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Articolo metodologico

Un protocollo robusto e riproducibile per la generazione di organoidi a tubo neurale da singole cellule staminali embrionali di topo

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DOI:

10.3791/67883

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19 dicembre 2025

 , 
1Vienna BioCenter, Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA), 2Vienna BioCenter PhD Program, Doctoral School of the University of Vienna and Medical University of Vienna

In questo articolo

Sommario

Gli organoidi a tubo neurale tridimensionale (NTO) derivati da cellule staminali embrionali di topo sono strumenti preziosi per studiare il sistema nervoso centrale durante lo sviluppo precoce. Qui viene presentata una dimostrazione passo dopo passo di un protocollo ottimizzato per la coltivazione degli NTO in vitro, fornendo condizioni di coltura stabili e strategie di risoluzione dei problemi per una generazione affidabile e riproducibile di NTO.

Abstract

Lo sviluppo dei mammiferi è un processo altamente complesso, caratterizzato dalla necessità di segnalazioni precise dipendenti dalla concentrazione e dal tempo per la corretta formazione dei pattern e morfogenesi. Nonostante i notevoli progressi tecnologici e le conoscenze acquisite, numerosi aspetti dello sviluppo dei mammiferi rimangono sfuggenti. Esaminando l'intero organismo, diventa difficile districare gli effetti dei singoli percorsi o il meccanismo attraverso cui gli stimoli esterni guidano l'interferenza dei tessuti e dei fattori circostanti. Per affrontare questa complessità, modelli tridimensionali (3D) in vitro come gli organoidi sono emersi come strumenti preziosi. Gli organoidi, derivati da cellule staminali embrionali (ESC) o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), presentano caratteristiche simili a tessuti che assomigliano molto ai loro corrispettivi in vivo in termini di modelli di espressione e funzionalità. È importante sottolineare che offrono accessibilità per la manipolazione e studi biologici estesi all'interno di un contesto sperimentale controllato. Nonostante abbiano origine da colture pluripotenti, i sistemi organoidi spesso mostrano eterogeneità e notevole variabilità, limitandone l'utilità nello studio di questioni biologiche complesse e intricate. Pertanto, è urgente la necessità di protocolli dettagliati volti ad armonizzare procedure che portino a dati riproducibili di alta qualità, riduzione dei materiali utilizzati e che, cosa importante, permettano l'indagine di fenomeni complessi. In questo contesto, qui viene presentato un protocollo ottimizzato per la coltivazione di organoidi a tubo neurale (NTO) in vitro . Producendo condizioni di coltura stabili e offrendo strategie complete di risoluzione dei problemi, questo protocollo consente la generazione affidabile e riproducibile di NTO, che fungono da modello adeguato per studiare questioni scientifiche rilevanti, inclusi i meccanismi di induzione neurale, patterning e sviluppo precoce del sistema nervoso centrale.

Introduzione

Lo sviluppo dei mammiferi, che parte da una singola cellula staminale totipotente, è un processo complesso che coinvolge l'induzione della formazione di pattern e dellamorfogenesi 1,2. Questo sviluppo richiede programmi cellulari strettamente regolati per gestire le interazioni dinamiche tra cellule e i loro ambienti. Le cellule staminali hanno la capacità intrinseca di percepire, integrare e rispondere a segnali sistemici e locali, inclusi gradienti dimorfogeno 3, confinimeccanici 4, proliferazione cellulare e rimodellamentoambientale 5. I segnali spaziotemporali esterni guidano anche risposte multicellulari, inizialmente, nei tessuti omogenei, per garantire la formazione precisa di strutture complesse. Le cellule staminali, distinte per la loro capacità diauto-rinnovamento 6,7 e differenziazione, svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo embrionale e nella riparazione dei tessuti adulti, con i principali tipi che includono cellule staminali embrionali (ESC), cellule staminali adulte (ASC) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC).

Gli ESC vengono estratti dalla massa cellulare interna (ICM) di un blastocisti e vengono tipicamente coltivati in un ambiente bidimensionale (2D) su cellule alimentari o su matrice extracellulare utilizzando medi di coltura specifici per mantenere la loro pluripotenza8. Negli ultimi anni, la necessità di condizioni e tecnologie di coltura cellulare più realistiche è aumentata drasticamente, così sono stati istituiti modelli cellulari e tissulari tridimensionali (3D) per studiare i processi biomedicifondamentali 9. Soprattutto nella biologia dello sviluppo, questi modelli 3D come gli organoidi offrono un metodo robusto per modellare la morfogenesi tissutale e l'organogenesi exvivo9. Gli organoidi si formano tramite l'auto-organizzazione di cellule staminali proliferanti che si sviluppano spontaneamente in complesse strutture 3D attraverso la rottura della simmetria e la formazione di schemi. Questo processo è simile, anche se non identico a quello osservato in vivo, e avviene per lo più senza guida esterna ma guidato da dinamiche interne e interazioni10. Poiché gli organoidi imitano da vicino la struttura e la funzione degli organi reali, possono fornire una rappresentazione più accurata della biologia dei mammiferi rispetto alle tradizionali colture cellulari2D 11. Inoltre, uno dei principali benefici è quello etico, poiché gli organoidi riducono la necessità di modelli animali, affrontando le preoccupazioni relative ai test suglianimali 12,13. Inoltre, gli organoidi offrono una piattaforma per lo screening ad alto rendimento dei farmaci, migliorando la previsione dell'efficacia e della tossicità del farmaco. Tuttavia, ci sono anche diverse sfide associate all'uso degli organoidi. Sebbene siano più realistiche rispetto alle colture 2D, non replicano completamente la complessità e le interazioni di interi organi all'interno di un organismovivente 14. Inoltre, può osservarsi una significativa variabilità tra organoidi, anche quando derivati dallo stesso tipo di cellule, portando a incoerenze nei risultatisperimentali 15. Pertanto, la coltivazione degli organoidi in modo robusto e riproducibile è essenziale e richiede competenze tecniche avanzate, attrezzature specializzate e protocolli dettagliati.

Il sistema nervoso è una rete complessa responsabile del coordinamento delle azioni e dell'elaborazione delle informazioni sensoriali inviando e ricevendo segnali in tutto il corpo, controllando e coordinando così tutte le funzioni necessarie, inclusi movimento, sensazione, pensiero e funzioni autonome come battito cardiaco e digestione. Il precursore del sistema nervoso centrale, costituito dal cervello e dal midollo spinale, è il tubo neurale. È fondamentale comprendere come le strutture neurali si formano e funzionano all'interno dello sviluppo precoce del tubo neurale per ottenere informazioni su vari disturbi neurologici e anomalie dello sviluppo. I disturbi neurosviluppali sono difficili da studiare in vivo, soprattutto quando hanno origine da soggetti umani a causa di questioni etiche. Gli organoidi neurali, come gli organoidicerebrali 16,17, hanno migliorato significativamente la comprensione dello sviluppo e delle malattie del sistema nervoso fornendo modelli versatili e accessibili che imitano da vicino il tessuto cerebrale umano. Queste strutture tridimensionali, derivate da cellule staminali pluripotenti (PSC), replicano vari aspetti dello sviluppo cerebrale, inclusa la formazione di regioni cerebrali distinte, diversità cellulare e complesse retineurali 16,18,19. Permettendo ai ricercatori di osservare le fasi dello sviluppo in tempo reale e di studiare i principali meccanismi regolatori, questi organoidi offrono approfondimenti sullo sviluppo cerebrale normale. Gli organoidi cerebrali permettono anche la modellizzazione di malattieneurosviluppative 19 e neurodegenerative20, come la microcefalia 16,21, l'infezione da virusZika 22, i disturbi dello spettroautistico 23 e altri, chiarendo i meccanismi delle malattie e identificando potenziali bersagli terapeutici. Inoltre, gli organoidi cerebrali rappresentano piattaforme preziose per il test e lo sviluppo di farmaci, facilitando la valutazione dell'efficacia e della tossicità dei farmaci in un ambiente simile a quello del cervello umano e accelerando gli approcci della medicina personalizzata. Inoltre, forniscono un contesto controllato per studiare le interazioni geni-ambiente, migliorando la comprensione delle malattie complesse derivanti dall'interazione di fattori genetici e ambientali. Tuttavia, poiché gli organoidi neurali, come gli organoidi cerebrali, sono tipicamente formati da aggregati di cellule, spesso mostrano un'eterogeneità cellulare significativa e variabilità negli esiti sperimentali, che a loro volta influenzano l'interpretabilità dei dati generati, rappresentando una notevole sfida per iricercatori 17. Per questo motivo, l'ottimizzazione dei protocolli e criteri precisi di controllo qualità sono fondamentali per attenuare dati preziosi che rappresentano adeguatamente la condizione in vivo.

Meinhardt ecolleghi 24 hanno avuto un impatto cruciale riportando per primi un protocollo organoide neurale clonale che imita lo sviluppo precoce del tubo neurale, formato da singole cellule staminali embrionali (ESC) che minimizza drasticamente l'eterogeneità inter-organoidi. Questa innovazione consente ai ricercatori di studiare i processi e i meccanismi dello sviluppo, così come la patterning neurale, in un ambiente preciso e definito con una risoluzione eccezionale. Fino ad ora, molti laboratori hanno sviluppato organoidi neurali, per lo più di origine topolina o umana, che imitano diverse parti del tubo neurale e il suo sviluppo, come riassunto in25. Tuttavia, sulla base delle informazioni disponibili, il protocollo stabilito da Meinhardt et al.24 è l'unico metodo in cui gli NTO si formano in modo affidabile da una singola cellula, si auto-organizzano e si sviluppano efficacemente in destini dorsoventrali seguendo un singolo impulso globale di acido retinoico (RA) senza l'aggiunta di altri fattori ventralizzanti come il Sonic Hedgehog Agonist (SAG)26, o l'uso di camere microfluidiche che forniscono informazioni spaziali dovute alla formazione di gradienti. Il protocollo qui fornito è stato adattato da Meinhardt et al.24 come fornito in Krammer et al.26. In questo protocollo, singoli ESC di topo vengono inseriti in una matrice di coltura cellulare ed esposti a condizioni di neurodifferenziazione definite. Nel giro di due giorni, queste cellule si espandono e epitelizzano clonalmente, formando una struttura 3D rotonda a ellissoide con un unico lumen e cellule stratificate apico-basale che la circondano. Al secondo giorno, un impulso globale di 18 ore della molecola di segnalazione AR aumenta la differenziazione neurale, posteriorizza gli NTO dal mesencefalo ai livelli del retroencefalo/midollo cervicale e induce la formazione di una singola piastra funzionale entro il giorno 6, che modella il NTO dal ventrale al dorsale.

Il protocollo ottimizzato offre diversi vantaggi chiave. Consente un'epitelizzazione robusta nei primi tre giorni e genera tessuti sferici relativamente piccoli di circa 200 μm di diametro, ciascuno contenente un singolo lumen. Gli organoidi nascono clonalmente da singole cellule e sono mantenuti in un mezzo di coltura senza siero e definito chimicamente. Nel giro di sei giorni si ottiene una graduale differenziazione neurale dalle colture pluripotenti, con origine in organoidi che mostrano un'identità mesencefalo anteriore entro il sesto giorno e strutture dorsoventrali simili al midollo spinale posteriore o cervicale dopo un impulso globale diAR 26.

Diversi aspetti sono stati adattati e differiscono dal protocollooriginale 22,25 per migliorare la riproducibilità e la produttività. Queste includono condizioni di coltura ESC modificate, un numero ridotto di celle di input, un mezzo di differenziazione migliorato e un protocollo di differenziazione adattato che omette l'integrazione di Noggin nei giorni 0-2 (già utilizzato nel26° periodo). Inoltre, la densità di semina è stata ottimizzata per l'uso in piastre a 96 pozzi, permettendo un'analisi ad alta produttività. Insieme, questi miglioramenti hanno portato a un aumento del 40% nell'efficienza della formazione e del pattern degli NTO, da inizialmente ~40%24 a ora ~80%26 nella versione aggiornata.

Qui (Figura 1) viene fornita una descrizione dettagliata di un protocollo ottimizzato che consente una generazione robusta e riproducibile di NTO nella matrice di colture cellulari. Il protocollo comprende tutte le fasi della gestione degli NTO, dalla semina iniziale degli ESC per i saghi di differenziazione fino alla successiva manutenzione, fissazione e analisi. Include inoltre linee guida per il controllo della qualità attraverso la valutazione visiva giornaliera della morfologia NTO, nonché la caratterizzazione critica dell'identità organoide tramite colorazione con anticorpi per verificare la corretta patterning e la differenziazione neurale. Inoltre, vengono offerti approcci completi di risoluzione dei problemi, che consentono una valutazione critica in ogni fase del protocollo, necessaria per garantire la riproducibilità e l'affidabilità dei protocolli sperimentali. Queste istruzioni dettagliate aiutano a identificare e risolvere potenziali problemi, minimizzare gli errori e ottimizzare i risultati. Questo è fondamentale per mantenere l'integrità degli esperimenti scientifici e permettere ad altri scienziati di replicare con successo il lavoro e trarre conclusioni complete dai dati generati, facendo così avanzare il settore.

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Figura 1: Panoramica del protocollo. (A) Passaggio degli ESC (vedi passo 1.1). (B) Aliterazione della matrice di coltura cellulare e semina di singoli ESC per la differenziazione in NTO (vedi passo 1.2). (C) Citazione di AR e trattamento dell'AR (vedi passo 2). (D) Rimozione dell'artrite reumatoide e routine di sostituzione quotidiana del medium (vedi passo 3). Questa figura è stata creata con BioRender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

NOTA: Controlla ogni giorno cellule e NTO per la valutazione della qualità prima di qualsiasi ulteriore procedura (sostituzione del terreno, trattamento, fissazione, ecc.). Tutte le procedure che richiedono l'esposizione diretta delle cellule all'aria devono essere eseguite all'interno di un armadietto di biosicurezza per garantire la sterilità e prevenire la contaminazione della coltura.

1. Manutenzione, passaggio e seeding degli ESC per NTO

  1. Passaggio
    1. Mantenere le ESC su piastre di coltura cellulare o pozzi di una piastra a 6 pozzi pre-rivestita con gelatina allo 0,15% per 30 minuti a 37 °C.
    2. Passaggio ESC ogni 2-3 giorni, con sostituzione giornaliera del mezzo dal secondo giorno in poi.
    3. Preriscaldare tutti i reagenti (Medium, PBS, soluzione enzimatica) a un minimo di 21 °C e un massimo di 37 °C prima dell'uso.
    4. Controllare le cellule al microscopio a contrasto di fase (vedi immagini rappresentative, Figura 2). Assicurarsi che le colonie abbiano una dimensione e una morfologia adeguate (Figura 2A), confermando anche che aderano al fondo del piatto.
      NOTA: Scartare la coltura se più del 10% degli ESC topi è differenziato (Figura 2B) e preparare una coltura appena scongelata, che dovresti superare almeno due volte prima di seminare gli ESC per un saggio di differenziazione. I ricercatori esperti possono giudicare tramite valutazione visiva (vedi anche Mulas et al.28) o tramite colorazione di anticorpi per l'espressione dei marcatori (ad esempio, OCT4, vedi anche Ying et al.29).
    5. Apri il coperchio della piatta/piatto di coltura, inclinalo leggermente e aspira con cura il substrato. Tieni le cellule fuori dall'incubatore per il minor tempo possibile. Conserva le cellule senza substrato il più brevemente possibile per evitare che la coltura si secchi.
    6. Lavare le colonie con 500 μL di PBS preriscaldato (aggiungere alle celle in un singolo pozzo di una piastra a 6 pozzi), e aspirare immediatamente di nuovo.
      NOTA: Questo passaggio è cruciale perché: i) il trasferimento del mezzo ESC (2iLIF) deve essere evitato prima che il test di differenziazione (altrimenti la formazione di NTO sarà ostacolata), ii) FBS o BSA nel mezzo di coltura possono fermare la dissociazione. Questo vale per gli ESC coltivati in un diverso mezzo ESC, contenente FBS o BSA.
    7. Aggiungi 500 μL di soluzione enzimatica preriscaldata e trasferisci le cellule nell'incubatrice.
    8. Incubare le cellule a 37 °C per 3 minuti usando un timer.
    9. Dopo il tempo di incubazione, rimuovere la piastra e controllare le cellule al microscopio a contrasto di fase.
      NOTA: Gli ESC dovrebbero essersi staccati dalla piastra di coltura; se no, batti il piatto con decisione ma con attenzione (Figura 2C).
    10. Aggiungi 1 mL di mezzo N2B27 (Tabella 1) pipettandolo direttamente sulle celle.
      NOTA: Durante la preparazione del mezzo (N2B27), la glutammina viene conservata per un massimo di 5-10 minuti a 37 °C, preferibilmente a temperatura ambiente. Gli ESC dovrebbero essere lavati dal piatto, lasciando aree 'vuote' nel piatto di coltura.
    11. Usa una pipetta P1000 e inclina leggermente la piastra in modo che tutte le colonie attaccate alla teglia di coltura possano essere lavate.
    12. Per dissociere i gruppi di cellule, inclina leggermente la piastra di piattaforma, posiziona la punta della pipetta (P1000) al centro della piastrella, premi la punta contro il fondo della piastra ma leggermente fuori dall'asse perpendicolare e risciacqua le cellule. Ripeti da cinque a dieci volte per rompere i grumi cellulari.
    13. Controlla che le cellule siano dissociate correttamente in singole cellule al microscopio a contrasto di fase (Figura 2D) e ripeti se ci sono ancora grumi.
    14. Dopo la completa dissociazione, trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifuga conico sterile pulito da 15 mL, lavare il pozzo vuoto dove le cellule sono state coltivate con 1 mL di mezzo N2B27 e trasferire nello stesso tubo centrifuga conico con la sospensione cellulare.
    15. Centrifuga le cellule per 5 minuti a 453 x g in un'ultracentrifuga.
    16. Aspira con cura il soprandante.
    17. Risospendere le cellule in una quantità appropriata di mezzo N2B27 (ad esempio, 1 mL) e contare le cellule (vedi Tabella 2 per i numeri cellulari raccomandati per il test di differenziazione in NTO).
  2. Differenziazione degli ESC in organoidi a tubo neurale (NTO)
    1. Aliterazione della matrice di coltura cellulare
      1. Scongelare la bottiglia di matrice di coltura cellulare durante la notte su ghiaccio a 4 °C (mai a temperatura ambiente né scongelata a mano). Non lasciare la matrice di coltura cellulare a 4 °C più a lungo del necessario; Aliquot e congelare il prima possibile per preservarne la funzionalità.
      2. Nel mobile di biosicurezza, posizionare i tubi della microcentrifuga da 1,5-2 mL sul ghiaccio per pre-raffreddarli, mantenendo la bottiglia della matrice di coltura cellulare su ghiaccio fresco.
      3. Mescola con attenzione la matrice di colture cellulari scongelate per evitare la formazione di bolle, poiché le bolle possono causare distacco dal pozzo o dalla piastra dopo la gelatina.
      4. Matrice di coltura cellulare aliquota al volume desiderato (consigliato 0,5-1 mL) e congelare a -20 °C fino a un ulteriore utilizzo. Evita di sostituire la punta tra le aliquote, poiché le punte a temperatura ambiente possono far solidificare la matrice della coltura cellulare all'interno, causando una perdita significativa. Invece, raffredda le punte della pipetta a 4 °C conservandole in frigorifero prima dell'uso.
    2. Semina di singole cellule in una matrice di colture cellulari
      1. Quantificare il numero di cellule necessarie (matrice di coltura cellulare da 100 cellule/μL, vedi Tabella 2).
      2. Trasferire il numero di cella appropriato (sospensione della cella) su un tubo centrifuga conico pulito da 15 mL e riempire con 1 mL di N2B27.
      3. Centrifuga le celle per 5 minuti a 453 x g nella centrifuga.
      4. Aspira il soprantantante e posiziona il tubo conico della centrifuga sul ghiaccio.
      5. Sospendere con cura la pellet cellulare sul ghiaccio in una quantità adeguata di matrice di coltura cellulare scongelata e liquida, evitando la formazione di bolle.
      6. Distribuire la quantità appropriata di sospensione matrix cellulare, in uno strato sottile, su un piatto con fondo di vetro o plastica ottimale per l'imaging (vedi Tabella 2, Figura 3A-C), senza toccare le pareti delle piastre multi-pozzetto. A causa dell'elevata tensione superficiale, la goccia della matrice della coltura cellulare può spostarsi dal centro del pozzo alle pareti se sono state precedentemente toccate, il che causa una distribuzione inadeguata delle cellule/NTO.
        NOTA: Se si utilizzano piastre multi-pozzo: prima disegna un cerchio di matrice di coltura cellulare usando una punta di pipetta P20 (piastra a 96 pozzi) o P200 prima di 'riempirla' con la sospensione matrix di coltura cellulare (Figura 3B).
      7. Posizionare la piastra o la piastra multi-pozzetto nell'incubatore a 37 °C per far solidificare la matrice di coltura cellulare. Stimare 1 min per μL di matrice di coltura cellulare per quantità minori e un massimo di 15 min per 40 μL o più.
      8. Dopo il tempo di incubazione, togli il piatto e aggiungi un volume appropriato di substrato (vedi Tabella 2). Gli ESC nella matrice di coltura cellulare non devono seccarsi durante la semina per il saggio di differenziazione in NTO o durante la sostituzione del mezzo. Dopo la gelatinificazione, il mezzo deve essere applicato il prima possibile. La gelatina viene tipicamente completata in 1 minuto a 37 °C per matrice di coltura cellulare da 1 μL e al massimo 15 minuti per una matrice di coltura cellulare da 40-100 μL quando distribuita come strato sottile.
        NOTA: Per evitare di seccare le ESC nella matrice di coltura cellulare, maneggiare un massimo di 8 pozzi di una piastra da 96 pozzi con una pipetta multicanale o un piatto/pozzo a fondo di vetro da 35 mm di qualsiasi altra piastra multipozzetto. Tieni le cellule fuori dall'incubatore per il minor tempo possibile.
      9. Controlla la densità di semina e la distribuzione cellulare all'interno della matrice di coltura cellulare al microscopio a contrasto di fase (Figura 3C,D). Si raccomanda la densità ottimale di semina (Tabella 2 e Figura 3). Tuttavia, per alcune applicazioni, come l'analisi precoce, una densità di semina fino a 10 volte superiore può essere vantaggiosa.
        NOTA: Mescola con cura la sospensione matrix-cell della coltura cellulare risospendendola con una punta di pipetta P300 o P1000 prima di seminare per il test di differenziazione per contrastare la variabilità del numero cellulare tra pozzi/piattole. Questo passaggio non è raccomandato prima di seminare ogni singolo pozzo per proteggere dalla perdita della matrice della coltura cellulare, poiché questo può solidificarsi e aderire alla punta della pipetta.

Tabella 1: Componenti medie (base N2B27, 2iLIF, N2B27diff). Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Informazioni sul numero di cellule per piatto, quantità di matrice di coltura cellulare, volume del mezzo e tempo di gelatina. Clicca qui per scaricare questa tabella.

2. Trattamento dell'AR degli NTO per migliorare la differenziazione neurale e indurre posteriorizzazione e ventralizzazione

  1. Aliterazione dell'acido retinoico (AR)
    1. Porta polvere ARA all-trans a temperatura ambiente (conservata a -20 °C).
    2. Ricostituire la polvere in un volume appropriato di DMSO per raggiungere una concentrazione finale di 100 mM.
    3. Aliquota 1 μL di 100 mM di RA in una fiala a vite da 1,5 mL ciascuna.
    4. Aggiungi gas Argon finché il tubo non è 'pieno'.
      NOTA: Poiché il gas argon è più pesante dell'ossigeno, scende sul fondo del tubo per coprire e preservare la RA dall'aria. Questo si percepisce sulle mani quando fuoriesce quando il tubo è pieno.
    5. Chiudi bene la fiala. L'AR è altamente sensibile alla luce e all'aria.
    6. Conservare le aliquote al buio a -80 °C fino a un ulteriore utilizzo. In alternativa, l'AR ricostituito può essere conservato in tubi microcentrifughe da 1,5 mL nel liquidoN 2.
      NOTA: L'AR ricostituito e diluito può essere conservato in frigorifero se coperto con la carta stagnola per un massimo di 2 giorni.
  2. Trattamento per l'AR delle NTO per 18 ore (Figura 4A)
    1. Estrai 1 μL dell'aliquota con una concentrazione di 100 mM da -80 °C e lascialo al buio fino allo scongelamento a temperatura ambiente (ad esempio, nel palmo della mano o in una portabolliere in un armadietto di biosicurezza senza luci accese).
      NOTA: Se le aliquote di RA sono conservate nel liquido N2, aprire immediatamente il coperchio del tubo della microcentrifuga per evitare l'esplosione del tubo, poi chiudere di nuovo e procedere al passo 2.2.2.
    2. Una volta scongelato, aggiungere 400 μL di mezzo N2B27diff preriscaldato per una concentrazione di 250 μM utilizzando una pipetta P1000. Mescola accuratamente per ottenere omogeneità.
      NOTA: In alternativa, la AR può essere ricostituita e diluita in DMSO puro invece che in mezzo N2B27diff, anche se questo aumenta la concentrazione di DMSO nella coltura. Durante la preparazione del mezzo (N2B27diff), la glutammina viene conservata per un massimo di 5-10 minuti a 37 °C, e preferibilmente a temperatura ambiente.
    3. Prendi piatti/piatti che coltivano NTO dall'incubatrice e mettili in un armadietto sterile per la biosicurezza.
    4. Esaminare le NTO in crescita al microscopio a contrasto di fase. La morfologia degli NTO è cruciale per fornire informazioni sulla fattibilità della coltura e sull'efficacia dell'esperimento (Figura 4B-D).
    5. Togli il coperchio del piatto/piatto e inclina leggermente il piatto di lato. Aspirare il mezzo con attenzione, utilizzando una pipetta P200 o un aspiratore, senza disturbare la matrice della coltura cellulare. Tieni gli NTO senza mezzo il più brevemente possibile per evitare che si secchino la coltura e/o il mix di colture cellulari.
    6. Aggiungere un volume appropriato di N2B27diff integrato con una soluzione di RA da 250 nM (vedi Tabella 2), coprire con il coperchio e trasferire gli NTO nell'incubatrice.
      NOTA: A volte, soprattutto se l'AR non è stato completamente mescolato, possono formarsi precipitati più difficili da dissolvere nel normale N2B27diff. In questo caso, si scarta le aliquote e si producono nuove aliquote di AR perché questi precipitati hanno una concentrazione di ARA sconosciuta e incontrollata.

3. Rimozione dell'AR e routine di sostituzione quotidiana del medium degli NTO

  1. Trasferire la piastra di coltura dall'incubatore all'armadietto sterile di biosicurezza.
  2. Rimuovi il coperchio e inclina leggermente la piastra di lato.
  3. Aspirare con cura N2B27diff contenente RA, utilizzando una pipetta P200 o un aspiratore, senza toccare la matrice di coltura cellulare.
  4. Aggiungi PBS preriscaldato (usa il volume sufficiente per coprire la goccia della matrice di coltura cellulare o come indicato nella Tabella 2), poi inclina di nuovo la piastra e rimuovila con cura per lavare via l'AR residua.
  5. Aggiungere un volume appropriato di N2B27diff (come indicato nella Tabella 2), pipettando il mezzo lungo la parete del pozzo/piatto per evitare di danneggiare la goccia della matrice della coltura cellulare.
  6. Sostituisci il substrato ogni giorno seguendo i passaggi 3.1-3.3, poi aggiungi delicatamente N2B27diff fresco e preriscaldato pipettando il mezzo sulla parete del pozzo/piatto prima di rimettere gli NTO nell'incubatrice. La pipettura diretta e vigorosa o l'aggiunta di mezzo freddo/PBS sulla goccia della matrice di coltura cellulare può causare la sua rottura e il distacco dal piatto/piatto.
    NOTA: Quando si perturbano le vie usando piccole molecole o proteine ricombinanti, è importante sostituire il mezzo quotidianamente. Se i farmaci devono essere applicati per più di un giorno, le soluzioni devono essere preparate freschamente ogni giorno o almeno ogni due giorni per garantire la stabilità di proteine/farmaci e la presenza continua delle concentrazioni corrette.

4. Fissazione degli NTO

NOTA: Gli NTO sono fissi come descritto da Krammer et al.26. A seconda dell'anticorpo da utilizzare successivamente, può essere necessario il PFA proveniente da diverse fonti (acquistati in negozio, interni, ecc.).

  1. Scongelare l'aliquota PFA a 4 °C durante la notte.
  2. Porta il PFA a temperatura ambiente prima dell'uso.
  3. Se si utilizza una concentrazione di PFA più alta, diluire il PFA al 4% in mezzo N2B27diff o PBS in un cappuccio chimico.
  4. Estrai gli NTO dall'incubatrice e trasferili in una cappa chimica.
  5. Apri il coperchio e aggiungi direttamente il 4% di PFA in un rapporto 1:1 alle NTO per ottenere una concentrazione finale del 2% (ad esempio, 100 μL di PFA al 4% aggiunto ai 100 μL di N2B27diff nella piastra a 96 pozzi).
  6. Rimetti il coperchio e incuba gli NTO per 30 minuti a temperatura ambiente. Imposta un timer, poiché una fissazione più lunga può compromettere le prestazioni di alcuni trattamenti con anticorpi.
    NOTA: Il PFA è tossico e non deve essere inalato. Lavora con attenzione e attenzione sotto il cappuccio chimico. Alcuni anticorpi richiedono l'uso di un PFA specifico o un tempo di fissazione più breve o ottimizzato.
  7. Dopo 30 minuti, togli il coperchio e inclina leggermente il piatto di lato, poi segui i passaggi 3.3-3.4.
  8. Aggiungi con cura PBS preriscaldato (usa un volume sufficiente a coprire la goccia della matrice di coltura cellulare o come indicato nella Tabella 2), e incuba per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripeti questo passaggio 3 volte per rimuovere tutto il PFA residuo.
  9. Dopo il lavaggio finale, aggiungere una quantità adeguata di PBS (vedi Tabella 2), sigillare la piastra con parafilm e conservare a 4 °C fino a un ulteriore utilizzo.

5. Colorazione anticorpale degli NTO

  1. La colorazione degli anticorpi è uno strumento prezioso per valutare la corretta identità degli NTO e il successo del saggio/esperimento. La colorazione con anticorpi può essere eseguita come descritto in Meinhardt et al.24 e Krammer et al.26.
    NOTA: Se gli NTO appaiono subottimali (Figura 4E-G) o non mostrano una corretta espressione dei marcatori spaziotemporali (Figura 5 a Figura 7), si scarta il materiale poiché non soddisfa gli standard di qualità.
  2. Tieni il blocco/soluzione di permeabilizzazione (1x PBS con 1% di BSA e 0,5% di Triton-X) a 4 °C e adattati alla temperatura ambiente prima dell'uso.
  3. Per una ricostituzione e analisi 3D completa, mantenere gli anticorpi (1° e 2°) a 4 °C per almeno 1, ma preferibilmente 2-3 notti, per garantire una buona penetrazione degli anticorpi.
    NOTA: L'anticorpo Alexa Fluor anti-5612nd potrebbe fornire un segnale di fondo più forte nella matrice di coltura cellulare nei primi tre giorni del saggio di differenziazione.

6. Sgombero delle NTO

  1. Prepararsi per lalibera 26
    1. Completa il processo di colorazione degli anticorpi prima di iniziare la procedura di eliminazione (assicurati che sia ilprimo che il secondo anticorpi siano incubati e completamente lavati via).
    2. Aggiungere propigallato alla soluzione di pulizia (2 mg di propilgallato per mL di soluzione di pulizia) per minimizzare lo sbiancamento fotoelettrico degli NTO.
      NOTA: Effettua la pulizia 1-2 ore prima dell'imaging per prevenire ossidazione (il liquido passa da giallo chiaro/crema a giallo scuro brillante o addirittura marrone) o la cristallizzazione della soluzione di clearing. Se avviene la cristallizzazione, si dissolve aggiungendo PBS al pozzo.
  2. Precauzioni sul pH della soluzione e miscelazione
    1. Mantenere il pH corretto della soluzione di pulizia per evitare un'ossidazione rapida o la dissoluzione della matrice di coltura cellulare.
    2. Evita agitazioni energiche o miscelazioni aggressive della soluzione per evitare la formazione di bolle d'aria.

7. Analisi degli NTO

  1. Preparazione alla microscopia
    1. Dopo aver completato la colorazione degli anticorpi e la pulizia del tessuto completo, utilizzare un microscopio confocale con obiettivi da 10 a 40x per l'imaging (imaging).
  2. Valutazione visiva
    1. Utilizzare la valutazione visiva e la quantificazione manuale per determinare in modo efficiente se gli NTO presentino un'espressione adeguata dei marcatori neurali e un'organizzazione dorsoventrale.
  3. Software di analisi 3D
    1. Per l'analisi 3D, utilizzare software come CellProfiler28,29, Imaris (File Converter and Viewer) o uno strumento simile per valutare marcatori spaziali e dettagli strutturali.
  4. Verifica dell'identità NTO
    1. Confermare l'identità corretta degli NTO valutando l'espressione temporale dei marcatori neurali e l'espressione spaziotemporale di specifici marcatori di pattern dorsoventrali. Questo passaggio è essenziale per garantire che il saggio di differenziazione abbia avuto successo prima di ulteriori ricerche.
  5. Aspetti della caratterizzazione: Consulta la Figura 4, così come la Figura 6 e la Figura 7 per verificare i seguenti aspetti critici del successo culturale:
    1. Consulta la Figura 4 e la colorazione ZO-1 mostrate in Meinhardt et al.24 per verificare epitelizzazione e formazione del lume riuscite.
    2. La differenziazione neurale di successo è caratterizzata dalla riduzione della regolazione di OCT4 e dalla regolazione all'alza di SOX1, seguita dall'espressione di β3TUBULINA (dettagliata nel24). Consulta la Figura 6 e la Figura 7 per verificare il successo della differenziazione neurale.
    3. Il pattern dorsoventrale è confermato dalla presenza di una piastra ventrale FOXA2+/SHH+ e dall'espressione PAX3+ al polo dorsale opposto (pattern ventrale dettagliato in26). Consulta la Figura 6 e la Figura 7 per verificare il successo della modellazione dorsoventrale.

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Risultati

Gli ESC R1 mouse sono stati utilizzati per tutti gli esempi rappresentativi nelle figure presentate in questo manoscritto. Altri CESC di topo menzionati possono mostrare differenze lievi nel tempismo di epitelializzazione, nella differenziazione neurale o nell'efficienza dei pattern quando vengono assegnati agli NTO, tuttavia, i risultati non dovrebbero differire significativamente dai dati qui mostrati.

Solo le ESC di buona qualità (Figur...

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Discussione

Qui, vengono presentate diverse adattamenti ottimizzativi e miglioramenti al protocollo originale per generare NTO di alta qualità per facilitare la standardizzazione tra i laboratori. Le modifiche chiave includono diverse condizioni di coltura ESC, riduzione del numero di celle di ingresso, miglioramento del mezzo di differenziazione, protocollo di differenziazione modificato e aggiustamenti della densità di semina per analisi ad alto rendimento utilizzando piastre multi-pozzo. Diversi ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Desideriamo ringraziare i membri attuali e passati del laboratorio Tanaka per il loro supporto e le discussioni nello sviluppo di questo protocollo. In particolare, ringraziamo A. Pelzl per aver letto criticamente il manoscritto, fornito contributi e aiutato con gli schemi, e E. Chatzidaki per aver letto criticamente il manoscritto, l'editing e il supporto con gli schemi, oltre a ottenere il finanziamento PUD 25 insieme a Juergen A. Knoblich. Questa pubblicazione è stata finanziata dall'Austrian Science Fund (FWF): "Progetto di pubblicazione autonoma numero PUD 25". Inoltre, questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio Europeo della Ricerca (ERC) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea (accordo di sovvenzione ERC AdG 742046), e dal Fondo Austriaco per la Scienza (FWF) [10.55776/ F7803-B] (Modulazione delle Cellule Staminali). Ai fini dell'Open Access, gli autori hanno applicato una licenza di copyright pubblico CC BY a qualsiasi versione Author Accepted Manuscript (AAM) derivante da questa sottomissione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
35 mm Dish | No. 1.5 Copertura | Diametro vetro di 14 mm | Non rivestitiMatTek CorporationCat# P35G-1.5-14-C
AccutaseInvitrogenCat# 00-4555-56
Frazione V dell'albumina (BSA) (pH 7,0)Panreac AppliChemCat# A1391
Acido Retinoico All-TransMerckCat# R2625
Integratore di B-27 (50X), senza sieroGibcoCat# 17504044
Matrice a membrana basale (Matrigel)CorningCat# BDL354234Concentrazione proteica 10 mg/ml 
Micropiastre CellCarrier-96 UltraPerkinElmerCat# 6055302
CellProfiler 4Stirling et al. 2021https://cellprofiler.org
CHIR 99021TocrisCat# 4423
CUBIC-R+(N)Matsumoto et al, 2019N/A
DimetilsolfossidoSigma AldrichCat# D2650
DMEM/F-12, nessuna glutaminaGibcoCat# 21331020
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS, 1X)GibcoCat# 14190144
Centrifuga Eppendorf 5810 REppendorfCat# 5811000015
Microtubo Eppendorf 3810XMerckCat# EP0030125150
Tubi centrifughe conici FalconCorningCat# 352095
GelatinaMerckCat# G2500
L-Glutamina (200 mM)GibcoCat# A2916801
Incubatore a CO2 HeracellVIOS 160i, 165 LThermoFisher ScientificCat# 51033557
ImarisOxford Instrumentshttps://imaris.oxinst.com
Microscopio a contrasto di fase LED invertito (CKX53)Olympus
2-Mercaptoetanolo (50 mM)GibcoCat# 31350010
Anti-OCT-3/4 monoclonale per topiSanta Cruz BiotecnologiaCat# SC-5279; RRID:AB_628051Usa 1:200
Anti-PAX3 monoclonale per mouseDSHBGatto# PAX3-C; RRID:AB_528426Usa 1:100
Anti-SHH monoclonale del coniglioTecnologie di segnalazione cellulareCatalogo #2207; RRID:AB_2188191Usa 1:300
Coniglio monoclonale anti-& beta; 3-TubulinaTecnologie di segnalazione cellulareCat# 5568; RRID:AB_10694505Usa 1:500
Anti-ZO-1 monoclonale per topiInvitrogenCatalogo #33-9100; RRID:AB_2533147Usa 1:200
Mouse LIFQkineCat# Qk018-1000
Supplemento N-2 (100X)GibcoCat# 17502048
Mezzo neurobasaleGibcoCat# 21103049
Paraformaldeide, grado reagente, cristallinoMerckCat# P6148
PD 0325901TocrisCatalogo # 4192
Soluzione penicillina-streptomicinaGibcoCat# 15140130
Microscopio a contrasto di fase
Anti-FOXA2 policlonale di capraR& DCat# AF2400; RRID:AB_2294104Usa 1:400
Anti-SOX1 di capra policlonaleR& Sistemi DCat# AF3369; RRID:AB_2239879Usa 1:200
Dati RNA-Seq relativi alla Figura 6Ishihara et al., 2022GEO: GSE214368
Armadietto di sicurezza microbiologica Premium SafeFASTGruppo Dasit PIÙ VELOCECat# F00025200000
Piruvato di sodio (100 mM)GibcoCat# 11360070
Microscopio confocale a disco rotante invertito (IX3)Olympus
Triton X-100Sigma AldrichCat# 9036-19-5

Riferimenti

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