Qui, forniamo un metodo per l'analisi dell'imaging di cellule vive che può essere utilizzato per tracciare manualmente i lignaggi dei cheratinociti di passaggio 0 e che consente la raccolta di metriche di proliferazione, tra cui il destino della divisione cellulare e la durata del ciclo cellulare.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Imaging di cellule vive con fotografia time lapse per studiare la cinetica di proliferazione dei cheratinociti epidermici
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'imaging di cellule vive è un metodo in evoluzione e alquanto impegnativo per studiare il comportamento dei cheratinociti in vitro. Storicamente, il comportamento di divisione dei cheratinociti è stato studiato attraverso metodi come l'analisi clonale, l'immunocolorazione e l'analisi del ciclo cellulare. Nessuno di questi metodi consente l'analisi del comportamento dei cheratinociti a livello di singola cellula in tempo reale. Nell'ultimo decennio, i gruppi hanno utilizzato l'imaging di cellule vive per identificare le cellule staminali dei cheratinociti e i progenitori impegnati senza la necessità di etichettatura. Sono state identificate differenze nel comportamento di divisione di ciascun gruppo, nel tasso di differenziazione terminale e nella durata del ciclo cellulare. Qui viene descritto un metodo per l'imaging di cellule vive di cheratinociti con fotografia time-lapse e la sua analisi. Si raccomanda l'utilizzo di cheratinociti non attraversati affinché questo metodo imiti il comportamento in vivo il più fedelmente. L'imaging di cellule vive offre una capacità unica di studiare il comportamento delle cellule staminali e dei progenitori impegnati a livello di singola cellula e di determinare i destini di divisione, la durata del ciclo cellulare e altre metriche di proliferazione.
Introduzione
La capacità di visualizzare le popolazioni cellulari in vitro in tempo reale mentre si espandono per lunghi periodi di tempo è un vantaggio unico dell'imaging su cellule vive. L'imaging di cellule vive consente di valutare la motilità, la migrazione e la proliferazione cellulare a livello di singola cellula. L'obiettivo di questo protocollo è quello di ottimizzare la visualizzazione delle colture di cheratinociti tramite fotografia time-lapse, producendo video che possono poi essere tracciati manualmente per ottenere dati granulari sul comportamento cellulare.
La nostra attenzione è rivolta alla cinetica di proliferazione. Dall'analisi dei video di imaging delle cellule vive, è possibile chiarire gli alberi di lignaggio e valutare il tempo tra le divisioni (un proxy per la durata del ciclo cellulare), nonché le proporzioni delle divisioni che portano a un'ulteriore divisione rispetto alla differenziazione delle cellule figlie.
C'è una sostanziale variabilità da donatore a donatore quando si ha a che fare con cheratinociti primari e frequenti tentativi falliti di propagazione cellulare. Per questo motivo, molti ricercatori scelgono di utilizzare cheratinociti altamente proliferativi come le cellule HaCaT o i cheratinociti neonatali, spesso dopo aver subito più passaggi in vitro1. La coltura di cheratinociti primari da pelle adulta o invecchiata ai fini del tracciamento del lignaggio può essere impegnativa. Tuttavia, ci sono problemi con l'uso di cellule passate da linee cellulari o dal prepuzio maschile. Il passaggio ripetuto produce cellule che sono significativamente diverse dal loro stato in vivo 2. Inoltre, è stato dimostrato che le cellule HaCaT reagiscono in modo diverso rispetto ai cheratinociti primari in più saggi 3,4,5. Per utilizzare le cellule che più assomigliano alle loro controparti in vivo, vengono utilizzati cheratinociti di passaggio 0 da donatori umani adulti. Le cellule staminali dei cheratinociti e i progenitori impegnati mostrano differenze di comportamento distinte, che consentono di distinguere le colonie di entrambe le popolazioni tramite l'imaging di cellule vive6. Questa capacità relativamente nuova di visualizzare il comportamento dei singoli cheratinociti a lungo termine è stata utilizzata solo in pochi studi precedenti utilizzando tecniche simili 6,7,8. Questo protocollo delinea l'imaging di cellule vive di cheratinociti primari utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive IncuCyte S3. Dagli alberi di lignaggio che vengono costruiti, è possibile determinare il tipo di colonia (cellula staminale contro progenitore impegnato), così come la durata del ciclo cellulare e la proporzione delle divisioni di differenziazione.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Questo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Tutti i tessuti umani sono stati ottenuti dopo l'approvazione da parte del comitato di revisione istituzionale (IRB) dell'Università della California, San Francisco (UCSF) e il consenso è stato ottenuto per tutti i tessuti utilizzati.
1. Fotografia time lapse del passaggio 0 cheratinociti umani
NOTA: questo protocollo è specifico per IncuCyte S3 e SX5.
- Assicurarsi che siano state ottenute le approvazioni appropriate dal comitato di ricerca umana dell'istituto per utilizzare il tessuto umano per lo studio.
- Isolare i cheratinociti dalla pelle fresca come descritto in precedenza9.
- Determinare la densità di semina per il saggio. Eseguire studi pilota con campioni a diluizioni multiple da diversi donatori per comprendere la densità di cellule necessarie al fine di garantire colonie adeguate per lo studio, ma prevenire colonie eccessive che provocano la sovrapposizione delle colonie durante il periodo di osservazione. Esegui questi progetti pilota in condizioni sperimentali identiche (stesse piastre, reagenti, ecc.), poiché questi fattori possono alterare i risultati.
NOTA: Una densità di semina troppo bassa comporta una crescita insufficiente, mentre una densità di semina troppo alta comporta l'incapacità di tracciare con precisione le cellule a causa dell'affollamento delle cellule nel campo.- Per i cheratinociti di passaggio 0 da prepuzi neonatali di età inferiore a 48 ore provenienti da una raccolta conservata a 4 °C in terreni di raccolta, assicurarsi che la densità di semina sia di 1000-5000/cm2. Per i cheratinociti P1, utilizzare 500-2000 cellule/cm2. Più lontano è il passaggio, minore è la densità di semina.
- Celle della piastra sulla dimensione della piastra selezionata.
NOTA: Le piastre e le micropiastre a 96 pozzetti hanno un effetto menisco, con conseguente distribuzione cellulare non uniforme, con gran parte della crescita al di fuori del campo dell'imager. Le piastre con pozzetti più grandi (ad esempio piastre da 24 pozzetti) consentono di acquisire più dati. Le piastre a 24 pozzetti consentono la visualizzazione di un massimo di 36 campi, mentre le piastre a 96 pozzetti consentono la visualizzazione di un massimo di 5 campi. Tuttavia, il numero di campi acquisiti su uno strumento è limitato e più campi utilizzeranno una parte maggiore della capacità dell'imager. In genere, viene utilizzata una piastra a 24 pozzetti.- Per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule sulla piastra possono essere utilizzate varie tecniche. Innanzitutto, invece di seminare singolarmente ogni pozzetto, aliquotare il terreno totale necessario per tutti i pozzetti a una diluizione specifica in una microprovetta. Quindi, pipettare il numero totale di cellule necessarie affinché l'aliquota raggiunga la densità desiderata e capovolgere delicatamente la provetta per distribuire le cellule in modo omogeneo.
- Dopo la placcatura, spostare la piastra a croce tre volte (su-giù, sinistra-destra) e poi trasferirla con cautela nell'incubatrice.
ATTENZIONE: Se si utilizza una micropiastra, evitare le file e le colonne esterne dei pozzetti, poiché il microscopio time-lapse genera calore durante l'imaging e può causare l'evaporazione dei mezzi in tali pozzetti. I pozzetti sperimentali devono essere raggruppati al centro della piastra e circondati da pozzetti contenenti PBS o altro fluido sterile alla massima capacità per ridurre gli effetti di evaporazione/bordo.
- Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2 per consentire l'aderenza.
- Cambiare i supporti dopo 24 ore.
NOTA: Non disturbare il monostrato in crescita durante l'aspirazione. Utilizzare sempre fluidi riscaldati (37 °C) e versare delicatamente i fluidi nei pozzetti utilizzando la parete laterale. Il mezzo utilizzato qui è Epilife/Supplemento S7/Primocin. Per questa applicazione si raccomanda l'uso di antibiotici nei terreni per l'imaging a lungo termine di cellule vive. La coltura estesa in una macchina utilizzata per più esperimenti simultanei è ad alto rischio di contaminazione. La penicillina e la streptomicina sono comunemente usate. - Aprire l'incubatrice premendo il grande pulsante triangolare in basso a sinistra per aprire il vassoio quando la luce è verde. Metti la nave in una baia aperta. Quindi, chiudi la teglia utilizzando lo stesso pulsante in basso a sinistra. Non aprire mai il vassoio quando il pulsante per l'apertura è rosso, poiché ciò significa che è in corso una scansione attiva e la scansione verrà interrotta.
ATTENZIONE: Assicurarsi che non ci siano scansioni a partire dall'osservazione dello schermo sul modulo del controller. Indica il tempo fino alla scansione successiva e la lunghezza della scansione. Se la scansione è iniziata, verrà assegnato il tempo necessario al completamento della scansione. - Aprire l'applicazione sul computer ed effettuare l'accesso utilizzando l'ID utente e la password appropriati. Seleziona Programma.
- Premi il pulsante + nell'angolo in alto a sinistra sotto il programma per aggiungere la piastra al programma.
- Selezionare Scansione su pianificazione, quindi fare clic su Avanti.
- Seleziona Nuovo, quindi fai clic su Avanti.
NOTA: Se questa targa è identica a un esperimento precedente o in esecuzione, è possibile utilizzare Copia precedente o Copia corrente per accelerare la formattazione dell'esperimento. - Selezionare Standard per il tipo di scansione, quindi fare clic su Avanti.
NOTA: Image Lock è una piastra proprietaria a 96 pozzetti che aiuta a ridurre al minimo il verificarsi di perdita di messa a fuoco/salto dell'immagine, che può essere utile se si verificano questi problemi. Gli altri tipi di scansione non sono particolarmente utili per il tracciamento della derivazione. - Per le impostazioni di scansione, selezionare Aderente cellula per cella utilizzando il canale di fase all'obiettivo 10x, quindi fare clic su Avanti.
NOTA: Finché si sceglie il canale di fase, a questo punto non è necessario selezionare alcuna opzione di analisi, poiché l'analisi può essere avviata dopo l'acquisizione dei dati. - Seleziona l'imbarcazione, quindi fai clic su Avanti. I recipienti più comuni sono compatibili con la macchina, anche se le non micropiastre potrebbero richiedere attacchi speciali per adattarsi agli alloggiamenti del microscopio time-lapse.
- Selezionare una baia vuota per posizionare l'imbarcazione, quindi fare clic su Avanti.
- Selezionare i pozzetti da scansionare e le immagini per pozzetto, quindi fare clic su Avanti. La durata stimata della scansione verrà fornita in basso a sinistra dello schermo.
- Assegna un nome all'esperimento utilizzando la convenzione di denominazione desiderata. Crea una mappa delle piastre dell'esperimento per riferimento futuro, quindi premi Ok. Infine, fai clic su Avanti.
- Rimandare l'analisi a dopo la raccolta dei dati, poiché l'analisi cella per cella deve essere avviata dopo il completamento della scansione. Fare clic su Avanti.
- Infine, impostare la frequenza dell'imaging. Al fine di monitorare in modo affidabile le mitosi, che si verificano nell'arco di 30 minuti, eseguire la scansione a intervalli di 20 minuti alla ricerca di cheratinociti. Premere Avanti e confermare le impostazioni per iniziare l'esperimento.
NOTA: I tempi di scansione non possono sovrapporsi e i produttori consigliano che la macchina rimanga a riposo per tutto il tempo in cui è in fase di scansione. Con intervalli di 20 minuti, ciò significa che è necessario dedicare alla scansione un massimo di 10 minuti. Se vengono riprodotti 12 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti a 36 visualizzazioni per pozzetto, il completamento della scansione richiede 7 minuti, quindi prestare sempre attenzione alle risorse disponibili per l'esperimento durante la pianificazione.- C'è una notifica se c'è un tempo inadeguato per il riposo della macchina e se i tempi di scansione si sovrappongono, la nave non può essere aggiunta alla pianificazione. Se la nave non può rientrare nel programma a intervalli regolari, fare clic su Riserva posizione vassoio e premere Avanti.
- Fare doppio clic sul programma nella parte superiore dello schermo e selezionare la nave in riserva, quindi fare clic manualmente per aggiungere immagini nelle fasce orarie aperte. In alternativa, fare clic con il pulsante destro del mouse una volta aperta la pianificazione per eliminare tutti gli orari di controllo pianificati e fare clic con il pulsante destro del mouse per impostare nuovi tempi di controllo per un gruppo di controllo a intervalli regolari.
NOTA: Questo interromperebbe tutti gli esperimenti attualmente sulla macchina fino a quando non vengono stabiliti nuovi orari. Non dimenticare di premere l'icona del floppy disk per salvare o la X rossa per annullare le modifiche alla pianificazione. La selezione dei pozzetti o delle viste desiderate è un processo semplice, in quanto la macchina fornisce immediatamente il tempo di scansione stimato al momento della selezione dei parametri. La durata della scansione dipende dal tipo e dalla marca della piastra selezionata, nonché dal numero di pozzetti o viste da scansionare. Ciò consente agli utenti di regolare i parametri di scansione in modo che corrispondano alla capacità della macchina.
- Per i cheratinociti, cambiare il terreno ogni 48 ore. Per garantire il corretto orientamento della lastra, attendere il completamento della prima scansione ogni volta che un recipiente viene inserito nella macchina (tempo permettendo). È un semplice errore da commettere. Posizionare la piastra nella macchina in modo che le lettere che denotano le file si trovino sul lato sinistro della baia.
- Per visualizzare le scansioni, premere il pulsante Visualizza con l'icona a forma di occhio , quindi fare doppio clic sull'esperimento. Prendere in considerazione la possibilità di cambiare i terreni in anticipo se si verifica un improvviso cambiamento nel colore dei terreni (i terreni contenenti rosso fenolo diventano gialli a causa dell'acidificazione), se sono presenti cellule morte in eccesso (possono interferire con la proliferazione delle colonie vive) o se si osserva una morfologia anomala.
- Una volta che tutti i pozzi sono diventati quiescenti o hanno raggiunto la confluenza, esporta l'esperimento. Seguire le colonie adulte per ~2 settimane e quelle neonatali per ~10 giorni, momento in cui l'affollamento provoca una diminuzione dei rendimenti per le analisi.
- Per eseguire l'esportazione, fare clic sulla scheda Visualizza e fare doppio clic sull'esperimento nell'elenco delle scansioni recenti (per impostazione predefinita, l'ordine a partire dall'ultima analisi è precedente). Fare clic sull'icona Orizzontale con la freccia e attendere l'avvio dello strumento di esportazione.
- Fare clic su Come visualizzato, quindi fare clic su Avanti.
- Fare clic manualmente su ciascun campo visivo da esportare, quindi fare clic su Avanti.
- Selezionare se si desidera un filmato o una serie di immagini, quindi selezionare i tempi di scansione da esportare. Per il tracciamento del lignaggio dei cheratinociti, utilizzare l'opzione film e selezionare tutte le scansioni (c'è una rapida icona Seleziona tutto con una linea tratteggiata per accelerare questa operazione). Fare clic su Avanti.
- Esporta a 1 fotogramma al secondo con la massima qualità (impostalo utilizzando la barra accanto a qualità). Fare clic su Avanti.
- Scegli la cartella di destinazione e il tipo di file. Assegna un nome al file e fai clic su Esporta.
NOTA: L'esportazione dei video può richiedere molto tempo, a seconda della velocità della connessione Internet e del computer coinvolto. Preparati ad attendere più giorni per esportare tutti i file video per esperimenti più grandi. Avere la possibilità di accedere al microscopio time-lapse da remoto è estremamente comodo.
2. Utilizzo dell'imaging time-lapse per costruire alberi di derivazione e generare fogli dati
- Apri il file video utilizzando un lettore multimediale. Si consiglia il lettore multimediale VLC.
- Scorri i video e identifica le colonie in crescita. Con VLC, usa il tasto freccia per saltare i fotogrammi avanti e indietro. Fai uno screenshot della colonia da tracciare ed etichetta la colonia.
- Identificare una colonia di interesse alla fine o dopo alcuni giorni di registrazione video, quindi riavvolgere il video e identificare la cellula che forma la colonia.
NOTA: È qui che è importante avere la densità di semina appropriata. Se troppe colonie si sviluppano l'una accanto all'altra, si espandono e si fondono l'una nell'altra, rendendo impossibile tracciare con precisione le divisioni cellulari. - Quando una cellula sta per dividersi, sembra condensarsi (Figura 1). Metti in pausa il video quando si verifica la divisione. Registra l'ora della divisione (un timestamp si trova nell'angolo in basso a sinistra). Fai uno screenshot di questa divisione iniziale e assegnale la stessa etichetta della colonia. Registra le divisioni in un diagramma di lineage disegnato a mano (vedi Risultati rappresentativi). Continuate a tracciare e documentare il maggior numero possibile di generazioni.
NOTA: Il tracciamento automatico delle celle è in fase di sviluppo per accelerare questo processo e tracciare in modo più accurato le celle7. Anche in condizioni di coltura a basso contenuto di calcio con differenziazione minima, i modelli di apprendimento automatico attualmente non hanno la sensibilità necessaria per tracciare con precisione le divisioni dei cheratinociti. - Trascrivi l'albero di derivazione manuale in fogli dati, così chiamati "fogli verdi" a causa del colore nel foglio di calcolo (File supplementare 1).
- Utilizza i fogli verdi per calcolare le proporzioni delle divisioni proliferative e differenziative, identificare le cellule staminali e le colonie progenitrici impegnate e la durata del ciclo cellulare (vedi risultati rappresentativi).
NOTA: La macchina è in grado di analizzare i dati tramite i propri analizzatori di base e cellula per cella per eseguire più altri saggi (confluenza, scratch). Tuttavia, questo va oltre l'ambito di questo protocollo.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
I cheratinociti primari crescono in modo stereotipato, che può essere monitorato tramite l'imaging di cellule vive. Il lettore multimediale VLC viene utilizzato per rilevare le registrazioni. Il tempo fino alla prima divisione è variabile e può essere di più giorni a seconda delle caratteristiche del donatore, come l'età, lo stato di salute o i fattori di crescita presenti nell'ambiente in vitro . Dopo la semina iniziale, i cheratinociti hanno un aspetto piccolo e arrotondato (<...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'imaging di cellule vive dei cheratinociti è un metodo label-free per tracciare il comportamento di divisione delle cellule staminali e dei progenitori impegnati. Dato che il mantenimento dell'epidermide dipende dalla cinetica di proliferazione delle cellule staminali e dei progenitori impegnati10, avere una comprensione granulare dei cambiamenti in queste popolazioni di cheratinociti e di come sono influenzati in varie condizioni facilita lo sviluppo di terapie ...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Merit Review Award Number I01 CX001816 degli Stati Uniti (U.S.) Servizio di ricerca e sviluppo (CSRD) del Dipartimento per gli affari dei veterani. I contenuti non rappresentano le opinioni del Dipartimento degli Affari dei Veterani degli Stati Uniti o del Governo degli Stati Uniti. Ringraziamo il Dr. Michael Rosenblum per averci fornito l'accesso al suo microscopio time-lapse per condurre i nostri esperimenti.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Placca a blocco immagine a 96 pozzi | Sartorius | BA-04856 | Micropiastra suggerita è compatibile con la macchina se si usa una piastra a 96 pozzi. |
| Piastra a 24 pozzi | Corning | 3524 | Consiglio di essere compatibile con la macchina se si usa una piastra a 24 pozzi. |
| Anfotericina B, 50 mL | Corning | 30-003-CF | Diluire a 5x (disponibile in 100x stock) per 5x PSA - 1x per i cambiamenti di media |
| Epilife, 50 mL | Gibco | MEP1500CA | Aggiungi S7, considera la primocina |
| IncuCyte S3 | Sartorius | 4637 | Imager (alternative accettabili per Zoom/SX5) |
| Penicillina/Streptomicina, 100 mL | Corning | 30-002-CL | Diluire a 5x (disponibile in 100x stock) |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-05 | 1 mL per mezzo da 500 mL |
| Supplemento S7 | Gibco | S0175 | Aggiunta all'epilife |
Riferimenti
- Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).
- Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T. The effect of repeated passaging on the susceptibility of human proximal tubular HK-2 cells to toxic compounds. Physiol Res. 69 (4), 731-738 (2020).
- Moran, M. C., et al. Characterization of human keratinocyte cell lines for barrier studies. JID Innov. 1 (2), 100018(2021).
- Seo, M. -D., Kang, T. J., Lee, C. H., Lee, A. -Y., Noh, M. HaCaT keratinocytes and primary epidermal keratinocytes have different transcriptional profiles of cornified envelope-associated genes to T helper cell cytokines. Biomol Ther. 20 (2), 171-176 (2012).
- Jahn, M., et al. Different immortalized keratinocyte cell lines display distinct capabilities to differentiate and reconstitute an epidermis in vitro. Exp Dermatol. 33 (1), e14985(2024).
- Xiao, T., et al. Short cell cycle duration is a phenotype of human epidermal stem cells. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 76(2024).
- Hirose, T., Kotoku, J., Toki, F., Nishimura, E. K., Nanba, D. Label-free quality control and identification of human keratinocyte stem cells by deep learning-based automated cell tracking. Stem Cells. 39 (8), 1091-1100 (2021).
- Roshan, A., Murai, K., Fowler, J., Simons, B. D., Nikolaidou-Neokosmidou, V., Jones, P. H. Human keratinocytes have two interconvertible modes of proliferation. Nat Cell Biol. 18 (2), 145-156 (2016).
- Abegaze, B., Ijeh, N., Vittimberga, B., Ghadially, R. Generating primary cultures for the purpose of keratinocyte live cell imaging. J Vis Exp. , In Press (2024).
- Piedrafita, G., et al. A single-progenitor model as the unifying paradigm of epidermal and esophageal epithelial maintenance in mice. Nat Commun. 11 (1), 1429(2020).
- Ścieżyńska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Exp Dermatol. 28 (2), 107-112 (2019).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
- Malin-Mayor, C., et al. Automated reconstruction of whole-embryo cell lineages by learning from sparse annotations. Nat Biotechnol. 41 (1), 44-49 (2023).
- Waliman, M., et al. Automated cell lineage reconstruction using label-free 4D microscopy. Genetics. 228 (2), iyae135(2024).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
