Caratterizzazione dell'autoassemblaggio reversibile pH-dipendente di colloidi d'oro rivestiti di amiloide beta 1-40

Sommario

Qui, presentiamo un metodo sistematico che descrive l'auto-assemblaggio quasi reversibile degli aggregati d'oro da 20 nm rivestiti di amiloide-beta 1-40 (Aβ _1-40). Il networking quasi reversibile nano-dipendente tra i peptidi è stato correlato con specifici amminoacidi o sezioni del monomero Aβ _1-40.

Abstract

La caratterizzazione di Aβ _1-40 rivestita sulle superfici delle particelle colloidali di nano-oro è stata condotta utilizzando la spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Lo spostamento pH-dipendente osservato della banda SPR delle particelle d'oro da 20 nm rivestite di Aβ _1-40 è stato correlato con l'alternanza di aggregazione e disaggregazione osservata nelle immagini TEM. Un pH di ~4 induceva una conformazione dispiegata e un pH di ~10 induceva una conformazione ripiegata di Aβ _1-40 sulla superficie dell'oro. Questo processo di aggregazione reversibile è stato osservato dall'imaging Raman quando il pH è stato gradualmente modificato da pH 4 a pH 10. Abbiamo osservato un cambiamento morfologico dipendente dal pH in Aβ _1-40 sulla superficie dell'oro, dove sono stati osservati aggregati chiari a pH 4. Tuttavia, abbiamo osservato differenze molto sottili nello spettro della spettroscopia Raman potenziata dalla superficie (SERS) tra le condizioni di pH 4 e pH 10, con la differenza più evidente che è la densità spettrale nella regione di 250 ^cm-1 e 1750 ^cm-1. In particolare, l'analisi modale dell'aggregazione reversibile ha indicato che gli aggregati erano formati dalla conformazione dispiegata di Aβ _1-40 che coinvolgeva la sezione dell'anello benzenico di tirosina e fenilalanina. Al contrario, il disassemblaggio degli aggregati è stato associato a cambiamenti conformazionali nel ripiegamento proteico di Aβ _1-40 che coinvolgono istidina, glutammina, metionina e acido aspartico.

Introduzione

La fibrillogenesi dei peptidi di amiloide-beta 1-40 (Aβ _1-40) o 1-42 (Aβ _1-42) è stata ampiamente studiata come componente critico nella formazione delle placche amiloidi che sono una causa della malattia di Alzheimer 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ^,11. Il meccanismo chiave nella fibrillogenesi è un'oligomerizzazione dei peptidi Aβ _1-40 o Aβ _1-42 per formare un aggregato proteico neurotossico e sono state condotte indagini approfondite per comprendere i meccanismi di come i monomeri formano gli oligomeri 12,13,14. Abbiamo intrapreso un approccio di esame dei peptidi amiloidogenici che formano aggregati su una superficie di nano-oro e l'identificazione dei fattori responsabili della rete tra peptidi che sono lontani dalla superficie dell'oro 15,16,17,18,19,20,21,22.

Aβ _1-40 adotta una conformazione dispiegata (A) in condizioni acide (pH ~4) e una conformazione ripiegata (B) in condizioni basiche (pH ~10). Abbiamo osservato particelle colloidali d'oro rivestite di Aβ _1-40 disperse a pH ~10 e grandi aggregati colloidali d'oro rivestiti di Aβ _1-40 a pH~4 (Figura 1)^23,24. La conformazione dispiegata di Aβ _1-40, in condizioni acide, favorisce il networking peptidico tra i monomeri Aβ _1-40 sulla superficie delle nanoparticelle d'oro, con conseguente formazione di aggregati colloidali d'oro (Vedi A in Figura 1). Quando il monomero Aβ _1-40 mantiene la conformazione ripiegata a un pH basico o neutro, Aβ _1-40, i monomeri non si reticolano in aggregati e le nanoparticelle d'oro rivestite rimangono come singole particelle disperse (vedi B nella Figura 1). Possiamo, quindi, interrogare il processo di come i peptidi Aβ _1-40 subiscono cambiamenti conformazionali alla rete e formano aggregati misurando lo spostamento della banda SPR su un intervallo di condizioni di pH 25,26,27,28,29,30,31.

Abbiamo testato diverse dimensioni di nanoparticelle d'oro e abbiamo scoperto che il colloide d'oro da 20 nm mostrava il più importante processo di autoassemblaggio reversibile dei monomeri Aβ _1-40 in risposta a un cambiamento esterno del pH (Figura 2). Questa è una chiara indicazione di un cambiamento reversibile nella conformazione peptidica, in cui le condizioni acide (A) inducono una conformazione dispiegata, migliorando la rete e portando all'aggregazione di colloidi d'oro. Si è scoperto che la condizione di base (B) induce una conformazione ripiegata dei monomeri 26,27,28,29,30,31.

Protocollo

1. Preparazione di nanoparticelle d'oro rivestite Aβ _1-40

1. Aggiungere un volume di 1 mL di acqua distillata deionizzata a 1 mg di Aβ _1-40 liofilizzato (MW: 4,2 kDa, purezza HPLC al 98%) utilizzando un ago per siringa. Miscelare la soluzione con un miscelatore a vortice per circa 30 s e assicurarsi che non si osservino particelle solide nella soluzione a temperatura ambiente (RT; ~20 °C).
   1. Preparare tutte le soluzioni madre utilizzando acqua deionizzata e distillata (~18 MΩ·cm).
   2. Identifica spettroscopicamente la concentrazione utilizzando l'assorbimento della tirosina a 275 nm³², che ha un coefficiente di estinzione molecolare ε₂₇₅ di 1390 ^cm-1· ^M-1.
   3. Conservare le soluzioni madre di Aβ _1-40 a -80 °C. (Vedi Tabella dei materiali per i prodotti commerciali di Aβ _1-40.)
2. Scongelare la soluzione madre di peptidi circa 5 minuti prima della raccolta dei dati. Miscelare un volume di 8 μl della soluzione peptidica con 800 μl di particelle colloidali d'oro in una provetta da centrifuga da 15 mL. Aggiungere un volume di 4,2 mL di acqua distillata deionizzata e quindi agitare il campione per 10 s 30,31,33,34.
3. Fissare la concentrazione di peptidi Aβ _1-40 a 1,8 nmol e variare il rapporto tra peptidi Aβ _1-40. Il numero di colloidi d'oro variava tra ~500:1 e ~2000:1²⁵.

2. Variazione iterativa del pH e monitoraggio del corrispondente spostamento della banda SPR

1. Impostare la temperatura della soluzione a un determinato valore (ad es. 25 °C) utilizzando l'unità di controllo della temperatura dello spettrofotometro ultravioletto-visibile-vicino infrarosso (UV-Vis-NIR).
2. Monitorare il pH iniziale della soluzione campione utilizzando un pHmetro e impostarlo leggermente al di sotto di pH 7. Raccogliere lo spettro di assorbimento nell'intervallo compreso tra 400 nm e 1000 nm.
3. Modificare il pH del campione a ~pH 4 (cioè pH 4,0 ± 0,3) aggiungendo 10 μL di volumi di 0,1 M HCl e raccogliere lo spettro di assorbimento tra 400 nm e 1000 nm.
4. Modificare il pH del campione a ~pH 10 (cioè pH 10 ± 0,3) aggiungendo 10 μL di volumi di 0,1 M NaOH e raccogliere lo spettro di assorbimento tra 400 nm e 1000 nm.
5. Modificare il pH tra pH 4 e pH 10 con HCl e NaOH 10 volte e raccogliere lo spettro di assorbimento in modo continuo a 25 ± 0,2 °C^29,30.
   NOTA: Per tutte le soluzioni campione, la densità ottica del picco della banda SPR è stata mantenuta intorno a 0,2. È previsto un effetto tampone dovuto alla soluzione tampone residua in una soluzione. Pertanto, il valore finale del pH è stato determinato dopo la conferma dell'equilibrio. Il valore del pH è stato misurato direttamente in una cella in cuvetta campione utilizzando un micro elettrodo di pH, che ha una precisione di ±0,005 pH.
6. Ottenere il set di dati ASCII (American Standard Code for Information Interchange) delle lunghezze d'onda in funzione dell'assorbanza. Estrarre la posizione media dei picchi di banda utilizzando il programma Peak Fit .
   1. Traccia il set di dati per visualizzare la densità ottica in funzione della lunghezza d'onda (nm) utilizzando la funzione Traccia .
   2. Contrassegnare le lunghezze d'onda di picco iniziali λ₁, λ₂ e λ₃ selezionando le loro posizioni approssimative nei dati tracciati e adattare i dati utilizzando la funzione RUN .
   3. Ottenere il grafico contenente il picco centrale di ciascuno (λ_i), XC_i, con l'area di ogni banda (A_i).
7. Esporta le posizioni e le aree dei picchi estratti in un foglio di calcolo e calcola la posizione media dei picchi a un dato pH.
   1. Determinare il fattore di ponderazione a_i di ciascun centro di picco λ_i confrontando l'area della banda (A_i) con l'area totale delle bande intere come: .
   2. Estrarre la posizione media del picco, (pH) utilizzando Eqn. (1).
      (1)
8. Generare un grafico di reversibilità utilizzando il seguente processo:
   1. Tabella delle posizioni medie dei picchi, , in funzione di ciascun numero di "operazione", n come vs. n. Rendere il numero di operazione, n, 1 per il campione prima dell'aggiunta di acido a ~pH 7. Aumentare il numero di operazioni di 1 ogni volta, modificando il pH in ~pH4 con HCl o pH in ~pH 10 con NaOH. Fa n per essere pari a una condizione acida (cioè ~pH 4) e dispari per essere una condizione basica (cioè pH 10).
   2. Analizza la posizione del picco ad ogni n, (n) = λ(n), utilizzando la formula³⁰
      (2)
      NOTA: Rappresentare una posizione di picco media iniziale a n = 1 per A. Esprimere i parametri B e C come spostamento della posizione di picco dipendente da n. Sia il parametro D come ampiezza del fattore di smorzamento, E, di ripetizione. Utilizzare la funzione seno per mostrare l'ondulazione della posizione del picco in funzione di n.
   3. Trasporta il set di dati di (x, y) al software Origin e traccialo.
   4. Forma la funzione personalizzata data nell'Eqn. (2) in Funzione di adattamento della curva non lineare dell'analisi. Digitate i valori iniziali di A, B, C, D ed E e fate clic su RUN per completare l'adattamento.
9. Imaging TEM
   1. Realizzare i campioni TEM dei colloidi d'oro da 20 nm rivestiti in Aβ _1-40 con griglie di rame rivestite in Formvar. Esaminare i campioni con un TEM funzionante a 80 kV.
   2. Raccogli immagini con un ingrandimento nominale di 28.000x o 71.000x su una fotocamera digitale CCD (AMT) XR-40 da 4 megapixel. Raccogli le immagini TEM per l'oro da 20 nm rivestito Aβ _1-40 ad ogni numero di operazione n = 1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 e 10 (pH 4) e n = 3, 5, 7 e 9 (pH 10).

3. Imaging Raman e studio dell'aggregazione reversibile

1. Porre 100 μl di soluzione su un disco di mica (diametro di 1 cm) per ciascun campione al numero di operazione n. Asciugare i campioni durante la notte prima della misurazione.
2. Raccogliere immagini a luce bianca ad ogni operazione numero n. Preparare il campione separato su un disco di mica poiché il pH è stato continuamente alterato tra ~pH 4 e ~pH 10 per ogni numero di operazione n (Figura 3).
3. Raccogliere l'immagine Raman ad ogni numero di operazione n con un laser di una lunghezza d'onda di λ = 633 nm a 0,5 ± 0,05 mW di potenza con una risoluzione spaziale di ~0,43 μm in una griglia composta da 100 × 100 pixel con un tempo di integrazione di 500 ms/spettro per la regione compresa tra ~200 ^cm-1 e ~2.800 ^cm-1 (Figura 4).
4. Tracciare lo spettro rappresentativo per ogni n allineato in funzione di n e costruire lo spettro SERS tridimensionale in funzione di n per Aβ_1-40 rivestito in oro da 20 nm (Figura 5A). Utilizzare la vista dall'alto dello spettro SERS tridimensionale come mappa di contorno (Figura 5B) per estrarre le modalità specifiche associate a una particolare condizione di pH (ad esempio, ~pH 4 e ~pH 10). Estrae tutte le caratteristiche spettrali migliorate per solo n_pari o solo n_dispari.

Risultati

Con l'attacco di Aβ _1-40 sulla superficie delle particelle nano-colloidali d'oro, la banda SPR intorno al massimo di assorbimento di 530 nm si è spostata significativamente verso il rosso fino alla posizione di picco di ~650 nm quando la soluzione è stata resa più acida (pH 4)³⁵. Insieme alle immagini TEM, abbiamo identificato che le caratteristiche spettroscopiche osservate a pH 4 corrispondono alla formazione degli aggregati colloidali d'oro con conformazione plausibilmente dispiegata e rete con i monomeri Aβ _1-40 circostanti adsorbiti sulla superficie d'oro³⁰. Abbiamo osservato che i monomeri Aβ _1-40 tornano alla conformazione ripiegata in condizioni basiche (pH 10), determinando una deformazione degli aggregati in modo quasi reversibile. Questo processo quasi reversibile era evidente dall'alternanza del picco medio di banda ((n)), che si spostava tra una lunghezza d'onda più corta e una più lunga, e dalla morfologia dispersa rispetto all'aggregato nelle immagini TEM tra condizioni basiche (pH = 10) e acide (pH = 4). È stato precedentemente osservato che una porzione del monomero Aβ _1-40 rimane dispiegata anche dopo che la soluzione è stata riportata alle condizioni basiche³⁶. Il video 1 mostra il cambiamento di colore dipendente dal pH di Aβ _1-40 e del colloide d'oro nudo da 20 nm.

A titolo di confronto, è stata condotta l'indagine sul pH del luppolo di un colloide d'oro nudo a 20 nm (Figura 5C e D). Man mano che l'operazione di modifica del pH procedeva, ha mostrato la crescita della clusterizzazione dei colloidi d'oro in banda SPR, immagini TEM e immagini a luce bianca. Abbastanza interessante, c'erano diverse linee spettrali SERS che dipendevano da n_pari e n_dispari. Ad esempio, a n_pari (pH ~4), la linea a 275 ^cm-1, che è stata assegnata come la modalità associata a Au_n (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)³⁷ o la modalità del ligando Au-Cl^{- 38} è stata osservata intensamente. D'altra parte, per n_pari, a 1008 ^cm-1 C-N str è stato osservato³⁹ e CH₂ wag³⁹, CH₂ la deformazione⁴⁰ sono stati ampiamente osservati a 1291 ^cm-1.

In contrasto con la chiara morfologia di aggregazione reversibile e dipendente dal pH osservata dall'imaging a luce bianca, c'erano differenze relativamente sottili nelle caratteristiche spettrali nello spettro SERS tra n_pari e n_pari. In prima approssimazione, la densità della linea spettrale nella regione compresa tra 250 ^cm-1 e 1750 ^cm-1 era più alta per n_dispari che per n_pari. Le linee spettrali nella regione dell'impronta digitale, 1250 ^cm-1 e 1750 ^cm-1 (bande Ammide I, II e III) per n_odd hanno mostrato caratteristiche spettrali meno risolte, implicando un ampliamento o un aumento delle densità spettrali. Nella Figura 6, una mappa di contorno data nella Figura 5B (Figura 6B) è stata organizzata con i segnali SERS a 761 ^cm-1 (rosso) e 1395 ^cm-1 (blu), che rappresentano le enfasi rispettivamente a n_dispari e n_pari (Figura 6C). Come spettro SERS rappresentativo per n_{pari e dispari, lo} spettro SERS a n = 7 (rosso) e n = 4 (blu) è mostrato in alto (Figura 6A). Al fine di mostrare la corrispondenza con lo spostamento di banda SPR per l'oro da 20 nm rivestito con Aβ_1-40, il grafico dello spostamento di banda nella Figura 3 è mostrato a lato (Figura 6D).

Mentre abbiamo dati preliminari sull'assegnazione completa dello spettro SERS osservato, notiamo qui diverse caratteristiche notevoli dello spostamento Raman. Le linee spettrali e (assegnazioni plausibili) aumentate in n_odd sono principalmente nella regione inferiore a 1000 ^cm-1: 394 ^cm-1 (Trp)41,42,43, 761 ^cm-1 (His, Ala)39,44,45,46,47, 875 ^cm-1 (spostamento dell'indolo NH, allungamento C-C di Met)³⁹, 974 ^cm-1 (Glu, C-COO^- stretching di Asp, modalità associata al citrato)39,48,49. Lo spostamento Raman potenziato a n_{ha anche} mostrato caratteristiche spettroscopiche significative nella regione dell'impronta digitale (Ammide I, II e III): 1166 ^cm-1 (deformazione N-H⁺ di Tyr)^39,41, 1227 ^cm-1 (Ala-Pro-Gly, Ammide III)39,50,51, 1395 ^cm-1 (COO^- allungamento simmetrico o CH₂- CH₃- forbice di Glu)^39,48, 1585 ^cm-1 (allungamento CC dell'anello di Phe, allungamento asimmetrico del carbossilato -Au, COO^- stiramento del citrato, deformazione dell'anello benzenico)39,41,45,46,47,49,52, 1592 ^cm-1 (Phe, Tyr, C=C allungamento di Tyr, CC stiramento dell'anello in Phe, allungamento dell'anello benzenico e COO^- stretching in Phe e Tyr, e stretching asimmetrico di OH)39,41,48,50,51 e 1628 ^cm-1 (Amide I sub peak distintivo per strutture intermolecolari a foglio^{β 53}, C=O e i modi vibrazionali accoppiati CN/NH della spina dorsale proteica originata da strutture parallele di tipo β-sheet, accumulo di Aβ⁵⁴ aggregato, bobine casuali, β-giri, β-forcine⁴⁸. Le sequenze che appaiono per n_{pari o dispari sono} mostrate nella Figura 7. Nel complesso, per n_anche corrispondente all'aggregazione reversibile o alla conformazione dispiegata di Aβ _1-40, Phe/Tyr contenente anello benzenico, lo stiramento simmetrico di COO^-, la modalità di forbice CH 2- CH ₃- di Glu e la deformazione -NH⁺ di Tyr sono stati significativamente coinvolti nel cambiamento conformazionale del peptide. Durante il disassemblaggio dell'aggregazione che è stato osservato quando i peptidi hanno adottato la conformazione ripiegata corrispondente ai modi prominenti a n_dispari, Glu, Asp, Met, His e Ala sembravano essere coinvolti.

Figura 1: L'assorbanza e la morfologia dipendenti dal pH. Vengono mostrati lo spettro di assorbimento a pH 4 (A) e pH 10 (B) per nanoparticelle d'oro rivestite di Aβ _1-40 (20 nm) e le corrispondenti immagini TEM, schizzi di particelle di aggregazione/disperse e immagini di soluzioni in fiale. A è la conformazione dispiegata dei monomeri Aβ _1-40 in condizioni acide e B è la conformazione ripiegata in condizioni basiche. I diagrammi dei monomeri Aβ _1-40 in ciascuna conformazione e morfologia di aggregazione/dispersione sono mostrati accanto alle immagini TEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Reversibilità dell'autoassemblaggio dipendente dalle dimensioni nanometriche. Lo spostamento della posizione media del picco della banda SPR, , in funzione del numero di operazione, n, per tutte le dimensioni testate delle particelle colloidali d'oro. Vengono forniti anche i valori approssimativi di pH e lo stadio corrispondente degli aggregati mostrati nella Figura 1 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: e immagini TEM/luce bianca ad ogni numero di operazione. In funzione del numero di operazione, n, è stato tracciato insieme per Aβ _1-40 rivestito in oro da 20 nm (cerchi chiusi) e in oro da 20 nm colloidale (cerchi aperti) ed è mostrato con immagini rappresentative TEM (A e C)/a luce bianca (B e D) ai numeri di operazione selezionati (n = 1, 2, 3, 7 e 8 contrassegnati da frecce decodificate) per Aβ _1-40 rivestito in oro da 20 nm (A e B) e 20 nm in oro colloidale (C e D). Il carattere nero indica pH 7, il carattere blu indica pH 4 e il carattere rosso indica pH 10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Luce bianca rappresentativa e immagine Raman. L'immagine a luce bianca, l'immagine Raman e lo spettro SERS per (A) n = 2 e (B) n = 3; i) immagine a luce bianca in un ampio campo visivo, ii) immagine a luce bianca nell'area in cui è stata raccolta l'immagine Raman (etichettata da un quadrato rosso in i)), iii) l'immagine Raman di due componenti combinati, iv) immagine Raman della componente 1 e il suo spettro v) SERS di iv), vi) immagine Raman della componente 2, e vii) spettro SERS di vi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Mappa di contorno dello spettro SERS per n_dispari, n_pari e n_tutti. (A) La mappa tridimensionale dello spettro SERS nella regione di 250 ^cm-1 e 1750 ^cm-1 in funzione di n per Aβ_1-40 rivestito di oro da 20 nm con una mappa di contorno mostrata in (B) in alto. (C) La mappa tridimensionale dello spettro SERS nella regione di 250 ^cm-1 e 1750 ^cm-1 in funzione di n per l'oro a 20 nm con una mappa di contorno mostrata in (D) in alto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Mappa di contorno dello spettro SERS. La mappa di contorno dello spettro SERS in funzione di n (1-10). (A) Assorbanza a 1395 ^cm-1 (blu) e 761 ^cm-1 (rosso). (B-D) Il pannello inferiore mostra lo spettro SERS e il pannello destro mostra l'ampiezza della variazione di intensità del segnale dei segnali SERS ad ogni n. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Sequenze notevoli di Aβ_1-40. Le sequenze assegnate ad avere un coinvolgimento significativo a n_dispari (corrispondente alla formazione di conformazione ripiegata) sono indicate da frecce rosse verso il basso, e quelle assegnate ad avere un coinvolgimento significativo a n_pari (corrispondente alla formazione di conformazione dispiegata) sono indicate da frecce blu. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Variazione di colore dipendente dal pH di Aβ_1-40 e colloide d'oro nudo da 20 nm. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

Una considerazione fondamentale negli studi sulla conformazione dei peptidi è il mantenimento del campione, poiché i campioni si deteriorano se conservati in modo improprio. I campioni di peptidi sono stati ricevuti in forma liofilizzata e hanno iniziato a denaturarsi una volta reidratati con acqua distillata deionizzata, anche quando sono stati conservati a -80 °C. La purezza dei colloidi d'oro è stata verificata mediante analisi di controllo qualità. Per mantenere la stabilità dei colloidi, questi sono stati conservati a 4 °C e non congelati. Le soluzioni colloidali d'oro sono state preparate fresche per ogni esperimento perché la soluzione tampone di sali avrebbe destabilizzato il colloide d'oro. Le soluzioni di HCl e NaOH sono state preparate fresche per ogni esperimento.

Le sfide tecniche legate alla lettura e alla registrazione manuale del pH della soluzione con strumenti delicati e alla modifica del pH tra 4 e 10 limitano la precisione dei risultati riportati. Pertanto, non abbiamo osservato risultati coerenti nell'intensità dei segnali SERS. Questo probabilmente ha introdotto un errore nell'ampiezza utilizzata per il grafico di contorno. Il lavoro futuro per verificare le modalità associate a n_pari o n_dispari potrebbe introdurre mutazioni per sostituire gli amminoacidi nella sequenza Aβ _1-40 che riportiamo essere coinvolti nel cambiamento conformazionale della proteina, come i singoli residui di tirosina o asparagina.

"L'interazione tra il monomero Aβ_1-40 e la superficie dell'oro è considerata un'interazione di dipolo, e il livello di legame idrogeno è stato ipotizzato nel lavoro di H. Schmidbauer et ^al.55. In un lavoro separato, abbiamo studiato la spettroscopia SERS in funzione della quantità di Aβ_1-40 in condizioni acide, ha estratto la formazione di adsorbimento dipendente dalle dimensioni nanometriche⁵⁶. Per l'oro a 20 nm, si è ipotizzato che il legame C=C o -C-N dell'istidina (His) iniziasse l'adsorbimento; per l'oro a 80 nm, tuttavia, un modo di respirazione ad anello benzenico di fenilalanina (Phe) o tirosina (Tyr) ha raggiunto la superficie dell'oro per avviare l'adsorbimento. Si è ritenuto che il processo di adsorbimento di Aβ_1-40 sulla superficie dell'oro in condizioni neutre o basiche (pH ~10) mantenga idrofilo il colloide d'oro rivestito di Aβ_1-40 poiché non si sono formati precipitati allo stato acquoso. Tuttavia, i precipitati sono stati osservati a pH 4, il che implica che gli aggregati erano idrofobici.

Le immagini TEM e le immagini a luce bianca mostrano solo indirettamente la prova dell'aggregazione. Abbiamo tentato di condurre una spettroscopia di dicroismo circolare (CD) per correlare la morfologia osservata nell'aggregazione reversibile con le strutture secondarie. Tuttavia, le linee di base di scattering ci hanno impedito di ottenere segnali CD riproducibili. Invece, quindi, abbiamo utilizzato la spettroscopia Raman, concentrandoci maggiormente sui modi migliorati sia quando l'aggregazione (conformazione dispiegata di Aβ_1-40) ha avuto luogo sotto pH ~4 sia quando la disaggregazione (conformazione dispiegata di Aβ_1-40) sotto pH ~10. Pertanto, la migliore speculazione per identificare la struttura secondaria in questo lavoro è stata limitata al monitoraggio dei nodi associati alle strutture secondarie. Ciò è stato dimostrato nell'osservazione del foglio di β a 1628 ^cm-1, in particolare in condizioni di pH 4.

Questo studio ha osservato solo il cambiamento nella conformazione peptidica per i colloidi d'oro di 20 nm di diametro e ha studiato solo n fino a 10. Le proprietà di conformazione e aggregazione del peptide Aβ _1-40 potrebbero essere alterate dalla dimensione della particella che assorbono a⁵⁶. Pertanto, è necessario ulteriore lavoro per comprendere le proprietà dei peptidi che si basano sulla rete tra monomeri e quelli che sono influenzati dalle caratteristiche fisiche della superficie di adsorbimento. Nelle condizioni che abbiamo testato, solo i colloidi d'oro di 20 nm di diametro hanno mostrato reversibilità della morfologia dell'aggregazione, e i meccanismi di come il diametro del colloide influenza la reversibilità di questa proprietà non sono noti. L'aumento di n fino a 20 potrebbe fornire maggiori informazioni sul grado di reversibilità della morfologia dell'aggregazione dipendente dalla modalità. Queste indagini su come le dimensioni del colloide d'oro influenzano l'aggregazione del peptide beta-amiloide produrranno importanti intuizioni sui meccanismi molecolari della patologia del morbo di Alzheimer.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Il peptide beta amiloide 1-40 (Aβ 1– 40 peptide)	r-Peptide (Bogart, GA, USA)	A-1156-2
CCD	fotocamera digitale AMT	XR-40 CCD da 4 megapixel
Acqua distillata deionizzata dal sistema idrico Milli-Q	Millipore Sigma (Burlington, MA, USA)	Milli-Q IQ 7000
Freezer -86 oC	Thermo Scientific	Revco Chilly Willy  Numero 187004 di build 40.04
Colloide d'oro (10 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15703-20
Colloide d'oro (100 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15711-22
Colloide d'oro (15 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15704-20
Colloide d'oro (20 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15705-20
Colloide d'oro (30 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15706-21
Colloide d'oro (40 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15707-21
Colloide d'oro (50 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15708-21
Colloide d'oro (60 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15709-22
Colloide d'oro (80 nm)	Ted Pella, Inc. (Redding, California, USA)	15710-22
Dischi di mica V1AFM di grado più elevato 10 mm	Ted Pella Inc.	#50
Soluzione standard di acido cloridrico, 1.0 N	Fluka	Lot# SHBB4705V        318949-2L
Macro quarzo quvette Light Path 10 mm	Fire Fly Science	Tipo1-MC-PathElettrodo micro pH da 10 mm
	HORIBA	Modello 9618S (MFG n. 9Y8E0050)
Peak Fit Program	Origin (Northampton, MA, USA)	OriginPro2018b (64 bit) b9.5.5.409 (accademico)
Soluzione tampone pH 4.00	VWR	Cat No. 34170-127
Soluzione tampone pH 7.00	Fisher Chemical	SB107-4 Lotto 191041
pHmetro	HORIBA	Modello F-72G (MFG n. B27M0017)
Punte per pipette   Maxi Tips 1– 5 ml di	Fisher	02-707-467
Punte per pipette 10 mL	Fisher	02-717-135
Punte per pipette 1000 mL	Fisher	02-717-156
Punte per pipette 1– 200 mL	Fisher	02-717-143
Pipetta Fisher Brand Elite 0,5 ml; Pipetta	Fisher	QU05317
Brand Elite 100– Pipetta	Fisher	QU01672
Fisher Brand Elite 10– 100 ml Fisher		MU10985
Pipetter Fisher Brand Elite 1– 10 mL	soluzione di
1,0 M	Lotto Fluka	#05096BPV    319511-2L
TEM	FEI Co	Morgagni modello 268
Provette per PCR TempAssure, tappi piatti, naturali	Polipropilene USA Scientific		. Provette singole a parete sottile da 0,2 mL con tappi piatti smerigliati attaccati
Spettrofotometro UV-Vis-NIR	Varian	CARY 5000 UV1106M074
WI Tec alpha300R Microscopio Raman confocale	WITec-Oxford Strumento	XMB3000-3001