettare le varianti e i relativi controlli di conseguenza (ad esempio, noti per le varianti con caratteristiche biofisiche identificate e controlli noti per le misurazioni wild-type per ciascuna variante).
    2. Ottieni i punteggi di patogenicità AlphaMissense per le varianti con caratteristiche biofisiche identificate.
      NOTA: Per ulteriori dettagli, vedere la sezione 1.3 del protocollo.
    3. Creare un frame di dati con la posizione delle subunità e degli amminoacidi per ogni variante, gli amminoacidi originali e alterati, il punteggio di patogenicità e i parametri biofisici ottenuti dalla letteratura. Per evitare discrepanze sperimentali, normalizzare i parametri biofisici per le varianti identificate come cambiamenti x-fold sulle misurazioni wild-type.
  2. Analisi comparativa delle varianti in base alle caratteristiche strutturali e funzionali
    1. Organizzare le varianti previste su un frame di dati; etichetta di conseguenza (ad esempio, prevista per varianti senza letteratura disponibile sulle loro caratteristiche biofisiche).
    2. Classificare le varianti in base alla loro posizione nella sequenza di amminoacidi e nella struttura terziaria. Aggiungere parametri di classificazione strutturale (ad esempio, localizzazione in alfa eliche, bobine, fogli beta, domini extracellulari, intracellulari o transmembrana, rivestimento dei pori, legame con agonisti, interazioni proteina-proteina) sul frame di dati e fornire informazioni per ciascuna variante rispetto alla loro posizione amminoacidica.
    3. Classificare le varianti in base alla loro distanza dal centro della membrana e dall'asse dei pori. Aggiungere la distanza all'asse dei pori e la distanza ai parametri del centro della membrana nel frame di dati.
    4. Analizzare la correlazione tra parametri strutturali e biofisici rispetto a varianti note. Se possibile, valutare le varianti previste rispetto alle correlazioni ottenute.
  3. Costruzione di modelli di sinapsi e neuroni
    1. Usa il Brian245, un simulatore neurale open-source sviluppato in Python per la modellazione e la simulazione di reti neurali spiking, per costruire un modello biofisico multicompartimentale della sinapsi GABAergica su un neurone piramidale ippocampale basato sulla conduttanza multicompartimentale.
    2. Progetta il modello basato sulla conduttanza definendo la cinetica di gating dei canali ionici, i parametri passivi e attivi e le conduttanze postsinaptiche. Definire il modello basato sulla conduttanza come indicato nel File supplementare 2, che descrive le equazioni utilizzate nel modello.
      1. Impostare la capacità di membrana (Cm) a 1 μF/cm2 e la resistenza intracellulare (Ra) a 200 Ω,cm.
      2. Utilizzare le conduttanze modificate di tipo Hodgkin-Huxley per i neuroni piramidali ippocampali39 con gL= 0,0003 S/cm2, gK= 0,036 S/cm2, EL = -76,5 mV, ENa = 50 mV e EK = -90 mV.
      3. Regolare la distribuzione della densità dei canali NaV su gNa come 0,05 S/cm2 per il soma, 0,5 S/cm2 per il segmento iniziale dell'assone (AIS) e il nodo di Ranvier (NR) e 0,005 S/cm2 per i dendriti. Impostare gK e gNa come 0 nei segmenti mielinizzati.
      4. Costruire la cinetica di gating dei canali ionici per NaV e KV come descritto nel File supplementare 2.
      5. Introdurre le correnti sinaptiche (Isyn) come somma di tutte le sinapsi glutammatergiche e GABAergiche in un compartimento. Includere sia la corrente mediata dal recettore AMPA VELOCE (IAMPA) che la corrente mediata dal recettore NMDA lento (INMDA) nella corrente glutammatergica (Iglu). Includere solo la corrente veloce mediata dal recettore GABAA nella corrente GABAergica (IGABA). Supponiamo che una quantità costante di glutammato venga rilasciata alla sinapsi per ogni picco presinaptico; pertanto, l'attivazione dei recettori è spike-tempo-dipendente (sAMPA e sNMDA) e le conduttanze totali dei recettori (gAMPA e gNMDA) riflettono la quantità di glutammato che viene rilasciata da ogni evento.
      6. Utilizzare il modello sinaptico come descritto nel File supplementare 2.
        NOTA: Per una spiegazione dettagliata delle equazioni, vedere il File supplementare 2 che descrive le equazioni utilizzate nel modello.
    3. Ottenere il diametro misurato sperimentalmente per soma e neuriti e la lunghezza di ciascun compartimento neuritico e i modelli di ramificazione dalla letteratura precedente46,47. Ridurre la morfologia del neurone reale in un modello multicompartimentale, dividendo la cellula in più compartimenti, che preservi accuratamente la struttura ramificata principale e mantenga la simmetria bilaterale.
    4. Impostare le caratteristiche morfologiche (lunghezza e diametro del segmento; ad esempio, d_soma: 30 μm; l_AH: 5 μm; d_AH_i: 1,5 μm; d_AH_f: 1,3 μm; l_AIS: 40 μm; d_axon: 1 μm; l_myseg: 100 μm; l_NR: 2 μm; l_AxTer: 4 μm; d_AxTer: 2 μm; l_approx: 100 μm; l_apmed: 100 μm; l_apdis: 200 μm; d_approx_i: 4 μm; d_approx_f: 3 μm; d_apmed : 2 μm; d_apdis: 2 μm; l_apLM: 70 μm; d_apLM: 2 μm; l_nAcDbasal: 400 μm; d_nAcDbasal: 1,4 μm; l_nAcDbasal_stem: 20 μm; d_nAcDbasal_stem: 1,5 μm) e parametri biofisici (come indicato nella sezione 2.3.2) per ciascun compartimento del modello di neurone piramidale46,47, come descritto anche nello script Python (File supplementare 3: GABAAvar.py).
    5. Determinare i parametri biofisici per il modello di sinapsi GABAergica valutando le misure di controllo wild-type ottenute nel passaggio 2.1.1.
  4. Progettare la topologia del modello neuronale e assegnare i parametri morfologici e biofisici, che includono la specifica della disposizione spaziale e delle interconnessioni dei compartimenti, sulla base delle informazioni morfologiche e di ramificazione precedentemente ottenute. Assegnare i parametri morfologici (ad esempio, lunghezza e diametro del segmento) e biofisici appropriati (Sezione 2.3.2) a ciascun compartimento del modello, come indicato nel File supplementare 3: GABAAvar.py.
  5. Costruzione delle sinapsi e iniezione di corrente
    1. Creare l'attività presinaptica utilizzando SpikeGeneratorGroup (una classe della libreria Brian2) come indicato in "GABAAvar.py" (File supplementare 3). Collegare il generatore di spike al compartimento target del neurone modello utilizzando la classe Synapses per modellare le connessioni sinaptiche.
    2. Impostare una corrente costante sostenuta (Iinj) su 0,85 nA e posizionarla al soma per imitare l'attività sottosoglia guidata dal carico di corrente ionica basale in un dato momento, come indicato nel file supplementare 3: GABAAvar.py.
  6. Per creare monitor di registrazione, registrare le tracce di tensione dai compartimenti di destinazione utilizzando StateMonitor.
  7. Crea ed esegui la rete.
    1. Costruisci la rete con il neurone modello, le connessioni e i monitor utilizzando Network.
    2. Impostare il passo temporale della simulazione per impostazione predefinitaclock.dt (ad esempio, 0,01 ms).
    3. Esegui la simulazione sulla rete con network.run(T*ms), dove T è impostato su 1.000 ms nell'esempio.
  8. Testare l'impatto delle mutazioni missenso del recettore GABAA
    1. Definire l'impatto di ciascuna mutazione missenso sulla cinetica del canale attraverso i parametri biofisici raccolti nella fase 2.1.1.
    2. Esegui la stimolazione modificando questi parametri e traccia i risultati utilizzando "matplotlib.pyplot" come indicato in "GABAAvar.py" (File supplementare 3).
  9. Testare le combinazioni di parametri per analizzare i cambiamenti nei modelli e nelle velocità di sparo. Traccia i risultati per i confronti.

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Results

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Questo studio utilizza un approccio multiscala per prevedere e caratterizzare le varianti patogene nella subunità γ2 del recettore GABAA , un componente chiave nella fisiopatologia dell'epilessia. Attraverso l'uso di modelli predittivi, modellazione molecolare, conservazione evolutiva, esame strutturale, analisi di correlazione e simulazioni neurali, questo approccio migliora la classificazione delle varianti, con una rilevanza significativa per la ricerca sull'epilessia e poss...

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Discussion

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Applicando una combinazione di genetica computazionale, modellazione molecolare e simulazioni neurali, l'approccio presentato in questo articolo ha il potenziale per migliorare la classificazione delle varianti del recettore GABAA, offrendo preziose informazioni sia per la ricerca sull'epilessia che per le applicazioni cliniche. Un'analisi completa per l'identificazione e la prioritizzazione delle mutazioni patogene previste viene presentata ed estesa in un quadro che potenzia...

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Disclosures

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Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse relativi a questo lavoro.

Acknowledgements

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Ringraziamo Çağla Koca per la sua assistenza nella costruzione del modello di neurone.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Brian2 Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, Francia; Imperial College London, Regno Unito2.8.0.4Stimberg et al., 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
server dbNSFP   Genos Bioinformatics LLC, Stati Unitiv3.0Liu et al., 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
SPERANZA   Centro per l'Informatica Molecolare e Biomolecolare CMBI, Università Radboud, Paesi Bassi.1.1.1Venselaar et al., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
Jalview   Università di Dundee, Regno UnitoJV2Waterhouse et al., 2009 (https://www.jalview.org/)
Taccuino JupyterProgetto Jupyter, Stati Unitihttps://jupyter.org/install 
PhytonPython Software Foundation, Stati Uniti3.13https://www.python.org/downloads/
Protter   ETH Zurigo, SvizzeraVersione 1.0Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R La Fondazione R per il calcolo statistico, USAR versione 4.3.2   https://www.r-project.org/ 
RStudioSoftware Posit, PBC, Stati UnitiVersione RStudio 2023.12.1+402 "Ocean Storm"https://posit.co/downloads/

References

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