Articolo metodologico

Analisi delle sottopopolazioni piastriniche mediante citometria a flusso multicolore

DOI:

10.3791/67878

⸱

10 giugno 2025

 ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology, University Hospital Tübingen, University of Tübingen

In questo articolo

Sommario

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La citometria a flusso multicolore per le piastrine può identificare nuovi sottotipi piastrinici all'interno delle sottopopolazioni piastriniche classiche, come le piastrine a riposo, aggregatorie, procoagulanti e apoptotiche. Ciò consente il confronto di diversi modelli di sottopopolazione indotti da vari agonisti piastrinici. Qui, viene descritta in dettaglio una procedura per stabilire un pannello di citometria a flusso multicolore.

Abstract

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Le piastrine, o trombociti, sono piccole cellule del sangue anucleate che svolgono un ruolo cruciale nell'emostasi e nella trombosi. Difetti nelle funzioni piastriniche possono causare sanguinamento o eventi trombotici in pazienti con malattie cardiovascolari. Pertanto, è importante caratterizzare fenotipicamente le piastrine per essere in grado di assegnare le sottopopolazioni piastriniche alla funzione piastrinica. La stimolazione delle piastrine umane con agonisti e attivatori piastrinici induce cambiamenti morfologici e fisiologici nelle piastrine, accompagnati da cambiamenti nella popolazione dei recettori di superficie. Ciò porta a sottopopolazioni piastriniche funzionalmente diversificate. Le sottopopolazioni piastriniche classicamente definite sono le piastrine a riposo, aggregatorie, procoagulanti e apoptotiche. Per caratterizzare l'effetto degli agonisti sui sottotipi piastrinici, abbiamo stabilito un test utilizzando la citometria a flusso multicolore costituito da 10 diversi anticorpi e coloranti (anti-CD62P, anti-CD63, anti-CD61, anti-CD41, anti-CD42b, anti-IntegrinaαIIbβ3 (clone: PAC-1), anti-CXCR4, anti-ACKR3, Annexin V, Zombie NIR). Le piastrine umane isolate sono state incubate con agonisti piastrinici e colorate con anticorpi e coloranti specifici coniugati con fluorofori. Successivamente, sono stati misurati mediante citometria a flusso. Questo ci permette di definire sottotipi specifici dell'agonista all'interno delle classiche quattro sottopopolazioni. In conclusione, la combinazione di marcatori di attivazione (anti-CD62P, anti-CD63, anti-IntegrinaαIIbβ3 (clone: PAC-1)), marcatori infiammatori (anti-CXCR4, anti-ACKR3) e marcatori apoptotici (Annexin V, Zombie NIR) che compongono il pannello di citometria a flusso a 10 colori descritto in questo manoscritto apre la possibilità di definire ulteriori sottotipi piastrinici che potrebbero essere collegati a una specifica funzione piastrinica. Questo metodo può essere applicato nella ricerca di base sulla funzione piastrinica e sulla fisiologia, nonché nella definizione di nuovi sottotipi piastrinici in modelli di malattia e studi sui pazienti.

Introduzione

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I trombociti, chiamati anche piastrine, sono piccole cellule del sangue prive di nucleo, essenziali per l'emostasi e lo sviluppo della trombosi 1,2. Possono essere attivati da vari agonisti piastrinici. I classici agonisti fisiologici delle piastrine sono l'adenosina difosfato (ADP), che si lega ai recettori P2Y12 e P2Y1, la trombina che attiva le piastrine attraverso i recettori PAR1 e PAR4 e il collagene che interagisce con la glicoproteina VI. Il collagene può essere sostituito in esperimenti in vitro dal peptide correlato al collagene (CRP-XL)3,4. Recentemente, è stato dimostrato che l'emina induce l'attivazione piastrinica attraverso l'interazione del recettore lectina-simile di tipo C (CLEC-2) e della glicoproteina VI (GPVI), stabilendo l'emina come un nuovo attivatore/agonista piastrinico endogeno 5,6. Diverse situazioni patologiche possono portare all'emolisi, con conseguente liberazione di emina libera contenente ferro ferrico. Tutti questi agonisti piastrinici alterano l'espressione del recettore di superficie sulle piastrine. L'alterazione dei recettori di superficie e della membrana plasmatica dipende dalla forza e dalla concentrazione dell'agonista piastrinico 7,8,9. Pertanto, è importante caratterizzare fenotipicamente le piastrine per essere in grado di assegnare le sottopopolazioni piastriniche alla funzione piastrinica.

Metodi ad alta dimensionalità come la citometria a flusso hanno rivelato che le piastrine formano sottopopolazioni con funzioni distinte. Le sottopopolazioni possono essere classificate in base a diversi marcatori di superficie. In letteratura è noto che sono presenti due distinte sottopopolazioni piastriniche: il procoagulante, che è caratterizzato da esternalizzazione della fosfatidilserina, e il fenotipo aggregatorio che attiva l'integrina αIIIbβ3. Oltre ai classici marcatori di attivazione, i coloranti a fluorescenza come il glutatione-S-arilossido (GSAO) che rileva la funzione mitocondriale e lo stress ossidativo possono essere utilizzati per ulteriori categorizzazioni, ad esempio le piastrine procoagulanti in base al loro stato metabolico10. Ciò consente di distinguere tra palloncino e granulotipo piastrinico procoagulante11 per la formazione di pori di transizione della permeabilità mitocondriale (MPTP).

Heemskerk et al. hanno dimostrato, analizzando l'esposizione alla fosfatidilserina (PS) e l'attività delle integrine αIIbβ3, che diverse popolazioni piastriniche possono controllare fasi distinte della coagulazione e che forti attivatori come trombina e collagene sono necessari per l'esposizione alla fosfatidilserina12. Inoltre, l'attivazione delle piastrine da parte della GPVI con il collagene o l'agonista specifico della GPVI convulxina è la principale responsabile della formazione di piastrine procoagulanti aderenti. Allo stesso modo, l'acido arachidonico, che porta all'attivazione piastrinica producendo trombossano A2 da parte della cicloossigenasi, induce l'esposizione al PS13. Tuttavia, l'acido arachidonico è, rispetto alla trombina o al collagene, un debole attivatore piastrinico14. Van Velzen et al. hanno anche valutato gli antigeni di superficie piastrinica (CD42a/b, CD36, CD41, CD61) e i marcatori di attivazione (PAC-1, CD63, CD62P) in due misurazioni separate15. Inoltre, van Velzen et al. sono stati in grado di analizzare il sangue di pazienti con tromboastenia e hanno confrontato le sottopopolazioni tra pazienti sani e malati. Hindle et al. hanno misurato l'influenza della prostaciclina sulle sottopopolazioni piastriniche dopo il trattamento con trombina e CRP-XL con due pannelli individuali costituiti da quattro marcatori ciascuno (PAC-1, Annexina V, CD62P, CD42b o CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)16. Recentemente, la citometria a flusso multicolore è stata utilizzata per definire sottopopolazioni piastriniche a riposo (CD42b+, PAC1-, CD62P-, Annessina V-), aggregatorie (CD42b+, PAC1+, CD62P+, Annessina V-) procoagulanti (CD42b+, PAC1-, CD62P+, Annessina V+) e apoptotiche (Cd42b-, PAC1-, CD62P-, Annessina V+) 7,17. Laspa et al. hanno esteso/perfezionato l'approccio della citometria a flusso multicolore mediante l'aggiunta di anticorpi contro i recettori delle chemochine CXCR4 e ACKR318. Sulla base della letteratura disponibile, questo è il primo pannello di citometro a flusso a 10 colori per piastrine umane isolate che consente la rilevazione di 10 diversi antigeni su una singola piastrina (a livello di singola cellula) all'interno di una popolazione di piastrine umane isolate in una provetta. Pertanto, è possibile misurare simultaneamente il potenziale di attivazione, adesione e aggregazione, i recettori delle chemochine e il potenziale apoptotico di una singola cellula per distinguere ulteriormente la sottopopolazione esistente. Pertanto, integra Johnson et al., che hanno definito le quattro principali sottopopolazioni con quattro marcatori (a riposo, procoagulante, aggregatorio, apoptotico)17. Pertanto, la messa a punto di un test di citometria a flusso multicolore consente di confrontare diversi agonisti piastrinici per quanto riguarda il loro pattern di attivazione e la formazione di sottotipi piastrinici all'interno delle sottopopolazioni piastriniche classiche.

Il metodo può essere utilizzato per la ricerca di base riguardante l'analisi della funzione piastrinica e della fisiologia. Inoltre, il consolidato test di citometria a flusso multicolore per piastrine umane può essere eseguito con piastrine acquisite nell'ambito di studi su pazienti, ad esempio ricerche su malattie cardiovascolari ed eventi trombotici, per decodificare le sottopopolazioni piastriniche indotte da queste malattie e gli effetti dei trattamenti su questi fenotipi indotti. Ad esempio, Mueller et al. hanno dimostrato che le sottopopolazioni piastriniche possono differire nei pazienti con stenosi aortica19. Le conoscenze acquisite potrebbero offrire nuove opportunità per gli interventi farmaceutici.

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Protocollo

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La raccolta e la manipolazione del sangue a scopo di ricerca sono state approvate dal Comitato etico della Facoltà di Medicina dell'Università Eberhard Karls e dell'Ospedale universitario di Tubinga (voto etico 238/2018B02) e le metodologie di studio sono state conformi agli standard stabiliti dalla Dichiarazione di Helsinki. I donatori sani hanno dato il consenso informato scritto per la raccolta del sangue. Le caratteristiche di base per i donatori sani sono elencate nella Tabella 1. La Figura 1 fornisce una panoramica del protocollo di citometria a flusso.

1. Isolamento delle piastrine umane dal sangue intero

NOTA: Le linee guida ISTH sono state seguite in termini di raccolta dei campioni, lacci emostatici e scelta dell'anticoagulante al fine di garantire un modo standardizzato per isolare le piastrine20.

  1. Preparazione del tampone
    1. Tampone anticoagulante acido-citrato-destrosio (ACD): sciogliere 12,50 g di Na 3-Citrat (85 mM C6H5Na3O7 x 2 H2O), 6,82 g di acido citrato (71 mM) e 10,00 g di glucosio (111 mM) in 475 mL di aqua destillata. Regolare il pH con 1 M NaOH a 4,69. Riempire fino a 500 mL con aqua destillata. Quindi, filtrare, sterilizzare il tampone e conservarlo a 4 °C fino al momento dell'uso.
      NOTA: Tutte le soluzioni sono sterilizzate con filtro con un sistema di filtraggio a vuoto, che utilizza una membrana in polietere solfone a flusso rapido con pori di 0,22 μm.
    2. Tampone di Tyrode (10x): Pesare 80,00 g di NaCl, 10,15 g di NaHCO3 e 1,95 g di KCl e aggiungere acqua destillata a 1 L. Filtrare sterilizzare il tampone e conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.
    3. Tampone Tyrode's-HEPES (1x; 137 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 5 mM glucosio, 10 mM HEPES): Miscelare 10 mL di 10x tampone Tyrode e 90 mL di aqua destillata. Sciogliere 0,1 g di glucosio e 0,1 g di albumina sierica bovina (BSA). Regolare il pH con acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) a 7,4. Impostare 10 mL di tampone di Tyrode a pH 7,4 e regolare il pH dei 90 mL residui di Tyrode a 7,4 con 1 N HCl a pH 6,5.
      NOTA: BSA potrebbe raccogliere alcune sostanze chimiche, come l'emina. In questo caso, è importante preparare il buffer di Tyrode 1x senza BSA. Tutti i tamponi devono essere lasciati riscaldare a temperatura ambiente o a 37 °C prima dell'uso.
  2. Raccolta di campioni di sangue
    1. Preparare per ogni donatore una siringa da 10 ml con 2 ml di anticoagulante ACD e lasciarla regolare a temperatura ambiente o a 37 °C utilizzando un incubatore. Mantenere il fattore di diluizione di 1:5 (ACD: sangue).
      NOTA: Utilizzare siringhe più piccole o più grandi per prelevare campioni di sangue. Il tampone ACD freddo potrebbe preattivare le piastrine e compromettere i risultati.
    2. Utilizzare un ago a farfalla (21G) per raccogliere lentamente il sangue del donatore nelle siringhe ACD preriscaldate. Aprire il tubo del laccio emostatico prima di riempire la siringa per evitare la pre-attivazione.
      NOTA: Le siringhe con un ago di calibro maggiore possono ridurre al minimo l'attivazione delle piastrine indotta dal taglio.
    3. Trasferire lentamente il sangue ACD in una provetta di reazione da 15 mL. Utilizzare immediatamente il sangue per evitare la pre-attivazione delle piastrine.
  3. Isolamento piastrinico
    1. Centrifugare il sangue ACD per 20 minuti a 209 x g (temperatura ambiente, RT) senza freni. Preparare 25 mL di tampone Tyrode's-HEPES pH 6,5 in una provetta di reazione da 50 mL.
    2. Trasferire delicatamente il plasma ricco di piastrine risultante (PRP, strato superiore) nella provetta di reazione da 50 mL contenente il tampone Tyrode-HEPES, pH 6,5.
    3. Lasciare circa 1 mL di PRP sopra il buffy coat e gli eritrociti per evitare la contaminazione con altre cellule del sangue.
    4. Centrifugare la sospensione a 430 x g per 10 minuti a RT per pellettare le piastrine. Risospendere con cura il pellet risultante in 200-300 μl di tampone Tyrode, pH 7,4.
    5. Utilizzare un contatore di cellule per determinare la conta piastrinica. Regolare la conta piastrinica con il tampone HEPES di Tyrode pH 7,4 a 200 x 103 piastrine/μL. Vedere il passaggio 3 per l'ulteriore elaborazione della colorazione piastrinica.

2. Selezione e titolazione di anticorpi per citometria a flusso

  1. Selezione di anticorpi e coloranti
    1. Selezionare gli anticorpi e i coloranti con fluorofori adatti per il citometro a flusso21. Notare la configurazione del filtro consigliata dal produttore del citometro a flusso. Un esempio di marcatori piastrinici e configurazione del fluoroforo è fornito nella Tabella 2 e nella Figura 2 per il seguente citometro: BD LSR Fortessa con configurazione laser: viola (402 nm), blu (488 nm), giallo/verde (561 nm), rosso (640 nm).
      NOTA: Utilizzare fluorocromi più luminosi per antigeni a bassa espressione. Ad esempio, i fluorocromi luminosi BV412 e BV650 sono stati utilizzati per i recettori delle chemochine debolmente espressi (ACKR3 e CXCR4)22,23,24.
  2. Titolazione di anticorpi e coloranti
    1. Titola gli anticorpi per trovare la giusta concentrazione di lavoro. Per la titolazione, utilizzare piastrine umane isolate dalla fase 1 e una serie di concentrazioni dell'anticorpo.
      NOTA: Le concentrazioni di lavoro fornite dal produttore sono generalmente un buon punto di partenza per la serie di concentrazioni.
      1. Se si lavora con antigeni che vengono espressi solo durante il trattamento, attivare le piastrine prima della colorazione per essere sicuri che possano essere rilevate anche le cellule negative e positive. Ad esempio, PAC-1 si lega solo all'integrina attivata αIIbβ3. Pertanto, attivare fortemente le piastrine per ottenere un segnale luminoso e positivo, ad esempio con 10 μg/mL di peptide correlato al collagene (CRP; vedi Figura 3).
  3. Titolazione dei campioni
    1. Isolare le piastrine umane come al punto 1 e regolare la conta piastrinica su 1 x 106 piastrine per campione.
      1. Per i recettori che non necessitano di attivazione prima della colorazione: CD61, CD42b, CD41, CXCR7, CXCR4 utilizzare un campione non colorato e un campione colorato per anticorpo. Per i recettori/marcatori che devono essere attivati con, ad esempio, 10 μg/mL di CRP-XL prima della colorazione: PAC1, CD63, CD62P, Annexina V, Zombie NIR, utilizzare un campione attivato e uno non attivato 15,25,26.
    2. Attivare le piastrine (1 x 106 piastrine per campione) se necessario per 30 minuti con 10 μg/mL CRP-XL. Quindi, incubare le piastrine isolate (1 x 106 piastrine per campione) per 30 minuti con diverse concentrazioni dell'anticorpo o del colorante coniugato con fluorocromo e aggiungere 300 μl di 1x tampone legante l'annessina per diluire il campione (esempi di concentrazioni sono riportati nella Tabella 3).
    3. Misura 10.000 eventi per ogni campione.
    4. Calcolare l'indice di colorazione che mostra la separazione ottimale delle popolazioni positive e negative per ogni anticorpo, come mostrato nella Figura 1 supplementare.
    5. Tracciare l'indice di colorazione per ogni concentrazione di anticorpi per trovare la concentrazione ottimale.

3. Colorazione per citometria a flusso

NOTA: Vedere la Tabella 4 per un esempio di colorazione con quattro diversi attivatori piastrinici (CRP-XL, ADP, trombina, emina).

  1. L'emino deve essere preparato fresco. Sciogliere la polvere in 1,4 M di NaOH in una soluzione 3 M e riscaldarla a 96 °C per 5 minuti a 450 giri/min. Quindi, diluirlo con H2O distillato in una soluzione madre da 3 mM.
  2. Dopo la regolazione della conta piastrinica (per campione: 1 x 106 piastrine), attivare le piastrine in una provetta con gli attivatori piastrinici per 30 minuti a RT come indicato nella Tabella 4.
  3. Aggiungere 43,3 μL di cocktail di anticorpi ai campioni e incubare le piastrine per 30 minuti a RT al buio.
  4. Dopo l'incubazione, diluire i campioni con 300 μl di 1x tampone legante l'annessina (10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2) in modo che la proteina Annexin V possa legarsi alla fosfatidilserina sul lato esterno della membrana cellulare. Misurare immediatamente i campioni.
    NOTA: Misurare i campioni subito dopo la preparazione. Poiché i campioni non sono fissati, ritardare la preparazione e la misurazione dei campioni può aumentare la variabilità dei risultati. La fissazione compromette il legame dell'Annexina V.

4. Configurazione della compensazione e misurazione della fluorescenza meno un controllo (FMO)

NOTA: Prima di registrare i dati, eseguire una configurazione di compensazione. Un citometro a flusso calcola automaticamente le impostazioni di compensazione; Fare riferimento ai manuali abituali del citometro a flusso per la particolare procedura di compensazione. Tuttavia, utilizzare i controlli di compensazione con celle o con perline.

  1. Configurazione della compensazione
    1. Per la compensazione con le microsfere, preparare 150 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ciascun fluoroforo con una goccia di perle e 1 μl di anticorpo coniugato a fluorescenza.
    2. Monitorare la reattività delle perle da parte della specie. Utilizzare IgGκ anti-topo e il controllo negativo delle microparticelle di polistirene. Per compensare l'annessina V, etichettare le perle PE/Cy7 con l'anticorpo PE/Cy7 anti-umano CD62L che coniuga lo stesso fluoroforo dell'annessina V.
    3. Utilizzare perle di compensazione reattive all'ammina per il colorante reattivo all'ammina. Utilizzare due gocce di perline positive e una goccia di negativo in 150 μl di PBS con 1 μl di colorante. Verificare che le perle di compensazione ammino-reattive reagiscano con il colorante e mostrino un segnale positivo. Verificare che le perle negative non reagiscano con il colorante reattivo all'ammina e presentino un segnale negativo.
      NOTA: Per Zombie NIR APC-Cy7, utilizzare perline reattive all'ammina negativa e positiva.
    4. Incubare i campioni di compensazione per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
    5. Far scorrere ogni tubo di compensazione separatamente e applicare il gate sulla popolazione di perline singoletto in base a FSC e SSC. La popolazione di perline appare come una piccola popolazione concentrata. Disegna un cancello intorno a questa popolazione.
    6. Visualizzare gli istogrammi per ogni provetta di compensazione e regolare i valori di compensazione fino a quando i picchi positivi dei diversi anticorpi e coloranti non si sovrappongono. Quindi, misurare ogni singolo tubo di compensazione e lasciare che la fuoriuscita dei fluorofori sia calcolata secondo la SOP del produttore.
    7. Procedere con l'acquisizione dell'esperimento di colorazione vero e proprio con le piastrine umane isolate (vedere il passaggio 3 e la Tabella 4). Regolare la tensione SSC/FSC prima della misurazione per trovare la popolazione piastrinica. Poiché CD61 è espresso in modo ubiquitario sulle piastrine, verificare con questa soglia di fluorescenza se è possibile rilevare tutte le dimensioni della piastrina.
    8. Quindi, misura 20.000 eventi per campione.
  2. Misurazione FMO
    1. Preparare per ogni marcatore un controllo FMO come da Tabella 5. Per poter determinare le sovrapposizioni di tutti i marcatori, preparare sia campioni non stimolati che stimolati.

5. Analisi dei dati

  1. Analisi con un software di analisi dei dati per citometria a flusso (Figura 4)
    1. Trascina e rilascia i file FSC nel software. Definisci con il controllo FMO la popolazione positiva per ogni marcatore.
      1. Determinare gli FMO tracciando ogni controllo FMO rispetto a ciascun marcatore in un grafico a punti. In questo modo è visibile la fuoriuscita in altri canali. Utilizzare il gate FMO con il più alto spillover di fluorescenza come limite alla popolazione positiva per i campioni trattati a 10 colori.
  2. Analisi con un'analisi di citometria a flusso basata su cloud (Figura 5)
    1. Apri il software e crea un nuovo set di dati. Trascina e rilascia i file FCS acquisiti con il citometro a flusso.
    2. Avviare l'analisi creando un flusso di lavoro. La matrice di compensazione viene creata automaticamente dai file di dati grezzi.
    3. Eseguire un'analisi UMAP con le seguenti impostazioni: Vicini: 15, Distanza minima: 0,4; Componenti: 2; Metrica: Euclidea; Tasso di apprendimento: 1; Epoche: 200; Inizializzazione dell'incorporamento: spettrale. Seleziona tutti i file e tutti i 10 marcatori (funzionalità).
    4. Aggiungere l'analisi Phenopraph come nuova attività ed eseguire l'analisi con le seguenti impostazioni: K Vicini più prossimi: 20; Metrica della distanza: euclidea; Lovanio Punti: 1; Numero di risultati: 1.
    5. Aggiungere un'attività di controllo per indicare i cluster generati. Dopo aver eseguito l'analisi, è possibile presentare i dati in diversi blots, che possono essere esportati.

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Risultati

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Sono disponibili due opzioni per l'analisi dei dati grezzi raccolti da un pannello di citometria a flusso multicolore. Un'opzione è quella di analizzarlo manualmente con il software di analisi (Figura 3 e Figura 4). Pertanto, i dati grezzi devono essere trascinati e rilasciati nella finestra del software. Innanzitutto, le celle devono essere trovate regolando la scala SSC/FSC nella modalità di visualizzazione del grafico a dispersione per mostrare la popolazione...

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Discussione

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La citometria a flusso multicolore consente di definire cluster/sottopopolazioni piastriniche distinti associati a funzioni discrete 12,17,18. Decisiva per i risultati delle sottopopolazioni e per l'espressione della superficie recettoriale è la qualità delle piastrine umane isolate. Pertanto, un passaggio chiave nel protocollo presentato è la preparazione delle piastrine. Devono essere isolati ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il progetto è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) - Progetto numero 335549539 - GRK 2381.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x buffer di rilegatura   Invitrogen,
Carlsbad, California, USA		88-8103-74Tampone 
Adenosina difosfato (ADP)Probe & go Labordiagnostica GmbH
Lemgo, Germania   		70212agonista piastrinico 
Annessina V PE-Cianina7Invitrogen,
Carlsbad, California, USA		88-8103-74colorante 
anti-CD41 AF 700BioLegend,
San Diego, CA, USA		303728anticorpo 
anti-CD41 Alexa Fluor 700BioLegend,
San Diego, CA, USA		303727anticorpo 
anti-CD42b PerCP/Cyanine5.5 BioLegend,
San Diego, CA, USA		303918anticorpo 
anti-CD61 BV605BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, USA 		744382anticorpo 
anti-CD62P PEBeckman Coulter,
Brea, California, USA		IM1759Uanticorpo 
anti-CD63 PE/Cy5 Abcam,
Cambrigde, Regno Unito		ab 234251anticorpo 
anti-CXCR4 BV650BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, USA		740599anticorpo 
anti-CXCR7 BV421 BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, Stati Uniti 		566234anticorpo 
anti-PAC-1 FITCBD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, USA		340507anticorpo 
Albumina sierica bovina (BSA)Applichem,
Darmstadt, Germania		A1391-Acido
citrito Carl Roth,
Karlsruhe, Germania		6490.1-CRP-XL
CambCol Laboratories,
Ely, Regno Unito		Agonista piastrinicoCRP-XL
D-(+)-glucosioSigma Aldrich Co.,
St. Louis, Missouri, USA		G7528-Dubecco
' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma Aldrich Co,
St. Louis, Missouri, USA		D8537-Hemin
 Sigma Aldrich Co.,
St. Louis, Missouri, USA		H9039-10Gagonista piastrinico.
HEPESCarl Roth,
Karlsruhe, Germania		9105.3-Cloruro
potassio Carl Roth,
Karlsruhe, Germania		6781.3-Cloruro
di sodio Carl Roth,
Karlsruhe, Germania		3957.1-Idrogenocarbonato
sodio   Sigma Aldrich Co,
St. Louis, Missouri, USA
401676-Trombina Roche 10602400001agonista piastrinico 
tri-sodio citrato-diidrat Applichem,
Darmstadt, Germania
1416551211-Zombie NIRBioLegend,
San Diego, CA, USA		423105colorante reattivo all'ammina 
  di di

Riferimenti

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