Articolo metodologico

Misurazione della citometria a flusso ad alto rendimento del meccanotipo cellulare basata sulla rottura e l'erogazione di sonde di tensione del DNA nelle cellule

DOI:

10.3791/67852

⸱

13 giugno 2025

 , 
1College of Biological Sciences, University of Minnesota

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo metodo misura la propensione di una cellula a rompere i DNA-duplex immobilizzati che presentano il ligando per riportare le forze di trazione cellulare relative. Gli oligo fluorescenti rotti vengono erogati nella cellula e analizzati mediante citometria a flusso, registrando la storia meccanica della cellula. Ciò consente la misurazione ad alto rendimento della generazione di forza cellulare nel contesto della meccanofenotipizzazione cellulare.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le forze meccaniche guidano molti processi cellulari critici e il fenotipo meccanico cellulare, o meccanotipo, è interrotto in molte malattie. Il metodo più utilizzato per quantificare le forze cellulari è la microscopia della forza di trazione, che tradizionalmente cattura le forze che le cellule esercitano sull'ambiente circostante mediante microscopia ad alta risoluzione di cellule che deformano substrati elastici contenenti perle fluorescenti, deviando micropost o alterando la conformazione di sensori di tensione molecolare immobilizzati. Presentiamo qui un metodo ad alto rendimento per misurare le forze di trazione cellulare relative utilizzando sonde di tensione del DNA consolidate e quantificate tramite citometria a flusso. Questo metodo prevede cinque passaggi complessivi descritti di seguito. In primo luogo, l'espressione e la purificazione del ligando dell'integrina ad alta affinità, l'echistatina, fuso con un HUH-tag che lega il DNA; in secondo luogo, preparazione delle sonde duplex di DNA contenenti reporter e ligando; terzo, preparazione della superficie e immobilizzazione delle sonde; quarto, esecuzione dell'esperimento "Rupture and Deliver" del tensiometro-cavo e della lettura del flusso. Infine, descriveremo l'analisi dei dati e l'interpretazione dei risultati sperimentali.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le forze meccaniche guidano molti processi cellulari critici, dalla migrazione1 alla differenziazione delle cellule staminali2 alla capacità di una cellula T di legarsi ed essere attivata dalla corretta cellula presentante l'antigene3. Le variabili meccaniche sono disregolate nella malattia, con conseguenti differenze misurabili nel fenotipo meccanico cellulare, o meccanotipo, delle cellule 4,5. Il meccanotipo è un termine generico per le proprietà meccaniche di cellule e tessuti e può includere parametri come contrattilità, migrazione, adesione e deformabilità. La rigidità cellulare o tissutale è l'aspetto più comune del meccanotipo misurato in quanto può essere misurato ad alta produttività. Ad esempio, le cellule tumorali sono spesso più rigide delle cellule normali mentre le cellule metastatiche sono spesso più cedevoli 6,7. La generazione di forza da parte delle cellule è un aspetto importante del meccanotipo alterato nella malattia8 perché sonda specifiche interazioni cellula-ambiente. La microscopia della forza di trazione è il metodo più comune per misurare la generazione di forza cellulare e prevede la placcatura di cellule su substrati elastici deformabili incorporati con perline fluorescenti o su array di microperni e il tracciamento dei cambiamenti nel movimento del cordone o nella deflessione del perno per calcolare le forze esercitate dalle cellule. I sensori di tensione molecolari sono stati utilizzati anche per misurare le forze di trazione e offrono il vantaggio della sensibilità a piccole grandezze di forza e della misurazione delle forze generate da specifiche coppie ligando-recettore 9,10. Tuttavia, la misurazione delle forze cellulari con i tradizionali sensori TFM e di tensione molecolare si basa sull'imaging ad alta risoluzione, limitando la produttività della misurazione.

Di recente abbiamo adattato le sonde di tensione DNA-duplex in una lettura ad alto rendimento della generazione di forza cellulare nel contesto della meccanofenotipizzazione cellulare11 (Figura 1). In breve, i duplex di DNA adattati dalle sonde TGT (Tens-gauge-Tether)12 ampiamente utilizzate vengono immobilizzati nei pozzetti di piastre a 96 pozzetti tramite la chimica biotina-neutravidina del filamento "ancora"13. La forza di rottura richiesta dei duplex TGT può essere regolata variando la posizione della biotina sul filo di ancoraggio, il che altera la geometria del duplex risultando in una conformazione di decompressione a bassa forza di rottura (Figura 2A) o in una conformazione di taglio ad alta forza di rottura (Figura 2B). Il filamento di ancoraggio contiene biotina e un quencer di fluorescenza, mentre il filamento di DNA "ligando" contiene una sonda fluorescente e un ligando che riconosce un recettore della superficie cellulare coinvolto nel meccanosensing, come un'integrina. Il ligando è legato in modo covalente al DNA (Figura 3) tramite l'uso di un tag di fusione di collegamento al DNA chiamato HUH-tag fuso al ligando14,15. Gli HUH-tag sono piccoli domini endonucleasi HUH coinvolti nella replicazione virale e in altri processi che riconoscono una sequenza/struttura di 9 bp di DNA a singolo filamento, la intaccano e formano un addotto covalente di fosfotirosina all'estremità 5' del DNA intaccato.

Le cellule placcate sopra queste sonde si legano al ligando e rompono una percentuale delle sonde proporzionale alle forze che generano. Il filamento di ligando fluorescente legato al suo recettore viene successivamente consegnato nella cellula. Pertanto, la storia meccanica delle cellule viene registrata nelle cellule di interesse attraverso l'entità della loro fluorescenza. La fluorescenza può essere quantificata utilizzando la citometria a flusso. Chiamiamo questo metodo Rupture and Deliver-TGTS o RAD-TGT. Questo metodo non solo misura la fluorescenza e, quindi, la forza relativa generata da migliaia di cellule contemporaneamente, ma anche la lettura della citometria a flusso offre il potenziale di ordinare le cellule in base al loro meccanotipo, consentendo letture -omiche a valle, nonché CRISPR-KO o screening farmacologici che potrebbero identificare geni o farmaci che alterano il meccanotipo cellulare.

Nel protocollo seguente, dimostriamo come preparare ed eseguire un esperimento RAD-TGT. Evidenzieremo l'espressione e la purificazione di un tipo di HUH noto come WDV (dal virus nano del grano) da solo per fungere da controllo negativo e fuso con l'echistatina, un ligando che lega strettamente una famiglia di recettori di adesione che trasducono la forza tra la cellula e l'ambiente noti come integrine leganti RGD, per fungere da condizione sperimentale. Da questo, dimostreremo come preparare i RAD-TGT per l'uso sperimentale. Spiegheremo come procedere con gli esperimenti e come analizzare i dati risultanti. Evidenzieremo anche un'applicazione dei RAD-TGT misurando come un inibitore di ROCK altera le forze mediate dalle integrine nelle cellule CHO-K1 (Figura 4). In sintesi, speriamo che questo protocollo serva come ingresso alla meccanobiologia indipendentemente dall'esperienza precedente; Il campo è nella sua fase nascente e tutti i background sono essenziali per un'ulteriore comprensione.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Espressione e purificazione dell'HUH

  1. Trasformare Escherichia coli con il plasmide WDV (± Echistatin), circa 1,5 μL di plasmide ~50 ng/μL per trasformazione, e crescere su piastre di agar ampicillina.
  2. Inoculare 5 ml di LB con una singola colonia e crescere per una notte a 37 °C.
  3. Inoculare 1 L di LB con la coltura notturna e crescere fino a quando OD600 raggiunge ~0,8.
  4. Abbassare la temperatura a 18 °C, indurre con 500 μM di isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e incubare durante la notte.
  5. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 3.750 × g per 30 min. Risospendere il pellet con 40 mL di tampone di lisi (300 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA).
  6. Lisi le celle con sonicazione 3 x 90 s su ghiaccio al 70% del ciclo di lavoro, potenza 7. Centrifugare a 24.000 × g per 30 minuti a 4 °C e versare il surnatante in una nuova provetta da 50 ml.
  7. Mettere l'impasto di resina Ni-NTA in una provetta conica da 15 mL (1 mL di sospensione di perline/L di coltura), centrifugare a 700 × g per 2 minuti e rimuovere il surnatante.
  8. Aggiungere 6 ml di acqua alla resina e ripetere il processo di lavaggio al punto 1.7.
  9. Ripetere il lavaggio due volte con il tampone di lavaggio (300 mM di NaCl, 50 mM di Tris [pH 7,5], 1 mM di EDTA, 20 mM di imidazolo) al posto dell'acqua. Risospendere le perle in 5 mL di tampone di lavaggio.
  10. Aggiungere l'impasto liquido delle perle (passaggio 1.9) alle celle lisate (passaggio 1.6) e mescolare accuratamente. Ruotare le cellule lisate e le perle per almeno 1 ora a 4 °C.
    NOTA: Per il resto di questo protocollo, non lasciare mai asciugare la resina e raccogliere tutti i campioni che scorrono attraverso la colonna.
  11. Versare la miscela su una colonna da 20 mL e raccogliere il flusso. Lavare la colonna con 4 x 25 mL di tampone di lavaggio.
  12. Eluire con 1 x 10 mL di tampone di eluizione (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 7,5], 1 mM EDTA, 250 mM Imidazolo) in una provetta fresca da 15 mL, raccogliendo separatamente l'eluizione precoce e tardiva (l'eluizione precoce è il primo 1 mL, l'eluizione tardiva è l'ultimo 1 mL).
  13. Analizzare tutte le frazioni raccolte tramite elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) per assicurarsi che l'HUH sia stato raccolto durante l'eluizione (vedere la Figura S1 supplementare). Per ottenere i migliori risultati, caricare un gel al 4-20% ed eseguirlo per 45 minuti a 35 W e 200 V.
  14. Aggiungere la proteina eluita nel tubo di dialisi e incubare per una notte nel tampone di dialisi (lo stesso del tampone di lisi) a 4 °C. Per rimuovere l'HIS-tag, aggiungere ULP1 senza agente riducente direttamente alla proteina eluita prima di inserire la proteina nel tubo di dialisi.
  15. La mattina successiva, preparare la resina Ni-NTA come descritto nei passaggi 1.7-1.9 e incubare con la proteina dialisa. Versare la miscela di proteine e resina Ni-NTA in una colonna e raccogliere il flusso. Lavare la colonna con 10 mL di tampone per dialisi e raccogliere l'eventuale flusso.
  16. Valutare la frazione raccolta su SDS-PAGE seguendo le impostazioni di cui sopra per assicurarsi che la proteina sia presente e concentrarsi alla concentrazione desiderata utilizzando un filtro ultracentrifugo da 15 mL con un cutoff del peso molecolare di 10 kDa (vedere la Figura S1 supplementare).
    NOTA: La concentrazione proteica finale ideale è compresa tra 40 μM e 100 μM.

2. Preparazione RAD-TGT

  1. Assemblare duplex in un rapporto molare 1,1:1 tra il trefolo di ancoraggio (con quencher) e il trefolo di legante (con fluoroforo) a una concentrazione finale di 40 μM di filamento di legante in una soluzione di 10 mM di Tris (pH 7,5), 50 mM di NaCl e 1 mM di EDTA.
  2. Ricottura mediante incubazione a 98 °C per 5 min seguita da raffreddamento a temperatura ambiente per 1 h; Proteggere dalla luce.
    NOTA: I campioni a basso volume evaporano facilmente e possono essere difficili da recuperare completamente. Preparare un volume maggiore del necessario.
  3. Far reagire i duplex ricotti con HUH (utilizzando la concentrazione del filamento meno abbondante durante la ricottura; in questo caso, il filamento del ligando) in un rapporto molare 1:2 a una concentrazione finale di 10 μM duplex e 20 μM HUH in una soluzione contenente 1 mM di MnCl2, 50 mM di HEPES (pH 8), 50 mM di NaCl.
  4. Incubare la reazione per 30 minuti a 37°C in un termociclatore o in un blocco termico protetto dalla luce. Dopo l'incubazione, togliere dal fuoco e utilizzare un minifugo da banco per centrifugare i TGT ora assemblati. Placcare immediatamente i TGT o conservarli a 4 °C al buio.

3. Preparazione della superficie

  1. Immediatamente dopo l'apertura di una piastra inferiore in vetro a 96 pozzetti, coprire tutti i pozzetti con un foglio adesivo per piastre PCR per preservare i pozzetti inutilizzati per un uso successivo. Utilizzare una lama di rasoio per ritagliare la pellicola sui pozzetti di interesse (preferibilmente pozzetti non bordi) e aggiungere 100 μl di PBS freddo ai pozzetti desiderati.
    NOTA: Una volta aggiunto il liquido ai pozzetti, non lasciare che i pozzetti si asciughino. Se si verifica l'essiccazione, l'adsorbimento non specifico di biomolecole sulla superficie avrà un impatto negativo sui dati. Conservare continuamente 100 μL di volume in eccesso nel pozzetto per evitare che si secchi.
  2. Aggiungere 200 μl di PBS freddo ai pozzetti, pipettare delicatamente la miscela 2-5 volte e rimuovere 200 μl di PBS. Ripetere per un totale di tre lavaggi.
    NOTA: Quando si aggiunge e si rimuove il liquido dai pozzetti, tenere la punta della pipetta sul bordo del pozzetto a un angolo di 45° per evitare di disturbare la superficie. Eseguire questa operazione per tutte le manipolazioni della piastra, ad eccezione delle celle di placcatura.
  3. Per i pozzetti sperimentali, preparare una soluzione di 0,1 mg/mL di BSA biotinilato in PBS e aggiungere 80 μL della soluzione ai pozzetti desiderati. Per i pozzetti di controllo, preparare la stessa soluzione con l'aggiunta di 18,75 μg/mL di fibronectina e aggiungere 80 μL ai rispettivi pozzetti. Pipettare, mescolare delicatamente tutti i pozzetti utilizzati, posizionare il coperchio sulla piastra e coprire con un foglio di alluminio. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  4. Rimuovere 80 μl di volume dai pozzetti e lavare i pozzetti ripetendo il passaggio 3.2. Aggiungere 80 μL di 0,1 mg/mL di neutravidina in soluzione di PBS nello stesso modo del passaggio 3.3.
  5. Dopo l'incubazione, rimuovere 80 μl di volume dai pozzetti e ripetere il passaggio 3.2. Diluire i TGT assemblati (fase 2 di preparazione RAD-TGT) a 0,1 μM in PBS e 80 μL di soluzione nei pozzetti in modo simile al passaggio 3.3. Coprire i pozzetti con una pellicola adesiva e conservare al buio a 4 °C o proteggere dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 1 ora prima di procedere con gli esperimenti.
    NOTA: Si consiglia di considerare il passaggio 3.5 come un punto di arresto e di attendere fino al giorno successivo per procedere con gli esperimenti.

4. Protocollo sperimentale RAD-TGT

  1. Dopo che i TGT hanno avuto il tempo sufficiente per aderire, lavare i pozzetti (vedere passaggio 3.2) 3 volte con PBS, seguiti da due lavaggi con terreno privo di siero. Lasciare il terreno nei pozzetti dopo il lavaggio finale. Aggiungere 200 μl di PBS ai pozzetti periferici per mitigare eventuali effetti sui bordi e trasferire la piastra in un incubatore a 37 °C per preriscaldare la piastra.
  2. Recuperare le cellule di interesse a ~80% di confluenza e aspirare il terreno seguito dall'aggiunta e dall'aspirazione di PBS per lavare le cellule. Aggiungere un volume adeguato di tripsina e porre la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 °C fino a quando le cellule non si dissociano (~5-10 min).
  3. Una volta dissociate le cellule, aggiungere alla piastra il volume originale del terreno cellulare completo utilizzato per mantenere le cellule e risospendere con una pipetta sierologica. Aggiungere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
  4. Centrifugare le celle a 300 × g per 4 minuti, aspirare il terreno e risospendere il pellet in PBS. Ripetere la centrifugazione e l'aspirazione, quindi risospendere in 5 mL di terreno privo di siero e ripetere la centrifugazione e l'aspirazione. Risospendere le cellule in ~2 mL di terreno privo di siero.
  5. Determinare la densità delle cellule risospese e regolare la concentrazione come desiderato.
    NOTA: Il nostro obiettivo è quello di placcare ~15.000 cellule per pozzetto, quindi prepariamo le cellule a una concentrazione di 150.000 cellule/mL, che consente di placcare 15.000 cellule con 100 μL di celle risospese.
    1. Facoltativo: se l'effetto di farmaci o altri agenti farmacologici deve essere testato, aggiungere la concentrazione appropriata di farmaco alle cellule e rimettere le cellule nell'incubatore. Attendere un adeguato tempo di preincubazione prima di procedere alla fase successiva.
  6. Recuperare la piastra dall'incubatore (passaggio 4.1) e rimuovere il volume di terreno rimasto dal lavaggio dai pozzetti sperimentali nella piastra preriscaldata. Lavare una volta con il supporto desiderato. Pipettare con cautela 100 μl delle cellule risospese nei pozzetti desiderati. Trasferire le cellule piastrate nell'incubatore per 90 minuti.
    NOTA: Pipettare delicatamente le cellule al centro dei pozzetti, cercando di mantenere la pipetta verticale.
  7. Dopo l'incubazione, rimuovere ~125-170 μL di volume dai pozzetti. Se necessario, lavare delicatamente le cellule con 200 μl di PBS riscaldato. Aggiungere 50 μL di tripsina a ciascun pozzetto e rimettere la piastra nell'incubatore fino a quando le cellule iniziano a dissociarsi (5-10 min).
    NOTA: Assicurarsi che il pozzetto non si asciughi mai e che non si verifichi un'eccessiva tripsinizzazione.
  8. Aggiungere 160 μl di tampone di flusso appena preparato (1 mM EDTA, 2% p/v di albumina sierica bovina, in PBS freddo) nei pozzetti. Pipettare delicatamente su e giù per dissociare le cellule, aggiungere 196 μl di questa sospensione cellulare alle provette PCR seguite da 4 μl di ioduro di propidio e mescolare delicatamente. Preparare un campione di controllo senza ioduro di propidio che funga da controllo per il gating di vitalità.
  9. Posizionare le provette in un secchiello del ghiaccio con la luce di blocco del coperchio e procedere alla misurazione dell'intensità della fluorescenza con un citometro a flusso.

5. Raccolta e analisi dei dati

  1. Analizzare ogni campione con un citometro a flusso. Cerca di raccogliere almeno 2.000 singole cellule vive per campione.
    NOTA: Ridurre al minimo l'esposizione alla luce per i campioni che non sono ancora stati analizzati e mantenerli sul ghiaccio.
  2. Una volta raccolti tutti i dati, trasferisci i file al software di tua scelta e controlla le celle.
    1. Gate per celle in base all'area di dispersione diretta (FSC-A) rispetto all'area di dispersione laterale (SSC-A).
    2. Gate per singoletti all'interno della popolazione cellulare in base all'FSC-A rispetto all'altezza di dispersione in avanti (FSC-H).
    3. Gate per cellule vive della popolazione singoletto impostando un gate verticale sull'istogramma dell'intensità dell'area dello ioduro di propidio al valore più alto per il controllo senza ioduro di propidio preparato al punto 4.8. Tutti gli eventi che non superano il cancello sono celle vive
    4. Impostare un gate verticale su un istogramma dell'intensità dell'area Cy5 (Cy5-A) dei singoletti per rimuovere qualsiasi evento non fluorescente sul canale Cy5-A causato da detriti cellulari. Assicurarsi che questo gate verticale sia a un valore inferiore alle celle non etichettate analizzate ma maggiore di 0 intensità fluorescente.
    5. Per analizzare le popolazioni cellulari, impostare un gate di bisettrice al 99° percentile di ciascun rispettivo controllo negativo.
    6. Applicare un gate alla stessa intensità delle corrispondenti condizioni sperimentali e raccogliere la percentuale di cellule che superano il gate di controllo negativo per ciascuna condizione.
      NOTA: Le percentuali possono essere confrontate direttamente tra le repliche biologiche tramite un'appropriata analisi statistica; Vedi dati rappresentativi.
  3. Analizzare i dati utilizzando la fluorescenza mediana Cy5, dividendo l'intensità mediana del ligando-WDV per la mediana del solo WDV e confrontare questi valori tra le repliche.

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Risultati

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Per dimostrare l'utilità e la facilità d'uso dei RAD-TGT, abbiamo analizzato gli effetti degli inibitori della Rho Kinasi (ROCK) sul meccanotipo delle cellule CHO-K1. La via ROCK è coinvolta nell'organizzazione dell'actina e nell'attivazione della miosina. Precedenti studi che utilizzano TGT hanno dimostrato che l'inibizione di ROCK riduce la rottura del taglio dei TGT 16,17,18. I TGT di taglio o ad alta forza riportano le forze...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo fornito protocolli su come impostare ed eseguire esperimenti RAD-TGT con l'obiettivo di incoraggiare gli scienziati di tutte le scienze della vita a incorporare la meccanotipizzazione nel loro flusso di lavoro. Un vantaggio chiave dei RAD-TGT, in particolare per coloro che hanno capacità di produzione di proteine, è l'uso delle endonucleasi HUH per legare i ligandi ai duplex di DNA con alta fedeltà senza alcuna reticolazione e/o purificazione chimica. Le endonucleasi HUH comprend...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.R.G. riconosce il finanziamento da parte del NIH R35GM119483. Il biorender è stato utilizzato per creare schemi di figure.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta conica da 15 mLSarstedt62.554.205
Piastra inferiore in vetro a 96 pozzettiCellvisP96-1.5H-N
Foglio adesivo per piastra PCRThermo Fisher ScientificAB-0626
AmpicillinaApex Bioresearch Products 25-530
Bio-Rad Colonna da 20 mLBio-Rad7321010
Biotinilato BSAThermo Fisher Scientific29130
BL21 (DE3) Competente E. coliNew England BiolabsC2527H
Albumina sierica bovinaThermo Fisher ScientificBP9703100
Incubatore per colture cellulariThermo Fisher Centrifuga51030284
Thermo Fisher Scientific75009521
CHO-K1ATCCCCL-61
Tubo per dialisiThermo Fisher ScientificPI88242
DMSOThermo Fisher ScientificD12345
EDTAThermo Fisher ScientificS311-100
Flow CitometroBDAccuri C6 Plus
FlowJo BDFlowJo v10.10
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-1
ImidazoleThermo Fisher ScientificO3196-500
IPTGIBI ScientificIB02125
LB agarFisher ScientificBP1425-500
Supporto per ligandoTecnologie DNA integrateoligoGCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/
Brodo di lisogenia (LB)Thermo Fisher ScientificBP1426-500
MnCl2Thermo Fisher ScientificM87-100
NaClThermo Fisher ScientificBP358-212
NeutrAvidin ProteinThermo Fisher Scientific31000
Nichel-NTA resina Thermo Fisher Scientific88222
PBSCorning21-031-CV
Piastra di PetriVWR25384-342
Soluzione di ioduro di propidioCayman Chemicals10008351
Gel SDS-PAGEBio-Rad4561096
Terreni privi di sieroThermo Fisher ScientificA4124801Gibco Optimem I terreni usati e alternativi privi di siero vanno bene da usare
Filo di ancoraggio di taglio TecnologieDNA integrateprogettate dall'utente oligo/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC
SonicatoreThermo Fisher Scientific15-345-139
TermociclatoreBio-Rad1861096
TrisThermo Fisher ScientificBP152-500
TrypinThermo Fisher Scientific12605036
taglio 10 kDaAmikon
Unzipping Anchor Strand TecnologieDNA integrateprogettate dall'utente oligo/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/
WDV PlasmideAddGene226983
WDV-Echistatina PlasmideAddGene226985
Y-27632Selleck ChemicalsS1049ricostituito in DMSO
ScientificFiltro ultracentrifugo ,

Riferimenti

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