Articolo metodologico

Isolamento e coltura di adipociti murini primari da topi magri e obesi

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DOI:

10.3791/67846

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24 gennaio 2025

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Le dimensioni e la fragilità degli adipociti maturi hanno limitato le tecniche e gli strumenti disponibili per il loro studio e isolamento. Qui viene descritto un protocollo per l'isolamento di adipociti murini maturi, che può essere facilmente adattato a diversi depositi adiposi e diete di topi.

Abstract

Il tessuto adiposo è composto principalmente da adipociti maturi e carichi di lipidi in volume. Queste cellule postmitotiche svolgono un ruolo fondamentale nell'immagazzinamento e nella mobilizzazione dell'energia, nella termoregolazione e nella secrezione di fattori endocrini. L'espansione del tessuto adiposo bianco dovuta allo squilibrio calorico provoca sia l'ingrandimento degli adipociti esistenti che la generazione di adipociti aggiuntivi dalle cellule progenitrici degli adipociti. I cambiamenti indotti dall'obesità nel tessuto adiposo bianco, compresi quelli che colpiscono gli adipociti, sono associati a numerose comorbidità, come il diabete di tipo 2 e 13 tipi di cancro. Un ostacolo significativo allo studio di come gli adipociti contribuiscono alla malattia è l'incapacità di isolare e coltivare prontamente gli adipociti maturi. Questo articolo descrive un protocollo per isolare adipociti murini magri e obesi dai depositi di grasso sottocutaneo e viscerale di topi C57BL/6 maschi e femmine. Il protocollo descrive in dettaglio come gli adipociti primari isolati possono essere coltivati in un sistema aggregato di adipociti di membrana per un massimo di 2 settimane, facilitando la loro analisi funzionale in esperimenti di co-coltura, saggi di lipolisi o attraverso la raccolta di terreni condizionati contenenti fattori secreti dagli adipociti. Inoltre, il protocollo delinea i metodi per la coltura di espianti di tessuto adiposo nelle cupole della matrice della membrana basale e l'imaging degli adipociti isolati primari. È importante sottolineare che questo approccio può essere integrato con i protocolli esistenti per l'isolamento delle cellule progenitrici degli adipociti residenti nel tessuto adiposo utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS). Insieme, questi protocolli forniscono ai ricercatori gli strumenti per studiare funzionalmente gli adipociti, le cellule progenitrici degli adipociti e l'intero tessuto adiposo di topi magri e obesi, maschi e femmine.

Introduzione

Si prevede che la prevalenza dell'obesità adulta negli Stati Uniti raggiungerà il 50% entro il 20301, rendendo imperativo comprendere meglio gli effetti cellulari e fisiologici dell'obesità. L'obesità è caratterizzata da uno squilibrio calorico che provoca l'espansione del tessuto adiposo bianco a causa dell'aumento dell'immagazzinamento di energia sotto forma di grasso. L'espansione del tessuto adiposo può avvenire sia attraverso la generazione di nuovi adipociti (iperplasia) sia attraverso un aumento delle dimensioni degli adipociti esistenti (ipertrofia). Sebbene entrambi i processi provochino l'espansione del tessuto adiposo, l'espansione ipertrofica coincide con una ridotta salute metabolica e una maggiore incidenza di disturbi metabolici 2,3. Una migliore comprensione delle complessità del tessuto adiposo fornirà informazioni sui meccanismi molecolari che regolano i disturbi metabolici e altre comorbidità correlate all'obesità, tra cui il diabete di tipo 2 e i tumori.

Il tessuto adiposo è stato a lungo apprezzato per il suo ruolo nell'accumulo di energia e nella termoregolazione. Più recentemente, tuttavia, il tessuto adiposo è emerso come un importante tessuto di segnalazione metabolica, responsabile della secrezione di metaboliti, lipidi e peptidi 4,5. Queste molecole derivate dal tessuto adiposo, chiamate adipochine, segnalano localmente e sistemicamente e possono regolare l'omeostasi energetica, la funzione immunitaria, la dinamica vascolare e altro ancora 5,6,7. Gli adipociti maturi costituiscono circa il 50% delle cellule del tessuto adiposo e rappresentano la stragrande maggioranza del volume del tessuto adiposo8. È importante sottolineare che gli studi hanno scoperto che gli adipociti sono costituiti da molte sottopopolazioni 9,10. Pertanto, le cellule progenitrici degli adipociti generano popolazioni distinte di adipociti maturi in base a fattori quali il sesso e il deposito di tessuto adiposo. Questi adipociti maturi possono essere ulteriormente modulati da cambiamenti nella dieta e nell'obesità, creando sottopopolazioni di adipociti che sono trascrizionalmente distinti ed esprimono diverse firme paracrine 9,11,12,13,14,15,16 . Nonostante la loro complessità e importanza fisiologica, la capacità di isolare e coltivare adipociti maturi rimane un ostacolo netto allo studio di queste cellule.

I metodi attualmente disponibili utilizzati per isolare gli adipociti maturi impiegano la differenziazione dalle cellule progenitrici degli adipociti (APC), la selezione cellulare attivata fluorescente e le tecniche basate sulla centrifugazione, sebbene tutte queste abbiano i loro svantaggi. La differenziazione in vitro o ex vivo delle APC in adipociti maturi è ampiamente utilizzata per lo sviluppo di adipociti maturi. Tuttavia, queste cellule artificialmente differenziate sono multiloculare, contengono molte piccole goccioline lipidiche, piuttosto che il fenotipo uniloculare degli adipociti maturi in vivo, che contengono una grande gocciolina lipidica17. Inoltre, gli studi hanno scoperto che le cellule differenziate in vitro sono trascrizionalmente distinte dagli adipociti maturi isolati trovati in vivo17. È importante sottolineare che la differenziazione in vitro non è in grado di catturare la differenza tra adipociti magri e obesi. La selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) è comunemente usata per isolare specifiche popolazioni cellulari dai tessuti; tuttavia, gli adipociti maturi possono facilmente scoppiare in condizioni di FACS a causa delle loro grandi dimensioni e delle membrane fragili, rendendo questo un metodo inefficiente per l'isolamento degli adipociti maturi. Altri protocolli esistenti comportano l'accumulo di grandi quantità di lipidi liberi, che possono essere tossici per gli adipociti maturi in coltura nel tempo.

Qui descriviamo un protocollo per l'isolamento di adipociti maturi murini dal tessuto adiposo bianco. Questo protocollo è stato adattato dal protocollo per le colture di aggregati di adipociti maturi originariamente stabilito da Harms et al.17; Tuttavia, l'approccio basato sulla centrifugazione qui descritto utilizza apparecchiature di laboratorio comuni ed è in grado di isolare in modo efficiente gli adipociti da piccole quantità (~0,5 g) di tessuto adiposo. Si tratta di un sistema facilmente adattabile e sono incluse modifiche per isolare adipociti murini maturi da topi maschi e femmine, depositi di grasso viscerale e sottocutaneo e diverse condizioni dietetiche.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università dello Utah. Questo protocollo è stato ottimizzato per l'isolamento di adipociti maturi da topi maschi e femmine C57BL/6 di età compresa tra 8 e 16 settimane, con pesi corporei compresi tra 20 e 45 g. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione della soluzione

  1. Preparare il tampone collagenasi. Aggiungere 100 mg di collagenasi in polvere, 1 mL di tampone HEPES 1 M, 500 μL di 100x P188, 50 μL di 1 M CaCl2, 0,05 g di BSA e 48,45 mL di Medium 199. Filtrare sterile la soluzione, aliquotare e conservare a -20 °C.
  2. Produci terreni di coltura cellulare. Combina 500 ml di DMEM, 50 ml di FBS, 5 ml di penicillina-streptomicina e 5 ml di integratore di L-glutammina.

2. Raccolta di depositi di tessuto adiposo bianco da topi

  1. Preparare una piastra da 1 x 10 cm con 200 μL di HBSS per ogni diverso deposito e condizionarla a seconda dei casi e posizionarla sul ghiaccio.
  2. Recuperare gli animali dalla casa degli animali e sopprimere i topi in conformità con le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'istituto. Qui, gli animali sono stati soppressi mediante lussazione cervicale in anestesia profonda.
  3. Pesare e registrare il peso di ciascun topo, se appropriato.
  4. Sterilizzare il topo spruzzando etanolo al 70% per rivestire l'esterno.
  5. Raccogli i cuscinetti di grasso appropriati dal mouse18,19.
    NOTA: Fare attenzione a rimuovere i linfonodi dal deposito sottocutaneo prima di inserire il fazzoletto nella capsula.
  6. Pesare ogni grasso e registrare il peso.
  7. Mettere il cuscinetto di grasso nel piatto preparato da 10 cm sul ghiaccio.

3. Preparazione di espianti di tessuto adiposo bianco

NOTA: Questo passaggio è facoltativo.

  1. Almeno 12 ore prima di iniziare la dissezione, scongelare la matrice della membrana basale (Matrigel) a 4 °C su ghiaccio e raffreddare una scatola di puntali per pipette sterili da 200 μL a 4 °C.
  2. Utilizzando puntali per pipette refrigerati, pipettare 80 μL di matrice della membrana basale al centro di ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti per creare una cupola (Figura 1A). Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, 5% CO2) per 30 minuti per solidificare parzialmente la matrice.
  3. Preparare il tessuto: utilizzando le forbici sterili per dissezione, pesare 0,1 g di tessuto da ciascun campione e metterlo in PBS su ghiaccio.
  4. Con una pinza sterile, incorporare il tessuto pre-pesato nella cupola della matrice parzialmente solidificata. Aggiungere 30 μl di matrice di membrana basale sopra il tessuto incorporato. Rimettere la piastra nell'incubatore per 30 minuti per posizionare il tessuto nella matrice della membrana basale.
    NOTA: L'inclusione del tessuto nella matrice della membrana basale è fondamentale per garantire che il tessuto rimanga in coltura piuttosto che galleggiare. Ciò preserva la salute e la qualità dei tessuti (Figura 1B).
  5. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura (DMEM con il 10% di FBS) a ciascun pozzetto e rimettere nell'incubatore.

4. Trattamento con collagenasi

  1. Calcola la quantità di soluzione di collagenasi necessaria. Vedere la tabella 1.
  2. Preparare la soluzione di collagenasi con DNasi. Aggiungere 0,00017 g di DNasi per 1 mL di soluzione di collagenasi. Vortice per mescolare.
  3. Utilizzando una lama di rasoio, tritare il tessuto adiposo isolato fino a quando il tessuto appare omogeneo (Figura 2A). Trasferire il tessuto macinato in una provetta conica sterile da 50 mL.
    NOTA: Non tritare eccessivamente. La macinazione è completa quando il tessuto appare omogeneo e pastoso. Il tessuto sotto-tritato appare grosso ed eterogeneo e il tessuto sovra-tritato provocherà il rilascio di lipidi liberi (Figura 2B).
  4. Aggiungere la soluzione preparata di collagenasi e DNasi al tessuto adiposo tritato utilizzando i volumi calcolati al punto 4.1. Vorticare alla massima velocità per 7-10 s per amalgamare completamente. Posizionare orizzontalmente le provette coniche da 50 ml in uno shaker impostato a 220 giri/min, 37 °C.
  5. Incubare agitando per 10 minuti, quindi agitare per 5 s e controllare i campioni. I campioni completamente digeriti appariranno omogenei senza grumi visibili o pezzi di tessuto. Se i campioni non sono completamente digeriti, continuare la digestione nell'agitatore, controllando ogni 2 minuti (Figura 2C).
    NOTA: Non digerire eccessivamente. Un tempo eccessivo nella soluzione di collagenasi può provocare la rottura degli adipociti e il rilascio di lipidi.
  6. Utilizzare una pipetta sierologica per far passare il tessuto digerito attraverso un setaccio in una nuova conica da 50 mL. Aggiungere un volume di FBS pari al volume di tessuto + soluzione di collagenasi attraverso il setaccio in un conico per neutralizzare la collagenasi.
    NOTA: Una piccola quantità di tessuto rimarrà nel setaccio dopo il filtraggio.

5. Lavaggio del fazzoletto

NOTA: Completare tutti i passaggi seguenti in una cappa sterile per coltura tissutale.

  1. Preparare 1 provetta da 15 mL con 10 mL di terreno di coltura caldo per ogni condizione.
  2. Centrifugare i tubi dal punto 4.6 a 300 x g per 3 minuti alla temperatura specificata nella Tabella 1.
    NOTA: La temperatura per la centrifugazione deve essere modificata in base al sesso dei topi da cui è stato isolato il tessuto adiposo; queste temperature sono riportate nella Tabella 1.
  3. Assicurarsi che dopo la centrifuga, il tessuto si separi in quattro strati (Figura 3A).
    NOTA: Lo strato più in alto è costituito dai lipidi liberi, il secondo strato è lo strato adipocitario maturo, il terzo strato è costituito dalla collagenasi e dall'FBS e il quarto strato è la frazione vascolare stromale (SVF) che si riversa sul fondo20,21.
  4. Eliminare con cura lo strato superiore di lipidi liberi con una pipetta da 200 μl.
  5. Dopo aver rimosso lo strato superiore, utilizzare una pipetta p1000 con il fondo tagliato per trasferire gli adipociti maturi nella provetta da 15 ml preparata con 10 ml di terreno di coltura (Figura 3B).
    1. Opzionale: per isolare le cellule progenitrici degli adipociti primari (APC), ruotare nuovamente le provette a 300 x g per 10 minuti. Quindi procedere all'isolamento delle cellule progenitrici degli adipociti da parte di Liu et al.22, Cho et al.23 o simili.
  6. Capovolgere delicatamente le provette da 15 ml con gli adipociti maturi 3-5 volte fino a quando lo strato bianco non si è disperso in tutto il terreno.
  7. Lasciare riposare le provette in posizione verticale per 10 minuti alla temperatura indicata nella Tabella 1 per consentire la separazione degli strati di adipocita e del terreno.
  8. Dopo i 10 minuti di riposo, centrifugare le provette a 100 x g per 1 minuto a temperatura ambiente per favorire ulteriormente la separazione degli strati. Dopo la rotazione, i campioni verranno nuovamente separati in quattro strati, come mostrato nella Figura 3A.
  9. Rimuovere ed eliminare lo strato superiore di lipidi liberi con una pipetta.
  10. Utilizzando un ago da 21 G collegato a una siringa da 5 ml, far scorrere l'ago lungo il bordo del tubo fino a quando la parte inferiore dell'ago non è libera dallo strato di adipociti maturi (Figura 3C). Assicurarsi che la parte superiore dell'ago e la parte inferiore della siringa non disturbino lo strato di adipociti maturi.
  11. Tirare lentamente verso l'alto la siringa per rimuovere il terreno di coltura ed eventuali detriti cellulari.
    NOTA: Quando il terreno viene rimosso, assicurarsi che la punta dell'ago sia libera dallo strato di adipociti maturi.
  12. Aggiungere delicatamente 10 mL di terreno di coltura a ciascuna provetta.
  13. Ripetere i passaggi 5.6-5.11. Non aggiungere altri supporti di coltura .
  14. Utilizzando i puntali delle pipette che caricano il gel, far scorrere il puntale della pipetta lungo il bordo della provetta per rimuovere il terreno rimanente da sotto lo strato di adipociti maturi.

6. Imballaggio

  1. Centrifugare le celle a 100 x g per 1 min alla temperatura indicata in Tabella 1. Rimuovere i lipidi liberi (eliminare lo strato di olio sopra le cellule) utilizzando una pipetta. Rimuovere il terreno di coltura sotto gli adipociti utilizzando una punta di caricamento in gel. Fare attenzione a ridurre al minimo l'interruzione dello strato di adipociti (Figura 4).
  2. Ripetere il passaggio 6.1 fino a quando tutti i terreni di coltura e i lipidi liberi sono stati rimossi (in genere 3-5 volte). Il pacco cellulare deve essere di colore bianco senza lipidi liberi visibili sopra le cellule o mezzi sotto le cellule (Figura 4).

7. Impiattamento e saggi funzionali

  1. Placcatura degli adipociti maturi per la coltura cellulare
    1. Rimuovere gli inserti per colture cellulari da una piastra a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale e posizionarli con la membrana rivolta verso l'alto sulla superficie della cappa.
    2. Riempire i pozzetti alternati della piastra con 1 mL di terreno di coltura caldo.
    3. Utilizzando un puntale per pipetta p200 tagliato, posizionare 30 μl di adipociti maturi impaccati dal passaggio 6.2 sulla parte superiore di un inserto transwell (Figura 5A, B).
    4. Prelevare e capovolgere con cautela l'inserto del pozzetto e posizionarlo in un pozzetto preriempito nella piastra a 24 pozzetti (Figura 5A). Posizionare con cautela la piastra nell'incubatrice impostata a 37 °C con il 5% di CO2.
      NOTA: Gli adipociti correttamente imballati dovrebbero formare uno strato opaco senza goccioline lipidiche libere chiare visibili se visti dall'alto (Figura 5C).
    5. Cambia il terreno sugli adipociti maturi ogni 2-7 giorni per un massimo di 14 giorni.
      1. Per rimuovere il terreno dai pozzetti, tenere il pozzetto in posizione e utilizzare una pipetta p200 per rimuovere con cautela il terreno attraverso le piccole aperture sul lato dell'inserto del pozzetto (Figura 5D).
      2. Una volta rimosso il terreno, tenendo ancora il pozzetto in posizione, aggiungere molto lentamente 1 mL di terreno alla parete laterale del pozzetto.
        NOTA: Fare attenzione ad aggiungere e rimuovere i file multimediali molto lentamente. Gli adipociti possono facilmente staccarsi dalla membrana se il terreno viene cambiato rapidamente.
  2. Dosaggio della lipolisi
    1. Espianti di tessuto adiposo su piastra come descritto al passaggio 3.4 o adipociti maturi come descritto al passaggio 7.1.
      NOTA: Le cellule o i tessuti devono essere coltivati in terreni privi di rosso fenolo per almeno 24 ore prima di eseguire il test di lipolisi.
    2. Preparazione della soluzione: Preparare una soluzione di BSA al 5% in DMEM (senza rosso fenolo) sciogliendo 5 g di BSA in 100 ml di DMEM. Capovolgere delicatamente per unire fino a quando la BSA non è completamente sciolta.
      1. Preparare soluzioni di lavoro per i mezzi di controllo e stimolazione. Per i supporti di controllo, combinare il 5% di supporti BSA DMEM con il veicolo. Per i terreni di stimolazione, combinare il 5% di terreni BSA DMEM con 5 μM di CL-316,243. Riscaldare il mezzo di controllo e stimolazione a 37 °C prima dell'uso.
    3. Rimuovere il terreno dai pozzetti e lavare con 1 mL di DPBS caldo. Riempire i pozzetti con 500 μl per pozzetto di mezzi di controllo o di stimolazione. Incubare a 37 °C, 5% CO2.
    4. A 1 ora, 2 ore, 4 ore e 24 ore dopo l'inizio del test di lipolisi, raccogliere 100 μl di terreno da ciascun pozzetto in una provetta da microcentrifuga e sostituirlo con 100 μl del mezzo di controllo o di stimolazione appropriato.
      NOTA: A questo punto i campioni possono essere conservati a -20 °C.
    5. Eseguire il test colorimetrico del glicerolo utilizzando un kit di glicerolo libero disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) o simili.
      1. Preparare i reagenti come indicato nel kit.
      2. Scongelare i campioni e miscelarli delicatamente mediante pipettaggio.
      3. Preparare una curva standard con una diluizione seriale a sette punti e 2 volte utilizzando la soluzione standard di glicerolo.
      4. Trasferire 25 μl di campione o standard in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo trasparente.
      5. Aggiungere 100 μl di reagente libero per il dosaggio del glicerolo a ciascun pozzetto contenente campione o soluzione standard.
      6. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi leggere l'assorbanza a 540 nm (Figura 6A-D).
  3. Imaging
    1. Preparare i vetrini di imaging. Per preparare i vetrini, rimuovere lo strato di carta di supporto da ciascun distanziatore di imaging e posizionarlo sul vetrino. Due distanziatori di imaging possono essere posizionati fianco a fianco su ciascun vetrino.
    2. Utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl tagliato, trasferire 30 μl di adipociti impaccati dalla fase 6.2 in una provetta per microcentrifuga.
    3. Preparare la miscela colorante. Preparare 200 μl per campione di soluzione colorante con membrana plasmatica a 5 μg/mL e Hoechst a 4,5 μg/mL in PBS. Aggiungere la miscela di coloranti ai campioni e agitare delicatamente.
    4. Colorare i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente. Proteggere i campioni dalla luce.
    5. Al termine della colorazione, lavare i campioni. Aggiungere 500 μl di PBS a ciascun campione e agitare delicatamente per amalgamare. Lasciare riposare per 5 min. Centrifugare a 100 x g per 1 minuto, quindi rimuovere il terreno da sotto le cellule con un puntale per pipetta di caricamento del gel.
    6. Prepara le diapositive. Rimuovere la pellicola di plastica trasparente dal lato superiore dei distanziatori di imaging per esporre lo strato appiccicoso.
    7. Aggiungere 500 μl di PBS alla provetta di adipociti colorati e mescolare delicatamente.
    8. Rapidamente, in modo da non dare il tempo agli adipociti maturi di risalire in superficie, utilizzare una punta di pipetta p200 tagliata per posizionare 35 μl di adipociti all'interno del distanziatore sul vetrino di imaging.
    9. Posizionare un vetrino coprioggetto sul distanziatore.
    10. Procedere immediatamente all'imaging (Figura 6C). Un ritardo nell'imaging può provocare sanguinamento del marcatore di membrana.

Risultati

Come mostrato nella Figura 2, una corretta macinazione (Figura 2B) e digestione (Figura 2C) sono importanti per l'isolamento degli adipociti maturi intatti. La macinazione e la digestione insufficienti possono portare a una bassa resa di adipociti maturi a causa di una separazione inadeguata dal tessuto connettivo. Visivamente, questo può essere osservato con tessuto filamentoso che rimane dopo la macinazione e grumi visibili nella soluzione di collagenasi. Inoltre, l'eccessiva macinazione e digestione eccessiva provocano anche una bassa resa a causa dello scoppio degli adipociti maturi. Visivamente, ciò si traduce nella perdita dello strato bianco opaco e nell'accumulo di uno strato lipidico ampio, chiaro e libero. Livelli inappropriati di macinazione o digestione si tradurranno in uno scarso isolamento degli adipociti.

Una corretta preparazione e digestione del tessuto adiposo comporterà la separazione del tessuto in quattro strati distinti, come si vede nella Figura 3. È inevitabile un certo scoppio degli adipociti con conseguente rilascio di lipidi liberi; Tuttavia, una corretta macinazione e digestione garantirà una rottura minima degli adipociti. Lo strato lipidico libero rimanente e il terreno saranno rimossi durante l'impacchettamento degli adipociti (Figura 4). Il corretto impacchettamento degli adipociti è essenziale per l'isolamento efficiente degli adipociti maturi. Eventuali lipidi o terreni liberi rimanenti risulteranno in uno scarso isolamento e avranno un impatto negativo sui saggi funzionali a valle, come la piastra, la lipolisi e l'imaging cellulare.

Questo protocollo genera una preparazione pulita di adipociti maturi. I test di imaging cellulare e lipolisi possono essere eseguiti per valutare la funzione cellulare e dimostrare che gli adipociti maturi mantengono la funzione dopo l'isolamento e dopo la coltura per un massimo di due settimane. Il test di lipolisi indica che gli adipociti maturi mantengono la capacità di rispondere alla segnalazione cellulare attraverso il rilascio di glicerolo libero dopo la stimolazione del recettore adrenergico β-3 (Figura 6A, B). Questa capacità viene mantenuta anche dopo 2 settimane in coltura ed è altamente paragonabile all'attività di lipolisi degli espianti di tessuto adiposo coltivati per 24 ore (Figura 6C, D). Gli adipociti di scarsa qualità mostreranno una lipolisi attenuata. L'imaging cellulare degli adipociti isolati mostra adipociti maturi uniloculare rotondi e intatti contenenti una singola grande gocciolina lipidica. Gli isolamenti di adipociti di scarsa qualità mostreranno principalmente grandi goccioline di olio extracellulari indicative di adipociti scoppiati.

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Figura 1: Inclusione di espianti di tessuto adiposo. (A) Immagine della cupola della matrice della membrana basale parzialmente solidificata prima dell'inclusione del tessuto. (B) Immagini rappresentative di un incorporamento improprio e corretto dei tessuti. L'inclusione impropria è visibile poiché il tessuto sembra galleggiare parzialmente o completamente sopra la cupola. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Schema della corretta macinazione e digestione del tessuto adiposo. (A) Rappresentazione schematica delle fasi di macinazione e digestione dei tessuti 4.2-4.6. (B) Immagini rappresentative di tessuto sotto, ottimale e sovra-tritato. Il tessuto sotto-tritato ha grandi pezzi che mantengono la loro forma originale. Il tessuto tritato eccessivamente provoca un aumento visibile dei lipidi liberi che circondano il tessuto, che appaiono chiari e oleosi. (C) Immagini rappresentative di tessuto sotto, ottimale e sovradigerito. Il tessuto sottodigerito contiene pezzi di tessuto intero rimasti nella soluzione. Il tessuto eccessivamente digerito mostra un grande strato lipidico libero che si separa rapidamente dalla soluzione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Separazione degli strati di tessuto adiposo digerito. (A) Immagine schematica e rappresentativa dei layer presenti dopo il passaggio 5.3. (B) Uso di un puntale di pipetta tagliato per rimuovere lo strato di adipociti maturi dalla provetta conica da 50 mL. (C) Tecnica e posizionamento corretti dell'ago e della siringa per rimuovere il terreno di coltura da sotto lo strato di adipociti maturi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Impacchettamento sequenziale di adipociti maturi. Immagini sequenziali dell'impacchettamento degli adipociti maturi. Gli strati di lipidi liberi, adipociti e terreni sono etichettati. Dopo ogni centrifuga, i lipidi e i terreni liberi vengono rimossi. Questo viene ripetuto fino a quando nessun mezzo o lipidi liberi si separa dagli adipociti dopo una centrifuga. L'immagine finale è rappresentativa di adipociti maturi ben imballati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Placcatura e coltura di adipociti maturi. (A) Schema della placcatura degli adipociti maturi. Utilizzando una punta di pipetta p200 tagliata, gli adipociti impaccati vengono posizionati sulla membrana di un foglietto illustrativo per colture cellulari. L'inserto viene quindi invertito in pozzetti preriempiti di terreno di coltura. (B) Un'immagine rappresentativa della placcatura di adipociti maturi raffigurante la punta della pipetta tagliata che deposita gli adipociti sull'inserto del pozzetto. (C) Schemi e immagini rappresentative di adipociti correttamente impacchettati e scarsamente impacchettati placcati con pozzetti, visti dall'alto dei pozzetti. Gli adipociti correttamente impacchettati appaiono bianchi e opachi, mentre gli adipociti scarsamente impacchettati provocano la formazione di goccioline lipidiche chiare. (D) Schema della tecnica utilizzata per modificare i terreni di coltura. Un puntale per pipetta p200 viene utilizzato per rimuovere con cura il fluido attraverso le aperture nella parete laterale dell'inserto del vano trans. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Imaging di adipociti maturi e test di lipolisi. (A,B) Rilascio di glicerolo da adipociti maturi sottocutanei (A) e viscerali (B). Gli adipociti sono stati isolati da topi maschi C57BL/6 di 16 settimane alimentati con una dieta a base di cibo normale. 30 μL di adipociti sono stati piastrati come descritto nella fase 7.1 e coltivati per 1 o 10 giorni. Gli adipociti sono stati trattati con 5 μM di CL-316.243 per 1 ora, 2 ore e 4 ore e i surnatanti sono stati raccolti e analizzati per il glicerolo libero. (C, D) Rilascio di glicerolo da espianti di tessuto adiposo sottocutaneo (C) e viscerale (D). Il tessuto adiposo è stato isolato da topi femmina C57BL/6 di 18 settimane alimentati con una dieta a base di cibo normale. 0,1 g di espianti di tessuto adiposo sono stati piastrati come descritto nelle fasi 3.1-3.4 e coltivati per 24 ore. Gli adipociti sono stati trattati con 5 μM di CL-316.243 per 1 ora, 2 ore e 4 ore e i surnatanti sono stati raccolti e analizzati per il glicerolo libero. N = 3 repliche tecniche per A-D. Tutti i dati sono medi ± deviazione standard. (E) Immagini rappresentative di adipociti maturi isolati sottocutanei e viscerali. Gli adipociti sono stati isolati da topi maschi C57BL/6J di 16 settimane alimentati con una dieta a base di cibo normale. Gli adipociti sono stati colorati con la colorazione della membrana plasmatica (rosso) e con la colorazione dei nuclei di Hoechst (blu). Barre di scala: 50 μm; ingrandimento: 60x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

SessoDietaDepositoDifficoltà di tritaturaCollagenasi: Rapporto tissutaleTempo di digestione suggerito (min)Temperatura di centrifuga.Temp. di lavaggio
FemminaChow normaleSottocutaneoDuro2:112RT37 °C
VisceraleMedio1:18RT37 °C
Dieta ricca di grassiSottocutaneoFacile1:18RT37 °C
VisceraleFacile1:18RT37 °C
MaschioChow normaleSottocutaneoDuro2:1144 °CRT
VisceraleMedio1:1104 °CRT
Dieta ricca di grassiSottocutaneoFacile1:1104 °CRT
VisceraleFacile1:1104 °CRT

Tabella 1: Sesso, deposito e modifiche specifiche della dieta. La difficoltà di macinazione di ciascun tessuto, descritta come "Facile", "Media" o "Difficile" in relazione ad altri depositi. Si noti che il tempo di macinazione effettivo varia a seconda del ricercatore e del tessuto. Collagenasi: Rapporto tissutale indicato come volume (mL) di soluzione di collagenasi + DNasi preparata al punto 4.1 rispetto al peso del tessuto (g). Il tempo di digestione è una stima approssimativa, ma il tempo di digestione effettivo varia in base al macinato e al tessuto. I ricercatori dovrebbero valutare la digestione come descritto nel protocollo. La temperatura di centrifuga e la temperatura di lavaggio differiscono tra topi maschi e femmine. RT indica la temperatura ambiente.

Discussione

Gli adipociti primari sono notoriamente difficili da isolare e coltivare perché si rompono facilmente e le loro grandi dimensioni precludono l'uso di comuni strumenti di isolamento delle cellule primarie come la citometria a flusso. Il protocollo qui descritto produce adipociti maturi puliti e funzionali, che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni a valle. È importante sottolineare che questo protocollo consente la separazione degli adipociti maturi dagli altri detriti cellulari e dallo strato lipidico libero, consentendo efficaci test di imaging, coltura e lipolisi. Il protocollo può essere facilmente combinato con i protocolli pubblicati22,23 per l'isolamento della frazione vascolare stromale e delle APC. Questo protocollo descrive anche una procedura per la preparazione e la coltura di espianti di tessuto intero dal tessuto adiposo, che può essere utilizzata per applicazioni a valle come i saggi di lipolisi e la raccolta di fattori secreti dall'intero tessuto adiposo.

Gli aspetti critici includono la corretta macinazione, digestione e rimozione dello strato lipidico libero. Per garantire una corretta macinazione, è importante monitorare attentamente l'aspetto visivo del tessuto durante tutto il processo. Il tempo e lo sforzo necessari per ottenere un trito ottimale del tessuto variano a seconda del deposito di tessuto adiposo, degli interventi dietetici (come una dieta ricca di grassi) e del ricercatore. Se necessario, possono essere incorporati altri strumenti per tritare, come le forbici, ma questo aspetto non è stato esplorato qui. Da notare che l'eccessiva macinazione dovrebbe essere evitata in quanto rompe gli adipociti, il che non solo diminuisce la resa immediata, ma diminuisce anche la resa totale e la qualità degli adipociti a causa dell'effetto deleterio che lo strato lipidico libero ha sugli adipociti rimanenti. Una corretta digestione, simile a un vero e proprio trito, dipenderà dal deposito di tessuto adiposo, dagli interventi dietetici, dall'età dei topi, ecc. L'aggiunta di DNasi alla collagenasi aiuta a prevenire l'aggregazione degli adipociti durante la digestione, che può derivare da detriti cellulari. Il tempo di digestione dei tessuti è, quindi, molto variabile. Le stime fornite per i tempi di digestione servono come guida, che si trova nella Tabella 1. Tuttavia, il modo migliore per garantire che i tessuti siano digeriti correttamente è ispezionare visivamente il tessuto durante tutto il processo e come descritto nel protocollo. Le diverse temperature di centrifugazione e lavaggio descritte nella Tabella 1, suggerite in base al sesso, sono essenziali per la corretta separazione degli adipociti maturi sia dallo strato lipidico libero che dagli altri detriti cellulari e SVF; L'uso di temperature alternative può provocare la perdita degli adipociti maturi a causa dell'aggregazione e dello scoppio degli adipociti.

La rimozione dello strato lipidico libero in ogni fase è di fondamentale importanza e in caso contrario si presenteranno complicazioni a valle per la piastra, l'imaging e il test di lipolisi. Inoltre, la presenza prolungata dello strato lipidico libero durante la procedura provocherà un'ulteriore morte degli adipociti a causa della lipotossicità, con un impatto drammatico sulla resa e sulla qualità complessive. Sebbene sia generalmente auspicabile massimizzare l'efficienza dell'isolamento degli adipociti maturi, la rimozione dello strato lipidico libero, anche a spese di alcuni adipociti maturi, comporterà un aumento complessivo della resa degli adipociti maturi alla fine del protocollo.

Le limitazioni della procedura includono il numero di campioni. A causa del rigore e del tempo impiegato per la rimozione del terreno e dello strato lipidico libero, la procedura è generalmente limitata a sei campioni alla volta. L'elaborazione di un numero significativamente maggiore di campioni comporterà l'esposizione degli adipociti primari ai lipidi liberi per troppo tempo e ridurrà la resa complessiva. Tuttavia, il personale aggiuntivo può consentire un aumento del numero di campioni. Il tempo che intercorre tra la macinazione e il test funzionale è fondamentale, in quanto ritardi eccessivi nella rimozione del terreno e dello strato lipidico libero provocano un ulteriore bursting degli adipociti maturi. Il protocollo è ulteriormente limitato nella capacità di separare le sottopopolazioni di adipociti maturi.

Gli attuali metodi per studiare gli adipociti maturi si basano principalmente sull'isolamento delle APC e sulla successiva differenziazione ex vivo di queste cellule. Ulteriori metodi, tra cui il modello organ-on-a-chip e le co-colture di pozzi trans, hanno iniziato a essere sviluppati18,24. Tuttavia, è stato dimostrato che questi adipociti differenziati ex vivo sono trascrizionalmente e morfologicamente distinti dagli adipociti maturi nel tessuto adiposo17. Morfologicamente, gli adipociti differenziati ex vivo sono multiloculare, mentre gli adipociti isolati in vivo sono uniloculare. Questo protocollo è stato modificato e ottimizzato rispetto ai rapporti precedenti17,25 per isolare e coltivare con successo adipociti maturi da un minimo di 0,5 g di tessuto adiposo rispetto ad altri protocolli che richiedono almeno 5 g di tessuto adiposo25 . Infine, questo studio mirava a illustrare visivamente il completamento con successo dei passaggi chiave del protocollo al posto dei tempi concreti, delle temperature di centrifugazione e delle quantità di collagenasi, sebbene le linee guida siano incluse nella Tabella 1. Questi parametri devono essere regolati in base a fattori come il deposito di tessuto adiposo, il sesso e l'adiposità dell'animale, che possono influire sull'efficienza della digestione e sulla separazione pulita degli adipociti maturi in questo protocollo.

In totale, la procedura dura 3-4 ore, a seconda del numero di topi raggruppati e del numero di singoli campioni di tessuto adiposo. Si prevede che la capacità di coltivare e valutare il ruolo funzionale degli adipociti maturi consentirà molte applicazioni a valle per lo studio della biologia degli adipociti stessi (ad esempio, metabolismo, utilizzo dei nutrienti e tracciamento) e l'interazione degli adipociti con altri tipi di cellule, come APC, cellule tumorali e cellule del sistema immunitario.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere il sostegno finanziario di 5 For The Fight e Huntsman Cancer Institute (KIH), della V Foundation for Cancer Research (KIH) e di DK133455 (KIH). Schemi del protocollo realizzato con Biorender. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Stephanie Giagnocavo e il Cell Imaging Core dell'Università dello Utah per l'aiuto nell'imaging e Mark Lee per il feedback sul manoscritto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
100x Poloxamer 188 soluzioneSigmaP5556-100mL
15 mL conicoCellstar188261
21 G AgoBD305165
5 mL SiringaBD309646
50 mLConica Cellstar227261
6,5 mm Transwell con 0,4 &; m Inserto a membrana in policarbonatoCorning3413
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
CaCl2SigmaC1016-500gm
CellMask Plasma Membrane StainsThermo Fisher ScientificC10045
CL 316243 sale disodicoTocris1499
Collagenasi in polvereSigmaC6885
DMEMGibco11995-040
DMEM no feonol RedGibcoA14430-01
DNase ISigma-Aldrich10104159001
Siero fetale bovino (FBS)GibcoA56708-01
Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold SlidesFisher scientifico
Punta per pipetta con caricamento in gelFisher scientific02-707-181
Integratore GlutaMAXKit
AbcamAB133130
Soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS)Gibco14025-092
HEPES BufferSigma83264-100ml-F
Heraeus Megafuge 16R CentrifugaThermo Scientific 
Hoechst 33342 SoluzioneThermo Fisher Scientific62249
Mini agitatore per incubazioneVWR12620-942
Medio 199Sigma-AldrichM4530
Occhiali di copertura per microscopioVWR16004-302
PBSGibco10010023
Penicillina-StreptomicinaGibco15140-122
Distanziatori per imaging SecureSealGrace Biolabs654006
Seive (filtro per cocktail a maglia fine SteeL)OXO3112000https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html
poro 1518848 per il dosaggio del glicerolo 35050061 75004271

Riferimenti

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