Articolo metodologico

Analisi delle sottopopolazioni piastriniche mediante citometria a flusso multicolore

DOI:

10.3791/67878

⸱

10 giugno 2025

 ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology, University Hospital Tübingen, University of Tübingen

In questo articolo

Sommario

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La citometria a flusso multicolore per le piastrine può identificare nuovi sottotipi piastrinici all'interno delle sottopopolazioni piastriniche classiche, come le piastrine a riposo, aggregatorie, procoagulanti e apoptotiche. Ciò consente il confronto di diversi modelli di sottopopolazione indotti da vari agonisti piastrinici. Qui, viene descritta in dettaglio una procedura per stabilire un pannello di citometria a flusso multicolore.

Abstract

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Le piastrine, o trombociti, sono piccole cellule del sangue anucleate che svolgono un ruolo cruciale nell'emostasi e nella trombosi. Difetti nelle funzioni piastriniche possono causare sanguinamento o eventi trombotici in pazienti con malattie cardiovascolari. Pertanto, è importante caratterizzare fenotipicamente le piastrine per essere in grado di assegnare le sottopopolazioni piastriniche alla funzione piastrinica. La stimolazione delle piastrine umane con agonisti e attivatori piastrinici induce cambiamenti morfologici e fisiologici nelle piastrine, accompagnati da cambiamenti nella popolazione dei recettori di superficie. Ciò porta a sottopopolazioni piastriniche funzionalmente diversificate. Le sottopopolazioni piastriniche classicamente definite sono le piastrine a riposo, aggregatorie, procoagulanti e apoptotiche. Per caratterizzare l'effetto degli agonisti sui sottotipi piastrinici, abbiamo stabilito un test utilizzando la citometria a flusso multicolore costituito da 10 diversi anticorpi e coloranti (anti-CD62P, anti-CD63, anti-CD61, anti-CD41, anti-CD42b, anti-IntegrinaαIIbβ3 (clone: PAC-1), anti-CXCR4, anti-ACKR3, Annexin V, Zombie NIR). Le piastrine umane isolate sono state incubate con agonisti piastrinici e colorate con anticorpi e coloranti specifici coniugati con fluorofori. Successivamente, sono stati misurati mediante citometria a flusso. Questo ci permette di definire sottotipi specifici dell'agonista all'interno delle classiche quattro sottopopolazioni. In conclusione, la combinazione di marcatori di attivazione (anti-CD62P, anti-CD63, anti-IntegrinaαIIbβ3 (clone: PAC-1)), marcatori infiammatori (anti-CXCR4, anti-ACKR3) e marcatori apoptotici (Annexin V, Zombie NIR) che compongono il pannello di citometria a flusso a 10 colori descritto in questo manoscritto apre la possibilità di definire ulteriori sottotipi piastrinici che potrebbero essere collegati a una specifica funzione piastrinica. Questo metodo può essere applicato nella ricerca di base sulla funzione piastrinica e sulla fisiologia, nonché nella definizione di nuovi sottotipi piastrinici in modelli di malattia e studi sui pazienti.

Introduzione

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I trombociti, chiamati anche piastrine, sono piccole cellule del sangue prive di nucleo, essenziali per l'emostasi e lo sviluppo della trombosi 1,2. Possono essere attivati da vari agonisti piastrinici. I classici agonisti fisiologici delle piastrine sono l'adenosina difosfato (ADP), che si lega ai recettori P2Y12 e P2Y1, la trombina che attiva le piastrine attraverso i recettori PAR1 e PAR4 e il collagene che interagisce con la glicoproteina VI. Il collagene può essere sostituito in esperimenti in vitro dal peptide correlato al collagene (CRP-XL)

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Protocollo

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La raccolta e la manipolazione del sangue a scopo di ricerca sono state approvate dal Comitato etico della Facoltà di Medicina dell'Università Eberhard Karls e dell'Ospedale universitario di Tubinga (voto etico 238/2018B02) e le metodologie di studio sono state conformi agli standard stabiliti dalla Dichiarazione di Helsinki. I donatori sani hanno dato il consenso informato scritto per la raccolta del sangue. Le caratteristiche di base per i donatori sani sono elencate nella Tabella 1. La Figura 1 fornisce una panoramica del protocollo di citometria a flusso.

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Risultati

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Sono disponibili due opzioni per l'analisi dei dati grezzi raccolti da un pannello di citometria a flusso multicolore. Un'opzione è quella di analizzarlo manualmente con il software di analisi (Figura 3 e Figura 4). Pertanto, i dati grezzi devono essere trascinati e rilasciati nella finestra del software. Innanzitutto, le celle devono essere trovate regolando la scala SSC/FSC nella modalità di visualizzazione del grafico a dispersione per mostrare la popolazione.......

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Discussione

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La citometria a flusso multicolore consente di definire cluster/sottopopolazioni piastriniche distinti associati a funzioni discrete 12,17,18. Decisiva per i risultati delle sottopopolazioni e per l'espressione della superficie recettoriale è la qualità delle piastrine umane isolate. Pertanto, un passaggio chiave nel protocollo presentato è la preparazione delle piastrine. Devono essere isolati .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il progetto è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) - Progetto numero 335549539 - GRK 2381.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x buffer di rilegatura   Invitrogen,
Carlsbad, California, USA		88-8103-74Tampone 
Adenosina difosfato (ADP)Probe & go Labordiagnostica GmbH
Lemgo, Germania   		70212agonista piastrinico 
Annessina V PE-Cianina7Invitrogen,
Carlsbad, California, USA		88-8103-74colorante 
anti-CD41 AF 700BioLegend,
San Diego, CA, USA		303728anticorpo 
anti-CD41 Alexa Fluor 700BioLegend,
San Diego, CA, USA		303727anticorpo 
anti-CD42b PerCP/Cyanine5.5 BioLegend,
San Diego, CA, USA		303918anticorpo 
anti-CD61 BV605BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, USA 		744382anticorpo 
anti-CD62P PEBeckman Coulter,
Brea, California, USA		IM1759Uanticorpo 
anti-CD63 PE/Cy5 Abcam,
Cambrigde, Regno Unito		ab 234251anticorpo 
anti-CXCR4 BV650BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, USA		740599anticorpo 
anti-CXCR7 BV421 BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, Stati Uniti 		566234anticorpo 
anti-PAC-1 FITCBD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, USA		340507anticorpo 
Albumina sierica bovina (BSA)Applichem,
Darmstadt, Germania		A1391-Acido
citrito Carl Roth,
Karlsruhe, Germania		6490.1-CRP-XL
CambCol Laboratories,
Ely, Regno Unito		Agonista piastrinicoCRP-XL
D-(+)-glucosioSigma Aldrich Co.,
St. Louis, Missouri, USA		G7528-Dubecco
' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Sigma Aldrich Co,
St. Louis, Missouri, USA		D8537-Hemin
 Sigma Aldrich Co.,
St. Louis, Missouri, USA		H9039-10Gagonista piastrinico.
HEPESCarl Roth,
Karlsruhe, Germania		9105.3-Cloruro
potassio Carl Roth,
Karlsruhe, Germania		6781.3-Cloruro
di sodio Carl Roth,
Karlsruhe, Germania		3957.1-Idrogenocarbonato
sodio   Sigma Aldrich Co,
St. Louis, Missouri, USA
401676-Trombina Roche 10602400001agonista piastrinico 
tri-sodio citrato-diidrat Applichem,
Darmstadt, Germania
1416551211-Zombie NIRBioLegend,
San Diego, CA, USA		423105colorante reattivo all'ammina 
  di di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freedman, J. E. Molecular regulation of platelet-dependent thrombosis. Circulation. 112 (17), 2725-2734 (2005).
  2. Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. Thrombosis and platelets: an update. Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2016).
  3. van der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. ....

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Attivazione piastrinicaagonisti piastrinicifunzione piastrinicamarcatori di superficie piastriniciisolamento piastrinicopiastrine apoptoticheaggregazione piastrinicaanalisi UMAP

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