Articolo metodologico

Isolamento e identificazione di ceppi batterici dalla pelle di anfibi terrestri

DOI:

10.3791/67862

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17 giugno 2025

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1Department of Life, Health, and Environmental Sciences (MeSVA), University of L'Aquila

In questo articolo

Sommario

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Si tratta di un metodo per il campionamento e l'isolamento di batteri coltivabili dal microbiota cutaneo delle salamandre pletodontidi europee (genere Speleomantes). Qui presentiamo un protocollo per il campionamento della pelle di salamandra con tamponi e la loro elaborazione utilizzando approcci coltivabili. Descriviamo il campionamento, l'isolamento e l'instaurazione della coltura axenica con la caratterizzazione del ceppo batterico.

Abstract

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Il microbiota è un elemento vitale degli organismi superiori, con il microbiota cutaneo che contribuisce in modo significativo alla difesa dell'organismo contro gli agenti esterni. Non esiste un metodo standard per campionare le comunità microbiche cutanee di Speleomantes (Amphibia: Plethodontidae) per l'approccio di coltura microbica. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un protocollo pratico per isolare i batteri dalla pelle degli individui e una best practice per la manipolazione e la conservazione dei campioni. I passaggi sono semplici: i tamponi vengono conservati in una soluzione fisiologica salina integrata con glicerolo al momento del prelievo. Una volta trasferiti in laboratorio, i tamponi possono essere conservati a +4 °C per un massimo di 10 giorni per garantire l'integrità della comunità microbica. Questo studio offre interessanti spunti per lo studio del microbiota cutaneo di specie di anfibi terrestri, come quelle appartenenti al genere Speleomantes. Questo approccio contribuisce all'attuazione, al monitoraggio e alla conservazione delle misure per le specie in via di estinzione e potrebbe migliorare la conoscenza della funzione del microbiota nella salute e nell'ecologia degli anfibi. Questo protocollo può anche avere un significato più ampio per la ricerca sul microbioma in molti scenari di conservazione della fauna selvatica.

Introduzione

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Tutti gli organismi ospitano una varietà di simbionti microbici sulle loro superfici epiteliali, tessuti e organi1. La pelle è l'interfaccia primaria tra l'ospite e il suo ambiente, fornendo un habitat per diversi microrganismi2. La pelle è l'organo più grande dei vertebrati e funge da barriera alle aggressioni meccaniche, chimiche e microbiche3. Tuttavia, questa ampia esposizione della pelle alle condizioni ambientali la rende probabilmente la frontiera ecologica più critica che media l'interazione dell'organismo con fattori biotici e abiotici esterni4.

Il microbiota cutaneo degli anfibi è stato studiato intensamente nell'ultimo decennio e la relazione tra questa comunità microbica e il suo ospite è stata esplorata a fondo 5,6,7,8,9,10. La biodiversità del microbiota cutaneo è in gran parte determinata dal tipo di ospite (cioè dalla comunità specie-specifica), ma ulteriori fattori ambientali possono promuovere una maggiore diversità interspecifica11. Il microbiota cutaneo degli anfibi ha una composizione distintiva rispetto ad altri animali. È noto che gli anfibi hanno dimostrato di avere una relazione mutualistica con i loro microbi della pelle, essendo in grado di biosintetizzare composti antimicrobici o proteggere il loro ospite dalle malattie infettive emergenti12.

L'isolamento dei batteri dalla pelle viene solitamente raggiunto dopo aver compiuto diversi passaggi. Il primo passo consiste nell'ottenere una raccolta rappresentativa del campione mediante tampone ed evitare la contaminazione esterna. I campioni microbici sono sospesi in soluzione salina sterile o tampone. L'integrazione di liquidi in sospensione con protettivi (ad es. glicerolo) potrebbe migliorare l'integrità della comunità batterica durante il trasferimento in laboratorio13,14. Una volta trasferiti in laboratorio, i campioni possono essere elaborati immediatamente o dopo un breve periodo di tempo per mantenere l'integrità della comunità microbica. L'approccio microbico classico prevede l'elaborazione del campione mediante diluizione seriale per ridurre la densità microbica e garantire una migliore separazione delle colonie sulle piastre di Petri. Le diluizioni del campione e seriali vengono quindi strisciate su terreni non specifici e non selettivi come l'agar Luria-Bertani (LBA)15, la soia triptica (TSA)16, l'estratto di lievito triptone agar (TYEA)17,18,19 o il nutriente (NA)20 che supportano la crescita di un'ampia gamma di batteri. Durante il campionamento e l'elaborazione vengono utilizzati arricchimenti non selettivi poiché è necessario coltivare un'ampia gamma di microbi. I metodi a strisciatura o a piastra allargata distribuiscono uniformemente la sospensione microbica sulla superficie dell'agar21. La distribuzione uniforme consente alle diverse specie microbiche presenti nel campione di formare colonie distinte. Dopo un'incubazione a 20-37 °C per 2-7 giorni, le colonie microbiche vengono contate e distinte in base alla morfologia. La caratterizzazione morfologica della colonia batterica è stata eseguita sulla base della pigmentazione, della forma, dell'elevazione, del margine, dell'opacità e della superficie. Le colonie ben isolate con le diluizioni più elevate vengono sub-coltivate in piastre di agar fresche per purificare le colture microbiche. La purezza delle colonie è assicurata in base all'uniformità cellulare e all'affinità per la colorazione di Gram. Diversi test biochimici o molecolari possono anche essere eseguiti per verificare la purezza delle colonie22. Le colture pure di ceppi isolati possono essere conservate su inclinazioni di agar a 4 °C per un uso a breve termine o conservate a lungo termine a -80 °C in crioprotettori (ad esempio, un rapporto glicerolo/medio di 20:80 o 50:50)23.

In questo protocollo, riportiamo l'approccio best practice per isolare i batteri dal microbiota cutaneo delle salamandre delle caverne di Speleomantes , anfibi rigorosamente terrestri che possono vivere sia in ambienti superficiali che sotterranei24. Data la mancanza di protocolli universalmente applicati in letteratura, questo studio mirava a sviluppare una best practice per il campionamento e la conservazione di campioni di microbiota cutaneo da questi anfibi terrestri. Per testare questo protocollo, abbiamo utilizzato la salamandra delle caverne italiana (Speleomantes italicus) come modello, campionando 12 individui da una popolazione rupestre situata in Abruzzo (Italia). Gli individui sono stati raccolti a mano e tamponati ripetutamente (almeno 5 volte) sui lati dorsali, ventrali e sui fianchi. I tamponi usati sono stati immersi in acqua distillata sterile. I tamponi sono stati poi immersi in soluzione fisiologica salina allo 0,9% con e senza integrazione di glicerolo. Al momento del trasferimento in laboratorio, la conservazione del campione è stata testata in varie condizioni: temperatura ambiente non controllata, 4 °C e -20 °C per 10 giorni. Le comunità microbiche coltivabili sono state confrontate utilizzando metodi basati sulla coltura su terreni generici e semi-selettivi (LBA, TSYEA, TSA, NA).

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Protocollo

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Questo protocollo presenta le migliori pratiche per l'ottenimento e la manipolazione di campioni di pelle di Speleomantes per un approccio microbiologico coltivabile per isolare i ceppi batterici. Il materiale utile nei passaggi successivi è elencato nella Tabella dei materiali. Il protocollo segue le linee guida per la cura degli animali di cui all'articolo 11 del DPR 357/97 previa autorizzazione del Ministero dell'Ambiente (PNM 74554 del 22/04/2024).

1. Preparazione dei terreni

  1. Calcolare e pesare la quantità di ingredienti in polvere (vedere le istruzioni del produttore per la quantità di polvere utilizzata per LBA, TSYEA, TSA, NA o altri mezzi).
  2. Seguire le istruzioni del produttore per sciogliere gli ingredienti in acqua distillata. A seconda del mezzo e del prodotto acquistato, potrebbero essere necessarie fasi di ebollizione.
  3. Portare il terreno al volume finale quando gli ingredienti si sono completamente sciolti e controllare il pH. Se il valore è superiore o inferiore al previsto, regolarlo utilizzando le soluzioni suggerite nelle istruzioni del produttore. Le soluzioni di HCl e NaOH sono comunemente usate rispettivamente per diminuire e aumentare il pH.
  4. Aggiungere l'agar agar (2% p/v), scaldare fino a 95 °C e far bollire per circa 1 minuto per sciogliere l'agar prima dell'autoclave.
  5. Sterilizzare il terreno in autoclave, seguendo le istruzioni del produttore. I processi di sterilizzazione in autoclave comuni includono 121-134 °C per un trattamento di 15-30 minuti.
  6. Dopo la sterilizzazione in autoclave, raffreddare il terreno di coltura agar a circa 45-50°C e versarlo in piastre di Petri sterili sotto una cappa a flusso laminare precedentemente sterilizzata
  7. Dopo la solidificazione, etichettare le piastre in base al tipo di terreno e alla data di preparazione.

2. Raccolta dei campioni

  1. Sciacquare la pelle della salamandra (genere Speleomantes) in acqua distillata sterile per rimuovere le comunità microbiche transitorie.
  2. Raccogli i tamponi cutanei dagli anfibi usando tamponi di cotone sterili in una provetta. Strofinare delicatamente i tamponi sulla superficie della pelle per raccogliere campioni microbici senza danneggiare l'individuo.
    1. Passare un tampone imbevuto di acqua distillata sterile su ciascun lato di tutto il corpo, comprese tutte le estremità, cinque volte (cinque colpi avanti e indietro) per campionare gli individui.
      NOTA: L'integrazione con additivi non è raccomandata poiché potrebbe danneggiare le persone.
    2. Porre i tamponi in provette contenenti soluzione fisiologica salina (NaCl allo 0,9%) integrata con glicerolo (20%).
  3. Miscelare il campione con la soluzione, spingendo il tampone verso le pareti della provetta mentre si stringe la provetta e ruotando accuratamente il tampone (10 volte in senso orario e 10 volte in senso antiorario).
  4. Dopo la miscelazione, chiudere il tampone all'interno della provetta e trasferire i campioni microbiologici in laboratorio, mantenendo il campione a 4 °C fino all'analisi microbica.
    NOTA: Tutte le fasi vengono eseguite utilizzando nuovo materiale sterile e guanti per ogni individuo per evitare la contaminazione e l'esposizione dell'operatore a contaminanti biologici e chimici.

3. Inoculazione e incubazione

  1. Mescolare accuratamente il campione microbiologico prima dell'elaborazione.
  2. Preparare diluizioni seriali del campione cutaneo con soluzione salina (NaCl allo 0,9%), che vanno da 10-1 a 10-6.
  3. Inoculare 100 μl di campione tal quale e diluizioni seriali sulle piastre di agar preparate. Utilizzando un anello sterile a forma di L, strisciare il campione sulla superficie del terreno di agar, distribuendolo uniformemente senza applicare una pressione eccessiva per evitare di danneggiare l'agar.
  4. Capovolgere le piastre inoculate in un'incubatrice a 20-25 °C per 3-5 giorni. Questo intervallo di temperatura è favorevole per la crescita di molti batteri ambientali mesofili e psicotropi che abitano la pelle degli anfibi.
    NOTA: Tutti i passaggi vengono eseguiti utilizzando materiale sterile sotto una cappa laminare precedentemente sterilizzata. Per ogni unità sperimentale vengono preparate cinque repliche indipendenti. Poiché la densità iniziale è sconosciuta e imprevedibile, è sempre utile includere un'ampia gamma di diluizioni.

4. Purificazione e identificazione dei deformazioni

  1. Selezionare colonie batteriche con morfologie distinte per ulteriori analisi dopo l'incubazione.
    1. Innanzitutto, scegli colonie ben isolate per evitare contaminazioni o sovrapposizioni ed evitare aree affollate in cui le colonie potrebbero fondersi. Inoltre, scegli colonie con aspetti diversi (ad esempio, colore, dimensioni, forma, bordo, superficie o consistenza) per garantire il campionamento di specie o ceppi potenzialmente diversi.
      NOTA: Questo passaggio è fondamentale per selezionare i diversi ceppi batterici coltivabili del microbiota cutaneo.
  2. Sottocultura le colonie selezionate.
    1. Trasferire una colonia ben isolata della piastra di agar originale in modo asettico su una piastra di agar fresca utilizzando un circuito di inoculazione. Striare la colonia per isolarla e poi incubarla in modo appropriato.
    2. Ripetere questo passaggio più volte su piastre di agar fresche per ottenere colture pure da ciascun isolato batterico fino a quando le colonie isolate non appaiono simili. Ripetere la subcoltura utilizzando terreni selettivi e generici.
      NOTA: La combinazione di manipolazione asettica, esame visivo e microscopico e identificazione molecolare garantisce una deformazione priva di contaminazione.
  3. Verificare la purezza delle colture microbiche mediante osservazioni microscopiche (da 5x a 100x obiettivi), affinità di colorazione di Gram (fissaggio, colorazione e osservazione delle colonie) e test biochimici (ad es. catalasi, ossidasi, ureasi e test di fermentazione dello zucchero)21,25.
    NOTA: Le colture pure dovrebbero mostrare una morfologia uniforme della colonia, caratteristiche microscopiche coerenti e tratti biochimici.
  4. Eseguire l'identificazione molecolare.
    1. Estrarre il DNA da colonie batteriche purificate ed eseguire il sequenziamento del gene 16S rRNA per identificare le specie batteriche. Eseguire l'amplificazione PCR del gene 16S rRNA utilizzando primer universali batterici, seguita dal sequenziamento e dal confronto con sequenze note in database come GenBank26.
  5. Stabilire colture di biobanche.
    1. Testare la sterilità delle colture axeniche (o pure) inoculandole in un mezzo non selettivo e verificando l'assenza di crescita di contaminanti. Conservare le colture axeniche per l'uso a medio e lungo termine.
      NOTA: I metodi standard includono la striatura di colonie su inclinazioni di agar del terreno selettivo e la conservazione a temperatura ambiente, la sospensione della coltura in soluzioni madre preparate con una miscela di terreno selettivo e glicerolo (20:80 o 50:50), o la liofilizzazione in brodo (liofilizzazione) e il congelamento a -80 °C.

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Risultati

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Il flusso di lavoro dell'approccio sperimentale è illustrato nella Figura 1.

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Figura 1: Flusso di lavoro del campionamento, della manipolazione e dell'elaborazione dei campioni di pelle di anfibio. Fare ...

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Discussione

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Abbiamo sviluppato un protocollo di best practice per ottenere una comunità di batteri coltivabili dal microbiota cutaneo degli anfibi e lo abbiamo dimostrato su Speleomantes italicus. Come dimostrato nella domanda di cui sopra, è necessario adottare diverse misure per garantire il successo dell'isolamento microbico dalla pelle degli anfibi. La raccolta, utilizzando una tecnica di tampone delicato e materiali sterili, è molto importante per raccogliere materiale microbi...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il sostegno finanziario dell'Università degli Studi dell'Aquila nell'ambito dei progetti "Progetti di Ateneo per la Ricerca di base 2024 UNIVAQ: Ecotossicologia delle geotritone europee in via di estinzione" e "Analisi delle divergenze inter- e intraspecifiche del microbiota dei pletodontidi europei - FFORIC24.35" di Biodiversa+, il partenariato europeo per la biodiversità, nell'ambito del progetto Sub-BioMon - Sviluppo e sperimentazione di approcci per monitorare la biodiversità sotterranea nel carso nell'ambito del progetto Bando congiunto BiodivMon 2022-2023, e Piano Nazionale di Ripresa e Resilienza (PNRR), Missione 4, Componente 2, Investimento 1.1, Bando n. 1409 pubblicato il 14.9.2022 dal Ministero dell'Università e della Ricerca (MUR), finanziato dall'Unione Europea - NextGenerationEU- Codice del progetto: P2022CYF9L, Titolo del progetto Le specie di grotta facoltative sono driver di contaminanti metallici negli ambienti sotterranei? (METALCAVE) - TAZZA E53D23015380001.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lauria-Bertani agarMerk MilliporeL3027
Tryptic Soy AgarMerk Millipore22091
Tryptone Soia Estratto di lievito AgarMerk Millipore17221
Nutriente AgarMerk Millipore70148
Soluzione di gliceroloMerk Millipore49781

Riferimenti

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