FISH sensibile al polimorfismo a singolo nucleotide Rilevamento della trascrizione dell'RNA ribosomiale specifico del locus in Drosophila melanogaster

Summary

Il protocollo descrive il metodo di ibridazione in situ a fluorescenza sensibile ai polimorfismi a singolo nucleotide (SNP-FISH) per distinguere i trascritti di RNA ribosomiale derivati dal locus del DNA ribosomiale del cromosoma X o Y in Drosophila melanogaster.

Abstract

Al fine di garantire che una quantità sufficiente di RNA ribosomiale (rRNA) venga trascritta per la funzione dei ribosomi, i genomi contengono centinaia di duplicazioni tandem delle sequenze che codificano gli rRNA, componendo regioni chiamate loci del DNA ribosomiale (rDNA). I genomi di molti organismi contengono più di un locus di rDNA distribuito su diversi cromosomi e l'rRNA può essere trascritto da più loci di rDNA o da un solo locus. I cambiamenti nelle fonti di trascrizione dell'rRNA spesso indicano sofferenza ribosomiale. Tuttavia, l'omogeneità dell'rRNA impedisce di distinguere se l'rRNA è trascritto da più o da un singolo locus di rDNA. Qui, descriviamo un metodo che utilizza l'ibridazione in situ fluorescente sensibile al polimorfismo a singolo nucleotide (SNP-FISH) per distinguere la trascrizione dell'rRNA tra i loci di rDNA di Drosophila melanogaster sui cromosomi X e Y. Questo metodo sfrutta le varianti di rRNA locus-specifiche per consentire un facile rilevamento della fonte di trascrizione dell'rRNA con risoluzione a singola cellula. Questo test può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula di Drosophila e può essere adattato per l'uso in altri sistemi.

Introduction

Gli RNA ribosomiali (rRNA) 18S, 5.8S e 28S necessari per la funzione dei ribosomi sono co-trascritti in un singolo cistrone chiamato pre-rRNA 45S. I tre rRNA sono separati all'interno del pre-rRNA 45S da due sequenze spaziatrici trascritte interne (ITS) e fiancheggiati da sequenze spaziatrici trascritte esterne (ETS) alle estremità 5' e 3'. Tutte queste sequenze spaziatrici vengono rimosse dal pre-rRNA 45S per incorporare gli rRNA maturi nei ribosomi (vedi¹). Al fine di soddisfare l'elevata domanda di produzione di rRNA necessaria per supportare l'attività dei ribosomi, tutti i genomi eucariotici contengono centinaia di copie della sequenza 45S. Queste copie sono raggruppate insieme in ripetizioni tandem, formando regioni genomiche chiamate loci del DNA ribosomiale (rDNA). La maggior parte dei genomi eucariotici contiene più loci di rDNA distribuiti su cromosomi separati (vedi²). L'elevata ridondanza delle copie 45S significa che in genere ci sono molte più copie 45S del necessario per la trascrizione e la maggior parte delle copie 45S sono trascrizionalmente silenziose e sepolte nell'eterocromatina³. L'attività trascrizionale non è uniforme tra i loci dell'rDNA e la variazione nella trascrizione del locus dell'rDNA è ampiamente osservata tra gli organismi ^4,5,6, indicando che la trascrizione di 45S è regolata in modo differenziale nei singoli loci dell'rDNA. Il silenziamento dell'rDNA a livello di locus è stato osservato in piante, invertebrati e vertebrati 7,8,9,10, suggerendo che il silenziamento dell'rDNA a livello di locus è un meccanismo importante per regolare il dosaggio dell'rRNA ¹¹. La trascrizione dell'rRNA è un passaggio regolatore chiave nella produzione di ribosomi e le modifiche alla trascrizione dell'rRNA che modulano l'attività traduzionale sono una caratteristica importante sia del normale differenziamento che delle condizioni di malattia¹². I cambiamenti nella trascrizione del locus dell'rDNA sono anche associati a riduzioni del numero totale di copie^{dell'rDNA 13}. Pertanto, l'alterata trascrizione dell'rDNA locus-specifico può essere un indicatore importante di una fisiologia cellulare interrotta.

Mentre il silenziamento locus-specifico sembra essere una delle principali fonti di regolazione trascrizionale dell'rRNA, i meccanismi che stabiliscono questo silenziamento e dirigono quali loci di rDNA sono trascrizionalmente attivi sono in gran parte sconosciuti. L'omogeneità delle sequenze di rDNA rende difficile valutare la trascrizione individuale del locus dell'rDNA, impedendo un'analisi diffusa dell'attività trascrizionale dell'rDNA locus-specifica. Questa sfida può essere superata sfruttando la variazione strutturale e della sequenza a singolo nucleotide tra le copie di rDNA all'interno dello stesso genoma 4,5,6,13. Alcune di queste varianti possono essere condivise tra la maggior parte o tutte le copie in un singolo locus, creando aplotipi unici di locus rDNA di più varianti che distinguono un locus rDNA. Infatti, la recente mappatura delle varianti di rDNA in loci specifici da parte del consorzio telomero-telomero ha rivelato varianti di rDNA condivise locus-specifiche nel genoma umano¹⁴. Tali mappe del locus rDNA possono consentire l'identificazione della trascrizione locus-specifica da set di dati di sequenziamento; Tuttavia, la disponibilità di queste mappe rimane attualmente limitata e non sono facili da produrre. Poiché i loci dell'rDNA risiedono solo sui cromosomi sessuali in Drosophila melanogaster (un locus su ciascun cromosoma X e Y)¹⁵, il locus dell'rDNA del cromosoma Y è assente nelle femmine XX. Questo isolamento naturale dal locus del cromosoma Y significa che le varianti di polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) tra i loci dell'rDNA X e Y possono essere facilmente identificate nel sequenziamento a lettura breve come qualsiasi variante presente nei maschi (XY) ma assente nelle femmine (XX). Gli SNP precedentemente identificati possono essere rapidamente testati in ceppi di Drosophila non genotipizzati attraverso la semplice PCR e il sequenziamento Sanger del DNA di maschi e femmine. Inoltre, la disponibilità di ceppi di Drosophila con un cromosoma X che non ha il locus¹⁶ dell'rDNA significa che i singoli loci dell'rDNA X e Y possono essere isolati individualmente per una caratterizzazione ancora più precisa dell'SNP dell'rDNA. Questa facile identificazione delle varianti SNP tra i loci di rDNA di Drosophila rende possibile determinare i loci di rDNA X e Y unici aplotipi^{SNP 13}. Anche i loci dell'rDNA del cromosoma X sono tipicamente completamente silenti nei maschi di Drosophila, ma entrambi i loci del cromosoma X sono trascritti nelle femmine^10,17, rendendo Drosophila un sistema utile per studiare il silenziamento dell'rDNA a livello di locus.

L'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) è un potente strumento per visualizzare la presenza di specifiche sequenze di RNA o DNA all'interno delle singole cellule di un tessuto. Le marcature FISH mirano a sequenze di RNA o DNA attraverso sonde oligonucleotidiche antisenso coniugate a fluorofori. Le sonde FISH devono in genere essere lunghe ~20 nucleotidi per fornire un legame del bersaglio sufficientemente stabile da essere visualizzate, ma le sonde così lunghe possono anche legarsi facilmente a sequenze non bersaglio che differiscono solo per un singolo nucleotide (Figura 1A). Al contrario, le sonde abbastanza corte da conferire specificità a singolo nucleotide non si legano abbastanza stabilmente per la visualizzazione. Per bilanciare specificità e stabilità, la FISH SNP-FISH (SNP-FISH) combina una sonda fluorescente antisenso lunga ~26 nucleotidi con un oligonucleotide maschera di senso non fluorescente che si lega a tutti tranne l'estremità 5' della sonda¹⁸. Questa maschera lascia solo i 10 nucleotidi più 5' della sonda a filamento singolo e disponibili per il legame con il bersaglio (Figura 1B). Questa breve porzione a filamento singolo della sonda conferisce specificità al bersaglio ma previene la cross-reattività con RNA che hanno anche un singolo disadattamento con questi 10 nucleotidi (Figura 1B). Una volta che l'estremità 5' della sonda lega il suo bersaglio, lo spostamento passivo del filamento rimuove la maschera dalla sonda, consentendo alla regione 3' di legare il bersaglio e creando un'etichettatura stabile del bersaglio (Figura 1B)¹⁸. Pertanto, SNP-FISH può visualizzare in modo differenziale gli RNA che differiscono per un singolo SNP utilizzando una coppia di sonde che hanno fluorofori diversi che completano ciascuno un SNP diverso ma condividono una maschera comune (Figura 1C). Sebbene questo metodo recluti solo una singola sonda coniugata con fluorofori per lo SNP bersaglio, è possibile utilizzare il raggruppamento di più set di sonda-maschera a diversi SNP all'interno di un aplotipo di rDNA condiviso per amplificare la rilevazione sensibile agli SNP di un singolo rRNA (Figura 1D). Inoltre, poiché l'rRNA è così abbondantemente trascritto, i trascritti di rRNA possono essere facilmente visualizzati negli esperimenti FISH utilizzando un piccolo numero di etichette fluorescenti per RNA. Questo basso fabbisogno di fluoroforo per RNA significa che SNP-FISH può visualizzare gli rRNA da un locus specifico con solo pochi SNP unici. Questo metodo è in grado di rilevare facilmente la trascrizione di rRNA locus-specifica in una varietà di tessuti di Drosophila e negli stadi di sviluppo¹⁷. È particolarmente efficace nelle cellule staminali germinali maschili di Drosophila, che cambiano tra la trascrizione esclusiva dell'RDNA Y e la co-espressione dei loci dell'RDNA dei cromosomi X e Y durante l'invecchiamento¹³. Qui, forniamo un protocollo SNP-FISH per visualizzare distinti trascritti di rRNA X e Y nel testicolo di Drosophila per raggiungere l'obiettivo generale di valutare il silenziamento dell'rRNA locus-specifico. Questo metodo utilizza quattro SNP precedentemente caratterizzati tra i loci di rDNA sui cromosomi X e Y del ceppo comune di Drosophila da laboratorio y¹w¹ (Figura 1D).

Protocol

1. Preparazione di tamponi e reagenti

NOTA: La tecnica senza RNasi deve essere utilizzata durante le fasi 1, 3 e 4 e devono essere utilizzati reagenti certificati privi di RNasi.

1. In una cappa chimica, preparare 40 mL di formaldeide al 4% in 1 soluzione di fissazione PBS aggiungendo 10 mL di formaldeide al 16% e 4 mL di PBS 10x RNasi a 26 mL di acqua priva di RNasi. Distribuire in aliquote da 1 mL e conservare a -20 °C entro 30 minuti dalla preparazione. La soluzione di fissaggio può essere conservata a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
   ATTENZIONE: La soluzione contiene formaldeide. Maneggiare con guanti e DPI adeguati e smaltirlo in sicurezza.
2. Preparare 10 mL di tampone di ibridazione mescolando 1 mL di 20x Citrato salino-sodio (SSC) privo di RNasi, 1 g di destrano solfato, 100 μL di 100 mg/mL di tRNA Saccharomyces cerevisiae , 100 μL di 200 mM di complesso vanadilribonucleosidico, 1 mL di BSA privo di RNasi al 5%, 1 mL di formammide deionizzata combinata con 6 mL di acqua priva di RNasi. Distribuire in aliquote da 1 mL in provette per microfughe da 1,5 mL e conservare a -20 °C per un massimo di 1 mese.
3. Preparare 50 mL di tampone di lavaggio aggiungendo 5 mL di 20x SSC senza RNasi, 5 mL di formammide deionizzata, 50 μL di Triton-X a 40 mL di acqua priva di RNasi. Conservare a temperatura ambiente al buio per un massimo di 1 mese.
4. Preparare 10 mL di tampone di isolamento del DNA aggiungendo 100 μL di Tris-HCl 1M pH 7,5-8,0, 20 μL di EDTA 0,5M e 50 μL di NaCl 5M a 9,8 mL di acqua.

2. Genotipizzazione di campioni per SNP di rRNA X- e Y-specifici

1. Raccogliere la femmina e il maschio X omozigoti non accoppiati che ospitano lo stesso cromosoma X in provette da 0,2 ml e raffreddarli con ghiaccio.
2. Combinare 50 μL di tampone di isolamento del DNA con 0,5 μL di 20 mg/mL di proteinasi K per campione.
3. Aggiungere 50 μl di tampone di isolamento del DNA/proteinasi K al campione di Drosophila e omogeneizzare il campione utilizzando un puntale per pipetta.
4. Incubare i campioni a 37°C per 30 minuti, seguiti da 95°C per 2 minuti. Trasferire 40 mL di campione (evitare detriti animali) in una provetta pulita da 1,5 mL.
5. Amplificare separatamente ciascuna regione target SNP da ciascun campione di DNA mediante PCR utilizzando una concentrazione di 10 μM delle seguenti coppie di primer: 18S SNP Forward + Reverse; ITS1 SNP avanti + indietro; 28S SNP avanti + indietro. La sequenza del primer e la dimensione prevista dell'amplicone della PCR si trovano nella Tabella 1.
6. Utilizzare l'elettroforesi su gel per separare l'intero campione di PCR su un gel 1x TAE di agarosio all'1% per confermare il prodotto PCR previsto. Le dimensioni previste del prodotto sono elencate nella Tabella 1.
7. Isolare il prodotto PCR dal gel utilizzando qualsiasi kit di estrazione del gel disponibile in commercio.
8. Sequenziare i prodotti della PCR mediante sequenziamento Sanger. Sequenziare i campioni in entrambe le direzioni utilizzando reazioni individuali separate per il primer F e R per ciascun bersaglio.
9. Determinare la variante SNP del cromosoma X nelle posizioni della Tabella 2 in un campione di DNA femminile non accoppiato. L'aplotipo X atteso è descritto nella Tabella 2.
10. Osservare le posizioni degli SNP nel cromatogramma di sequenziamento del campione di DNA maschile. Dedurre la variante SNP del cromosoma Y in base alla variante SNP X già determinata in ciascuna posizione SNP. L'aplotipo Y atteso è descritto nella Tabella 2.

Nome del primer	Sequenza	Dimensione prevista dell'amplicone
18S SNP F	GACTACCATGGTTGCAACGG	652 barili
18S SNP R	TTCACCTCTCGCGTCGTAAT
ITS1 SNP F	CTTGCGTGTTACGGTTGTTTC	955 barili
ITS1 SNP R	ACAGCATGGACTGCGATATG
28S SNP F	ATGCGTAGAAGTGTTTGGCG	598 barili
28S SNP R	GCCGACTTCCCTTACCTACA

Tabella 1: Sequenze di primer per il sequenziamento di SNP di rDNA. Coppie di primer per amplificare le regioni di rDNA che contengono SNP precedentemente caratterizzati nelle regioni di rDNA 18S, ITS1 e 28S. Sono elencati la sequenza dell'oligonucleotide primer e la dimensione prevista dell'amplicone della PCR.

Aplotipo	Posizione SNP	Sequenza
RDNA X	18S	1603-ATACTTGTATTTTTTCATATG-1625
	ITS1-1	2873-CGTTAATAAATATTTGTAATT-2895
	ITS1-2	3115-GAAAATCGAAGAAACAAAATT-3137
	28S	5932-AACAAAAATGCCTAACTATAT-5954
Y rDNA	18S	1603-ATACTTGTATCTTTTCATG-1624
	ITS1-1	2873-CGTTAATAAACATTTGTAATT-2895
	ITS1-2	3115-GAAAATCGAAAAAACAAAATT-3137
	28S	5932-AACAAAAATGGCTAACTATAT-5954

Tabella 2: Aplotipi di rDNA attesi. SNP attesi nei loci di rDNA dei cromosomi X e Y nel ceppo y¹w¹ Drosophila. SNP indicato in grassetto e sottolineato. Posizione elencata in base alla sequenza di consenso 45S rRNA (file supplementare 1).

3. Dissezione, fissazione e permeabilizzazione del testicolo

1. Pulire lo stereomicroscopio, la postazione di lavoro, il piatto di dissezione e le pinze da dissezione con etanolo al 70% (o un altro trattamento con RNasi).
2. Sotto uno stereomicroscopio, sezionare la Drosophila per isolare i testicoli in 1x PBS privo di RNAsi. Afferra il centro dell'addome dell'animale con un paio di pinze e afferra l'estremità dell'addome con un altro paio di pinze per separare delicatamente l'animale. I testicoli si dissociano dall'animale e possono essere ulteriormente separati usando il forcipe. Raccogli 30 - 40 testicoli per campione.
3. Utilizzando una pinza, prelevare i testicoli e trasferirli dal piatto di dissezione a una provetta microfuge da 1,5 ml contenente 0,5 ml di PBS 1x privo di RNasi.
4. Aspirare il PBS e aggiungere 1 ml di soluzione di fissaggio. Incubare a temperatura ambiente su uno shaker nutante per 30 min. Aspirare il fissativo.
5. Lavare 2 volte con 1 mL di 1x PBS senza RNasi per 5 minuti ciascuno su uno shaker nutante. Aspirare 1x PBS e aggiungere 1 mL di etanolo al 70% (EtOH) privo di RNasi. Incubare a 4 °C per una notte su un agitatore nutente.

4. RNA ribosomiale SNP-sensibile FISH

1. Aspirare l'etanolo e aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio. Incubare a temperatura ambiente per 3 minuti su uno shaker nutante, seguiti da 2 minuti di provetta in posizione verticale.
2. Mescolare sonde e maschere con tampone di ibridazione, ottenendo 100 μl di volume totale per campione. La sonda, le sequenze della maschera e le etichette dei fluorofori sono elencate nella Tabella 3. Quando si utilizzano tutti e 4 gli SNP, preparare 80 μL di tampone di ibridazione, 1 μL di sonda Y-SNP da 10 μM (4 μL in totale), 1 μL di sonda X-SNP da 10 μM (4 μL in totale) e 3 μL di maschera comune da 10 μM (12 μL in totale)
3. Aspirare il tampone di lavaggio, quindi aggiungere 100 μL di soluzione di ibridazione. Applicare una pellicola trasparente sui bordi della provetta, avvolgerla in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e incubare a bagnomaria a 37 °C per almeno 24 ore.
4. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio al campione senza aspirare la soluzione di ibridazione. Incubare a bagnomaria a 37 °C per 30 minuti al buio.
5. Aspirare il tampone di lavaggio, quindi aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio al campione. Incubare a bagnomaria a 37 °C per 30 minuti al buio.
6. Aspirare il tampone di lavaggio e aggiungere 50 μl di terreno di montaggio. I campioni possono essere immediatamente montati su vetrini o conservati per un massimo di 1 settimana a 4 °C prima del montaggio.

Posizione SNP	Oligonucleotide	Sequenza		Fluoroforo coniugato 3'
18S	Sonda X SNP	AAAAAATACAAGTATTTAATCACATA		Alexa 488
	Sonda SNP a Y	AAAAGATACAAGTATTTAATCACATA		Alexa 647
	Maschera	TATGTGATTAAATACT
ITS1-1	Sonda X SNP	AAATATTTATTATTAACGGTAAGGATATT		Alexa 488
	Sonda SNP a Y	AAATGTTTATTAACGGTAAGGATATT		Alexa 647
	Maschera	AATATCCTTACCGTTA
ITS1-2	Sonda X SNP	GTTTCTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Alexa 488
	Sonda SNP a Y	GTTTTTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Alexa 647
	Maschera	GTTTCGAACATGAAAA
28S	Sonda X SNP	TTAGGCATTTTTGTTTTACTTGAAAA		Alexa 488
	Sonda SNP a Y	TTAGCCATTTTTGTTTTACTTGAAAA		Alexa 647
	Maschera	TTTTCAAGTAAAAAA

Tabella 3: Sequenze di sonde e maschere per rDNA snp-fish. Le posizioni dell'SNP sono evidenziate in grassetto. Viene sottolineata la porzione della sonda che si lega all'oligonucleotide maschera. Sono elencati esempi di fluorofori coniugati 3' adatti, ma è possibile utilizzare qualsiasi fluoroforo compatibile.

5. Preparazione dei campioni per l'imaging

1. Lavorando sotto uno stereomicroscopio da dissezione, utilizzare una pipetta a orifizio largo per trasferire il campione su un vetrino da microscopio.
2. Utilizzando una pinza, è possibile disporre i testicoli in linea per facilitare la ricerca dei campioni durante l'imaging (non è richiesto alcun orientamento specifico). Coprire il campione con un vetrino coprioggetti. Tamponare i bordi del vetrino coprioggetto con un panno per rimuovere il supporto di montaggio in eccesso.
3. Sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie. Lasciare scivolare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti affinché lo smalto si asciughi. I vetrini possono essere utilizzati immediatamente per l'imaging confocale o possono essere conservati per un massimo di un mese a 4 °C prima dell'imaging^.

Results

Si prevede che i risultati del sequenziamento della genotipizzazione degli SNP rilevino le differenze di SNP tra i loci dell'rDNA X e Y. Questi SNP vengono rilevati valutando direttamente le posizioni degli SNP nei cromatogrammi di sequenziamento (Figura 2). Si prevede che il sequenziamento di campioni femminili abbia un singolo segnale di sequenziamento nella posizione SNP, indicando l'omozigosi SNP tra i due cromosomi X (Figura 2A). Si prevede che i risultati del sequenziamento del campione maschile abbiano un doppio picco nella posizione SNP (Figura 2B). Sulla base del genotipo del cromosoma X determinato dal sequenziamento del campione femminile, si deduce che la variante non-X è un SNP rDNA del cromosoma Y (cioè, X = T, Y = C per il sequenziamento SNP 18S nella Figura 2). In alternativa, un singolo picco di sequenziamento in una posizione SNP nel campione maschile indicherebbe l'omozigosi tra i loci di rDNA maschile e femminile in quella posizione SNP e tale posizione non sarebbe utilizzabile per rRNA SNP-FISH.

Seguendo il protocollo per SNP FISH, i campioni possono essere visualizzati mediante montaggio su vetrini e posti sotto un vetrino di copertura sigillato, seguito dalla microscopia confocale. Utilizzando le sonde elencate nella Tabella 3, il segnale dell'rRNA derivato dall'Y viene rilevato dall'emissione di Alexa Fluor 647 e il segnale dell'rRNA derivato dall'X viene rilevato dall'emissione di Alexa Fluor 488. Ci si aspetta che i segnali dell'rRNA siano osservati nel nucleolo, che può essere identificato come il buco povero di DPI nel nucleo (Figura 3A). Il nucleolo è particolarmente facile da identificare nelle cellule germinali a causa del loro nucleo e nucleolo grandi (Figura 3A). Il segnale debole può essere tipicamente trovato anche nel citoplasma (Figura 3), ma questo è un segnale non specifico che può essere rilevato anche in campioni senza rRNA contenente un SNP complementare (cioè, segnale Y in cellule prive di rDNA Y o segnale X in cellule prive di rDNA X; Figura 3B-C). Inoltre, la co-marcatura artificiale dell'rRNA X e Y può talvolta essere rilevata nel mozzo somatico, anche in campioni privi di loci di rDNA X o Y (Figura 3B-C, frecce gialle). Pertanto, solo i segnali nucleari dovrebbero essere utilizzati per valutare la trascrizione locus-specifica. La maggior parte delle cellule, in particolare le cellule somatiche, dovrebbero avere solo un segnale Y rRNA, indicando che l'rRNA è trascritto esclusivamente dal locus Y rDNA (Figura 3A, cerchio tratteggiato giallo e freccia rossa)^10,17. Tuttavia, la co-espressione dell'rRNA X e Y è spesso rilevata nelle cellule germinali, in particolare nelle cellule staminali germinali¹³ (Figura 3A, cerchi punteggiati bianchi). I segnali dell'rRNA X e Y nelle cellule co-esprimenti possono essere adiacenti e formare un singolo nucleolo (Figura 3A cellula superiore) o possono essere separati, formando due nucleoli (Figura 3A cellula inferiore). Gli esempi nella Figura 3 sono forniti da rDNA SNP-FISH utilizzando set di sonde che hanno come bersaglio solo due SNP (i due SNP ITS1), dimostrando che solo due SNP sono necessari per rDNA SNP-FISH. Tuttavia, si osservano segnali più robusti quando si utilizzano sonde mirate a tutti e quattro gli SNP¹³.

I controlli negativi sono un'inclusione importante per questo test per confermare che le sonde non reagiscono in modo incrociato con il bersaglio SNP sbagliato, soprattutto quando si esegue la risoluzione dei problemi del metodo. I controlli negativi del cromosoma X includono qualsiasi condizione priva di rDNA del cromosoma X, come i maschi che ospitano un cromosoma X con una delezione di rDNA. Ci si aspetta che i controlli negativi del cromosoma X rilevino solo il segnale dell'rRNA Y e nessun rRNA X (Figura 3B). I controlli negativi del cromosoma Y includono qualsiasi condizione priva di rDNA del cromosoma Y. Alcuni esempi di queste condizioni sono i tessuti femminili XX, i tessuti di maschi privi di un cromosoma Y o i maschi che ospitano un cromosoma Y con una delezione di rDNA¹⁵. Ci si aspetta che i controlli negativi del cromosoma Y rilevino solo il segnale dell'rRNA X e non abbiano alcun segnale dell'rRNA Y rilevabile (Figura 3C). Si noti che questi controlli non sono importanti solo per determinare la specificità della sonda, ma anche per determinare eventuali background o artefatti del segnale. Eventuali nuove sonde o condizioni di saggio che forniscano specificità in tali controlli possono essere utilizzate in modo accurato per rilevare la trascrizione di rDNA locus-specifica.

Diverse condizioni genetiche, di sviluppo o ambientali possono alterare la probabilità che l'rDNA sia trascritto esclusivamente dal locus^13,17 dell'rDNA del cromosoma Y. La frequenza di trascrizione dell'rDNA da un singolo locus o da più loci può essere quantificata e confrontata direttamente tra i campioni. Al fine di confrontare quantitativamente le differenze nella trascrizione del locus dell'rDNA, ogni cellula deve essere classificata individualmente come Y-dominante, Co-dominante o X-dominante. Le celle sono classificate come dominanti Y e X solo se viene rilevato solo il rispettivo segnale. Qualsiasi cellula con segnali di rRNA Y e X è considerata co-dominante, anche se un segnale è molto più debole dell'altro. Pertanto, le celle contenenti segnali X e Y molto forti sono qualitativamente considerate uguali alle celle con segnali Y forte e X debole o X forte e Y debole. La percentuale totale di tutte le cellule in tutti i campioni di ciascuna categoria può essere confrontata tra i campioni mediante il test del chi quadrato. Sebbene questo test funzioni bene per determinare qualitativamente se un particolare locus di rDNA è trascritto o meno, non abbiamo osservato valutazioni coerenti tra i campioni quando quantifichiamo direttamente l'intensità di fluorescenza dei singoli segnali SNP-FISH. Pertanto, non si consiglia di effettuare valutazioni quantitative dell'intensità del segnale FISH tra i campioni o dell'intensità relativa dei segnali di rDNA X e Y all'interno di una singola cellula. L'origine di questa incoerenza nell'intensità della fluorescenza non è chiara, anche se potrebbe essere dovuta al legame inefficiente delle sonde mascherate che non si legano a tutti gli rRNA bersaglio.

Figura 1: Schema del metodo SNP-FISH. (A) Le tradizionali sonde oligonucleotidiche antisenso FISH reagiscono in modo incrociato con RNA non bersaglio che differiscono di un solo nucleotide. (B) Il metodo SNP-FISH utilizza oligonucleotidi maschera complementari legati alla regione 3' della sonda oligonucleotidica. La maschera lascia solo 10 nucleotidi liberi di legarsi alla sequenza bersaglio. Una regione della sonda non mascherata non si lega stabilmente a sequenze non bersaglio che differiscono di uno o più nucleotidi. La maschera si dissocia dalla sonda dopo che la sonda si lega al bersaglio, consentendo un legame stabile tra sonda e bersaglio. (C) Sonde SNP accoppiate con marcature diverse combinate con una maschera comune legano specificamente bersagli che differiscono per un singolo nucleotide senza reagire in modo incrociato. (D) Più sonde possono essere raggruppate insieme per etichettare in modo specifico aplotipi di rRNA distinti. Quattro differenze SNP sono state caratterizzate tra i loci di rDNA X e Y nel ceppo y¹w¹ di Drosophila melanogaster . Uno SNP nell'rRNA 18S, uno nell'rRNA 28S e due nella porzione ITS1 del pre-rRNA. Vengono visualizzati gli aplotipi di rRNA X e Y-specifici utilizzati per SNP-FISH. Le sonde che hanno come bersaglio la variante X dell'rDNA nei quattro SNP dell'rRNA sono coniugate a un fluoroforo comune (verde) e le sonde che hanno come bersaglio le varianti dell'rDNA Y sono coniugate a un fluoroforo diverso (magenta). Per ogni SNP viene utilizzata una maschera comune (quattro in totale). Il legame della sonda SNP-specifica in ciascuna posizione SNP sull'rRNA può marcare in modo specifico l'rRNA dai loci di rDNA X e Y con un massimo di quattro sonde oligonucleotidiche FISH. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempi di risultati di sequenziamento di SNP di rDNA omozigoti ed eterozigoti. Esempio di cromatogrammi di sequenziamento da 18S SNP sequenziamento di DNA da (A) campioni femminili e (B) maschili. Posizione SNP 18S indicata da un asterisco (*). Il singolo segnale di timina (T) per la posizione SNP nel campione femmina indica una timina nella posizione SNP nel locus dell'rDNA del cromosoma X. Il doppio segnale in posizione SNP diviso tra timina e citosina (C) nel campione maschile indica una citosina in posizione SNP nel locus rDNA del cromosoma Y (dedotto sapendo che la timina si trova nel locus del cromosoma X). I risultati del sequenziamento sono stati visualizzati utilizzando ApE, un software di editor di plasmidi¹⁹. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Esempi di risultati SNP-FISH nel testicolo di Drosophila utilizzando solo due set di sonde SNP-FISH. Esempi di SNP FISH nel testicolo di animali con (A) rDNA X e Y, (B) solo rDNA Y o (C) solo rDNA X. Questi esempi hanno utilizzato solo set di sonde che marcano i due SNP ITS1 rRNA, dimostrando che rRNA SNP FISH funziona con un minimo di due SNP bersaglio. Le cellule germinali sono identificate dal loro grande nucleo rotondo e le cellule somatiche dal loro nucleo più piccolo e meno rotondo. Le cellule staminali germinali sono identificate dalla loro posizione direttamente accanto al mozzo somatico, contrassegnata da un asterisco (*). Le cellule germinali che trascrivono l'rDNA da entrambi i loci X e Y dell'rDNA sono identificate da entrambi i segnali nucleari X e Y FISH (cerchi punteggiati bianchi, A-A''). Le cellule germinali che trascrivono il DNA solo dal locus Y rDNA hanno solo un segnale FISH nucleare Y (cerchio tratteggiato giallo). Le cellule somatiche che esprimono solo Y sono contrassegnate da una freccia rossa. La co-marcatura artificiale dei loci dell'rDNA X e Y può essere osservata nel mozzo somatico (freccia gialla). La barra della scala è di 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: sequenza di rRNA del locus del cromosoma X. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Qui, descriviamo un metodo per utilizzare SNP-FISH per distinguere i trascritti di rRNA 45S derivati dai loci di rDNA dei cromosomi X e Y nei tessuti di Drosophila melanogaster . Il passaggio più critico di questo protocollo è la genotipizzazione accurata degli SNP 45S da utilizzare come bersagli SNP-FISH. Forniamo primer e protocolli per il genotipo di quattro SNP noti di Drosophila 45S, ma altri metodi di sequenziamento potrebbero rivelare nuovi SNP che potrebbero essere utilizzati in alternativa per il test. Qualsiasi posizione SNP risultata identica tra i loci di rDNA del cromosoma X e Y (cioè, c'è un singolo picco di sequenziamento nei campioni di DNA maschile) non può essere utilizzata per SNP FISH. Alcune posizioni degli SNP possono risultare eterogenee all'interno di un singolo locus di rDNA (cioè, i risultati del sequenziamento non forniscono una singola variante SNP per i campioni XX o solo un secondo picco di sequenziamento molto minore nei campioni XY). Anche gli SNP che sono eterogenei all'interno di un singolo locus di rDNA non sono adatti per questo test poiché una delle varianti sarebbe condivisa tra i due loci di rDNA, rendendo indistinguibile la trascrizione da un singolo locus o da più loci. Inoltre, a causa della riserva di spermatozoi femminili²⁰, il DNA isolato dalle femmine accoppiate può contenere rDNA del cromosoma Y. Pertanto, è fondamentale che le femmine non accoppiate vengano utilizzate per l'analisi del sequenziamento XX. È importante sottolineare che questo metodo richiede almeno due SNP cromosomici specifici per consentire ad almeno due sonde locus-specifiche di legare ciascuna molecola di rRNA per il rilevamento, limitando la sua applicazione ai loci di rDNA con almeno due SNP distintivi tra loro. La disponibilità di più SNP consente a più sonde di legare ciascun rRNA e può fornire una maggiore efficacia del segnale. È interessante notare che questo metodo marcano solo l'rRNA nel nucleolo, nonostante due coppie di sonde abbiano come bersaglio gli SNP negli rRNA 18S e 28S che vengono esportati nel citoplasma (l'rRNA contenente i due siti bersaglio ITS1 esiste solo nel nucleolo). La mancanza di segnale citoplasmatico FISH suggerisce due possibilità non esclusive: 1) le sonde 18S e 28S da sole sono insufficienti per rilevare l'rRNA citoplasmatico, forse perché l'rRNA è più disperso in tutto il citoplasma che nel nucleolo, o 2) c'è una minore efficienza di legame della sonda agli rRNA integrati nelle subunità ribosomiali mature rispetto all'rRNA 45S non processato. Ulteriori SNP all'interno degli rRNA 18S e 28S possono consentire la rilevazione di rRNA citoplasmatici da parte di FISH sensibili agli SNP.

Altri metodi per valutare la trascrizione dell'rRNA locus-specifica includono approcci di sequenziamento dell'rRNA che differenziano l'espressione delle varianti di rRNA assegnate a specifici loci⁶. Allo stesso modo, la qPCR può valutare in modo differenziale l'espressione di varianti di rRNA che sono abbastanza distinte da consentire un rilevamento univoco ^5,21, sebbene non sia chiaro se il silenziamento di queste varianti rappresenti il silenziamento di un intero locus di rDNA. Sebbene questi metodi possano essere efficaci nel quantificare l'espressione di specifiche varianti di rRNA, non possono essere eseguiti con la risoluzione di una singola cellula. L'eterogeneità del silenziamento dell'rDNA del cromosoma X nei tessuti di Drosophila suggerisce che esiste una forte variazione da cellula a cellula nella trascrizione del locus dell'rDNA¹⁷ e sottolinea la necessità di tecniche in grado di spiegare questa variabilità. Le caratteristiche di imaging associate alla trascrizione attiva nei loci di rDNA, come la variante istonica H3.3¹⁰ o il fattore di trascrizione Pol I UBF²², sono state utilizzate per identificare la trascrizione di rRNA locus-specifica con risoluzione di una singola cellula. Tuttavia, entrambi questi metodi richiedono i cromosomi condensati delle cellule mitotiche per distinguere la trascrizione che si verifica in un particolare locus di rDNA. Nelle cellule di Drosophila, i loci di rDNA sui cromosomi X e Y possono essere identificati dalla forma del cromosoma¹⁰, ma l'identificazione di loci di rDNA trascrizionalmente attivi nelle cellule umane richiede anche la co-colorazione con etichette cromosomiche specifiche²². Il metodo SNP-FISH non richiede né la co-marcatura cromosomica-specifica né la marcatura di marcatori trascrizionali e può essere valutato in qualsiasi stadio del ciclo cellulare o in cellule post-mitotiche, fornendo flessibilità per l'uso in diversi tessuti e condizioni sperimentali.

Questo metodo rRNA SNP-FISH può essere modificato per l'uso con altri SNP che distinguono tra rRNA di Drosophila o potenzialmente essere applicato a SNP che distinguono tra loci di rDNA in altri organismi. L'applicazione di questo metodo a organismi con più di due loci di rDNA richiederà che un locus abbia un aplotipo unico di variante di rDNA contenente almeno due SNP che non sono presenti su nessun altro locus di rDNA e che sono condivisi tra tutte le copie 45S in quel locus. Questo requisito significa che il metodo sarà in grado di specificare la trascrizione solo da un locus specifico rispetto a tutti gli altri (ad esempio, gli SNP rRNA dal locus 1 rispetto agli SNP condivisi dai loci 2 e 3). Tuttavia, se ogni locus di rDNA ha un aplotipo compatibile, è possibile combinare più esperimenti per valutare individualmente la trascrizione di ciascun locus uno alla volta. La rigorosità relativamente bassa della temperatura di ibridazione (37 °C) utilizzata in questo protocollo consente un forte legame con la sonda, in particolare data la porzione corta e non mascherata della sonda, sebbene sia stato dimostrato che l'ibridazione a temperature più elevate (50-75 °C) migliora il segnale di alcune sonde FISH²³. Temperature di ibridazione più elevate possono migliorare lo spostamento del filamento della maschera e aumentare il legame della sonda, ma temperature troppo elevate possono destabilizzare il legame sonda-maschera e perdere la specificità SNP. Per questo motivo, non ci aspettiamo che SNP-FISH etichetti specificamente il DNA perché le temperature necessarie per fondere i bersagli di DNA a doppio filamento per consentire il legame con la sonda destabilizzerebbero anche il legame sonda-maschera ed eliminerebbero la specificità del bersaglio sensibile allo SNP. Tuttavia, l'ottimizzazione della temperatura di ibridazione per le nuove sonde SNP di rRNA può aumentare il segnale, in particolare quando sono disponibili solo due siti SNP. La perdita del silenziamento dell'rDNA del cromosoma X è associata alla riduzione del numero di copie dell'rDNA in Drosophila¹³, quindi lo sviluppo di saggi SNP-FISH per caratterizzare la trascrizione dell'rRNA locus-specifico in altri sistemi può servire come strumento utile per valutare l'integrità dell'rDNA e la funzione dei ribosomi. Inoltre, questo metodo è stato modificato per l'uso con una variante di delezione in Drosophila, e questa singola variante strutturale di rRNA era adatta per la rilevazione (forse a causa della maggiore affinità di legame del bersaglio senza una maschera sonda)¹⁷. L'uso di varianti strutturali di rRNA potenzialmente combinate con varianti SNP amplia il potenziale di applicazione in altri sistemi. Poiché i meccanismi che regolano la trascrizione del locus dell'rDNA rimangono in gran parte poco chiari, la flessibilità e la potenziale adattabilità dell'rRNA SNP-FISH ad altri sistemi lo rendono un potente strumento per studi futuri per studiare la trascrizione dell'rRNA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTC Tempo 96 Thermal Cycler	Bio Rad	12015382	È possibile utilizzare qualsiasi termociclatore
Provette per PCR a tappo piatto da 0,2 mL a 8 strisce	VWR	89133-912	È possibile utilizzare qualsiasi provetta compatibile
Scala DNA da 1 kb	NEB	N3232S	Da utilizzare per il controllo del sequenziamento delle dimensioni dell'amplicone PCR mediante elettroforesi su gel
Provette graduate per microcentrifuga da 1,5 mL	USA Scientific	1615-5510	Qualsiasi provetta certificata priva di RNasi farà
2 mM dNTP Mix	ThermoFisher Scientific	R0241
50x TAE Buffer	Bio Rad	1610743	Utilizzato per l'elettroforesi su gel. È possibile utilizzare qualsiasi buffer TAE.
5M NaCl			Qualsiasi NaCl può essere utilizzato o preparato da qualsiasi fonte
Agarosio	VWR	97064-250	Qualsiasi agarosio può essere utilizzato
ApE - Un software di editor di plasmidi	N/A	N/A
Smalto			essere utilizzato Qualsiasi smalto per unghie di qualsiasi rivenditore Può essere utilizzato
Vetro di copertura, n. 1 Spessore	Thomas Scientific	6672A38
Formamide deionizzata	Fisher Scientific	NC9569627
destrano solfato di sodio	Sigma Aldrich	D8906-10G
DreamTaq Green PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	K1081
Dumont #5 pinze	Fine Science Tools	11252-20	Utilizzato per la dissezione di campioni
EDTA (0,5 M), Ph 8,0	ThermoFisher Scientific	R1021	È possibile utilizzare qualsiasi prodotto comparabile
Etanolo	VWR	89125-172	È possibile utilizzare qualsiasi etanolo a prova di 200 gradi. Utilizzato per la diluizione al 70% di etanolo per la permeabilizzazione e la pulizia in condizioni prive di RNASI
Bromuro di etidio	ThermoFisher Scientific	15585011
Sistema orizzontale di elettroforesi su mini gel	Fisher Scientific	14-955-170	È possibile utilizzare qualsiasi sistema di elettroforesi su gel
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Piastra di colorazione per micro-test	Electron Scienze della microscopia	71564	Utilizzato per la dissezione di campioni
Agitatore di nutazione	Sigma Aldrich	BMSB3D1020	È possibile utilizzare qualsiasi agitatore di nutazione
Parafilm	USA Scientific	3023-4526
Soluzione salina tamponata con fosfato (10X) pH 7,4, senza RNasi	Life Technologies	AM9624
Pierce 16% Formaldeide (w/v), senza metanolo	Life Technologies	28908
Bagno d'acqua di precisione per uso generico	Life Technologies	TSGP02	È possibile utilizzare qualsiasi bagno d'acqua
estrazione del gel QIAquick	Qiagen	28704	È possibile utilizzare qualsiasi kit di estrazione del gel
Soluzione di proteinasi K ricombinante (20 mg/mL)	Invitrogen	AM2546	È possibile utilizzare qualsiasi prodotto comparabile
UltraPure BSA ThermoFisher Scientific senza RNAsi		AM2618
S. cerevisiae tRNA	Sigma Aldrich	R8759
SSC (20X), senza RNasi	Fisher Scientific	AM9763
Triton-X 100	Life Technologies	A16046.AE
UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7,5	ThermoFisher Scientific	15567027	È possibile utilizzare
qualsiasi prodotto comparabileTecnologie per la vita dell'acqua distillata ultrapura senza DNasi/RNasi		10977023
complesso vanadil-ribonucleosidico	NEB	S1402S
Supporti di montaggio VECTASHIELD con DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
VWR Superfrost Microscopio Vetrino	VWR	48311-601
y[1]w[1] Drosophila melanogaster linea	Bloomington Drosophila Stock Center	1495
Microscopio confocale Zeiss LSM 980	Microscopia		È possibile utilizzare qualsiasi microscopio confocale con emissione e rilevamento compatibili
Stereomicroscopio Zeiss Stemi 2000-C e sorgente luminosa	Microscopio centrale	455053	È possibile utilizzare qualsiasi stereomicroscopio