Questo protocollo presenta un metodo accessibile per creare un ambiente a tenuta di gas per somministrare anestetici volatili a larve di pesce zebra per esperimenti comportamentali.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Somministrazione di anestetici volatili a larve di pesce zebra per l'osservazione comportamentale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo studio descrive un metodo unico per la somministrazione di anestetici volatili, come isoflurano e sevoflurano, alle larve di pesce zebra durante gli esperimenti comportamentali. Mentre il pesce zebra offre numerosi vantaggi come organismo modello di vertebrato - tra cui comportamenti complessi, trattabilità genetica, embrioni trasparenti e sviluppo rapido - il loro uso nello studio degli anestetici volatili è stato limitato. La somministrazione di anestetici volatili richiede spesso apparati complessi o ingombranti che potrebbero non essere ampiamente accessibili, creando barriere allo studio farmacologico degli anestetici volatili in organismi modello acquosi. Questo metodo presenta una tecnica semplice che utilizza fogli di silicone adesivi per creare una tenuta stagna sui piatti di vetro a 96 pozzetti. La validazione è stata eseguita attraverso la valutazione del movimento spontaneo, che non ha mostrato differenze significative tra pozzetti sigillati e aperti per un periodo di 90 minuti. Inoltre, la concentrazione di anestetico è rimasta stabile nel tempo, come misurato mediante HPLC. I risultati rappresentativi includono la determinazione sperimentale dei valori di concentrazione efficace mediana (EC50) per il sevoflurano. Questo studio fornisce un approccio semplice e accessibile per esperimenti farmacologici che utilizzano anestetici volatili, che possono essere facilmente adattati per studiare altri agenti volatili e endpoint sperimentali.
Introduzione
I modelli animali non acquatici (vermi, mosche, roditori, conigli, primati, ecc.) sono stati storicamente i modelli più comunemente utilizzati per studiare la farmacologia anestetica. In ciascuna di queste specie, gli anestetici volatili (somministrati attraverso l'inalazione di gas) sono molto meno impegnativi rispetto alla somministrazione di anestetici per via endovenosa (somministrati per via endovenosa o intraperitoneale)1. Oltre alla sfida tecnica della semplice somministrazione dei farmaci per via endovenosa, raggiungere uno stato di anestesia costante è molto più facile con gli agenti volatili che con gli agenti per via endovenosa2.
La somministrazione di anestetici per via endovenosa a specie acquatiche larvali può essere ottenuta per diffusione dal mezzo acquoso circostante 3,4, ed è quindi più simile alla somministrazione di anestetici volatili per specie non acquose. Per molti anni, i girini (Xenopus laevis) sono stati il modello di scelta per lo studio degli anestetici grazie alla facilità di somministrazione dei farmaci e alla farmacocinetica allo stato stazionario ottenuta con la semplice aggiunta dell'anestetico all'acqua del laghetto artificiale 5,6. Tuttavia, ci sono relativamente pochi esempi di studio degli anestetici volatili in questo modello a causa della necessità di apparati a tenuta di gas che sono spesso costruiti appositamente e possono essere ingombranti da usare 7,8.
Negli ultimi anni, il pesce zebra è diventato un modello preferito per lo studio degli anestetici per via endovenosa a causa della stessa facilità di somministrazione del farmaco oltre ad altri vantaggi come i loro comportamenti complessi ben descritti e la disponibilità di unità commerciali per osservare questi comportamenti9. Molti studi recenti hanno impiegato tali unità di osservazione disponibili in commercio per lo screening di composti neuroattivi, compresi gli anestetici, utilizzando formati di piastre a 96 e 24 pozzetti per quantificare il comportamento delle larve di zebrafish 4,10,11,12,13,14,15 . Gli stadi larvali sono particolarmente adatti per gli studi farmacologici grazie alla loro capacità di valutare molte risposte comportamentali, alle loro piccole dimensioni, all'elevata compatibilità con il rendimento e ai circuiti neurali ben caratterizzati 9,16,17. Tuttavia, una limitazione significativa in questi studi sugli anestetici nel modello di zebrafish è la relativa difficoltà nella somministrazione di anestetici volatili. Questa limitazione ha portato a scarsi esempi di confronto tra agenti volatili ed endovenosi 4,15,18. Essere in grado di studiare e confrontare facilmente entrambe le classi di anestetici in un unico modello animale aggiunge uno strumento importante per facilitare lo studio della farmacologia anestetica in tutte le classi.
Tradizionalmente, lo studio degli anestetici per via endovenosa in una specie acquatica ha richiesto apparecchiature specializzate, spesso personalizzate, che possono essere difficili da usare o potrebbero non essere sufficientemente a tenuta di gas per prevenire la perdita dell'anestetico per la durata dell'esperimento. La procedura qui descritta presenta un mezzo alternativo facilmente accessibile per produrre una tenuta stagna in una camera di vetro adatta per l'osservazione del comportamento larvale del pesce zebra utilizzando un'unità di osservazione commerciale (vedi Tabella dei materiali).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sul pesce zebra sono stati condotti in conformità con i protocolli di utilizzo degli animali approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). I pesci zebra adulti sono stati mantenuti presso la struttura acquatica dell'Università della Pennsylvania sotto la supervisione dell'University Laboratory Animal Resources (ULAR). I pesci zebra selvatici pinna lunga di Tubinga sono stati allevati internamente per tutti gli esperimenti e mantenuti in condizioni di allevamento standard con un ciclo luce/buio di 13/11 ore fino a raggiungere i 5 giorni dopo la fecondazione (dpf). Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando repliche biologiche, con frizioni derivate da coppie di accoppiamento distinte per garantire un'adeguata diversità biologica. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.
1. Fabbricazione di fogli adesivi in silicone
NOTA: Gli equivalenti di questo materiale (foglio di silicone più adesivo) possono essere reperiti in commercio, ma spesso con costi maggiori e minore disponibilità.
- Stendere il foglio di silicone da 0,5 mm su una superficie piana e pulita.
- Ispeziona i fogli per eventuali pieghe ed evitale quando possibile.
NOTA: I fogli di silicone con pieghe potrebbero non aderire adeguatamente al nastro e potrebbero causare una sigillatura inadeguata dei pozzetti e/o una scarsa visualizzazione del pesce zebra. - Pulisci le lenzuola con alcool al 70% per rimuovere olio o detriti e lasciarle asciugare.
- Utilizzando un applicatore, come un pennello, applicare uno strato sottile e uniforme di primer adesivo sul foglio di silicone. Per evitare un'applicazione eccessiva, lavorare in sezioni più piccole poiché il promotore adesivo si asciuga rapidamente (si fissa in 1-5 s).
NOTA: Senza questo promotore di adesione, il nastro non aderirà adeguatamente al foglio di silicone. - Una volta applicato il promotore adesivo, allineare il nastro biadesivo con il foglio di silicone con il supporto di carta rivolto verso l'alto.
- Applicare gradualmente il nastro sul silicone utilizzando un rullo per levigare la superficie e rimuovere le bolle d'aria (dopo l'applicazione iniziale, lavorare con il silicone rivolto verso l'alto aiuterà a visualizzare e rimuovere le bolle d'aria).
- Lasciare indurire completamente il promotore adesivo per 24 ore su una superficie piana.
- Tagliare il silicone adesivo in strisce larghe almeno 10 mm (diametro del pozzetto 7,5 mm più sovrapposizione su ciascun lato).
NOTA: Quando si utilizza una fila ogni due file della piastra del pozzetto, una varianza più ampia delle strisce non avrà un impatto negativo sui pozzetti nelle file adiacenti, il che potrebbe non solo facilitare l'applicazione, ma anche essere necessario per ottenere una tenuta attorno all'intera circonferenza del pozzetto.- Assicurarsi che le strisce siano sufficientemente lunghe da coprire almeno la larghezza di una fila della piastra a pozzetti.
NOTA: Se si utilizza una piastra a pozzetti che non è a 96 pozzetti, come una piastra a 24 o 48 pozzetti, le dimensioni della striscia possono essere regolate o tagliate per adattarsi alle dimensioni specifiche della piastra, garantendo una copertura adeguata indipendentemente dalle dimensioni della piastra.
- Assicurarsi che le strisce siano sufficientemente lunghe da coprire almeno la larghezza di una fila della piastra a pozzetti.
2. Preparazione delle soluzioni
NOTA: Tutte le soluzioni madre e di dosaggio di anestetici volatili sono state preparate subito prima dell'esperimento per evitare la perdita di concentrazione di composti volatili.
- Per ogni soluzione (madre o soluzione di lavoro), aggiungere un volume di solvente non volatile (acqua embrionale E3, DMSO, ecc.) a una fiala HPLC o a scintillazione che, se combinata con la diluizione finale dell'anestetico volatile, il volume totale riempirà sufficientemente la fiala lasciando uno spazio di testa minimo (vedere Figura 1A).
- Aggiungere l'anestetico volatile con una siringa a tenuta di gas Hamilton e sigillare rapidamente la fiala.
NOTA: Le soluzioni madre in fiale con coperchi a setto possono essere utilizzate per facilitare ulteriori diluizioni tramite il trasferimento della soluzione con siringhe a tenuta di gas. - Quindi, mescolare le fiale (vortice, sonicazione) secondo necessità e conservarle temporaneamente durante la preparazione dei piatti di zebrafish.
3. Impostazione dell'esperimento comportamentale
NOTA: questo passaggio del protocollo potrebbe richiedere un po' di pratica. Si consiglia di lavorare senza pesce o soluzioni contenenti materiale prezioso fino a quando non si è abituati alla tecnica.
- Trasferire una larva di zebrafish (5 dpf) in ogni altra fila della piastra di vetro a 96 pozzetti.
NOTA: Lasciare vuote le due file consente di ridurre il potenziale di contaminazione dei pozzi adiacenti da spillover, poiché i pozzetti sono sigillati nella fase 3.4. - Rimuovere con cautela la soluzione E3 da ciascun pozzetto. Questo può essere fatto una fila alla volta o su tutta la piastra se è in grado di lavorare velocemente.
NOTA: La durata per la quale le larve sono rimaste fuori dalla soluzione è stata ridotta al minimo per ridurre il potenziale stress. Procedure alternative possono essere utilizzate in base alle diverse esigenze sperimentali, inclusa la rimozione solo parziale della soluzione prima dell'aggiunta della soluzione contenente il farmaco per ridurre al minimo lo stress. Il protocollo deve essere adattato per soddisfare le esigenze dell'esperimento, compreso il tempo di equilibrio dato agli animali per compensare qualsiasi potenziale stress, l'efficienza di miscelazione della soluzione e l'accuratezza delle concentrazioni di una soluzione contenente farmaco, se non tutto l'E3 viene rimosso prima dell'aggiunta della soluzione di lavoro. - Quindi, utilizzare una pipetta di trasferimento per riempire ogni pozzetto della fila con la soluzione sperimentale. Fare attenzione a non introdurre bolle. Riempire eccessivamente ogni pozzetto (Figura 1B).
- Utilizzando le strisce adesive in silicone realizzate al punto 1, premere rapidamente la striscia verso il basso (Figura 1C). Questo aiuta a prevenire la formazione di bolle e impedisce ai pesci di traboccare nei pozzi adiacenti.
- Premere con decisione sulla parte superiore della piastra per assicurarsi che ogni pozzetto sia sigillato.
- Ripetere i passaggi da 2 a 5 fino a quando la soluzione non viene sostituita e i pozzetti per ogni altra fila della piastra del pozzetto sono sigillati (Figura 1D).
- Capovolgere delicatamente la piastra e verificare la presenza di bolle d'aria.
NOTA: La presenza di bolle d'aria oscurerà la visualizzazione del movimento del pesce zebra. - Posizionare la piastra nell'unità di osservazione del comportamento (lato adesivo siliconico rivolto verso il basso) ed eseguire l'esperimento comportamentale (vedere la sezione Risultati per i dettagli).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Confronto con l'osservazione tradizionale a pozzo aperto
Al fine di valutare se la sigillatura adesiva ha un effetto sul movimento spontaneo, è stato effettuato un confronto tra i controlli nei pozzetti aperti e quelli sigillati. Come si vede nella Figura 2A, non è stata osservata alcuna differenza statisticamente significativa nel movimento tra questi gruppi per la durata standard di ~30 minuti utilizzata negli esperimenti descritti in questo articolo. Riconoscendo che a...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo articolo descrive un metodo per somministrare prontamente anestetici volatili, come il sevoflurano, alle larve di pesce zebra, che è stato utilizzato per quantificare la potenza dell'anestetico volatile nei pesci selvatici. Sebbene questa tecnica sia concettualmente semplice, può essere necessaria la pratica per garantire una fila di pozzetti adeguatamente sigillata e priva di bolle in un breve lasso di tempo per ridurre al minimo la perdita di agenti volatili. Poiché questo metod...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Foundation for Anesthesia Education and Research (FAER). La Figura 1 viene creata in BioRender.com.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Micropiastre in vetro a 96 pozzetti | Zinsser Nord America | 3600500 | "Queste micropiastre di vetro sono realizzate in speciale vetro borosilicato ad alta purezza e resistente alla temperatura e le superfici sono lucidate con acido. Le piastre sono rettangolari con l'ingombro standard della micropiastra SBS (85 x 127 mm). Queste micropiastre per reattori in vetro sono progettate principalmente per l'uso con applicazioni chimiche e sono resistenti a temperature fino a 530 gradi C. Possono essere sterilizzati in autoclave. Sono lavorati da una lastra di vetro omogenea e presentano una geometria e una forma uniformi per fornire temperature costanti da un pozzetto all'altro (entro 0,2 gradi C tipici)". |
| 2,0 mL trasparente, ampia apertura, fiale con filettatura da 9 mm | Chemglass Scienze della Vita | CV-1150-1232 | "Con un'apertura più grande del 40%, queste fiale sono progettate specificamente per funzionare nei campionatori automatici a braccio robotico. Incorporano anche l'esclusivo design della fiala Step che centra con precisione un inserto di volume limitato nel collo della fiala. " |
| Nastro biadesivo 3M 9490LE | AbbVie Inc | 24WG90 | "Il nastro biadesivo 3M 9490LE con adesivo di laminazione 3M 300LSE offre un'elevata forza di adesione alla maggior parte delle superfici, comprese molte plastiche a bassa energia superficiale come il polipropilene e le vernici verniciate a polvere. L'adesivo acrilico fornisce anche un'eccellente adesione alle superfici leggermente contaminate dall'olio tipicamente utilizzato con le parti delle macchine. Il nastro biadesivo 3M 9490LE offre la funzione aggiuntiva dell'adesivo di laminazione 3M 300MP su un lato per fornire un'eccellente forza di adesione a una varietà di materiali in schiuma e tessuto (6 pollici x 5 yd)" |
| Camera di osservazione DanioVision | Noldus | DVOC-0041 | "DanioVision è un sistema completo, progettato per l'analisi ad alta produttività di larve di pesce zebra in piastre multipozzetto. Include la camera di osservazione e il rinomato software di tracciamento video EthoVision XT. |
| Unità di controllo della temperatura DanioVision | Noldus | DVTCU-0011 | "L'unità di controllo della temperatura DanioVision è un sistema a flusso continuo: l'acqua scorre uniformemente sotto la piastra del pozzetto alla temperatura desiderata. La temperatura è la stessa in tutta la piastra del pozzetto". |
| Software Ethovision XT16 | Noldus | NSE-EV-BASE | "EthoVision XT è il software di tracciamento video più utilizzato che traccia e analizza il comportamento, il movimento e l'attività di qualsiasi animale, marchio registrato da Noldus" |
| Isoflurano | Piramal Terapia Intensiva | NDC # 66794-017-10 | Liquido per inalazione, un anestetico per inalazione non infiammabile e non esplosivo, contenente 100 ml di isoflurano. Conservato a temperatura ambiente controllata 20º a 25º C |
| Primer adesivo istantaneo Scotch-Weld AC79 Trasparente | 3M | "62-3916-0860-1 (ID prodotto) C2103N (Lotto)" | "Il primer adesivo istantaneo 3M Scotch-Weld AC79 è progettato per l'uso su elastomeri a bassa energia superficiale difficili da incollare, come EPDM, silicone e altre gomme. La preparazione e l'applicazione della superficie sono semplici e il primer adesivo si asciuga rapidamente per mantenere i lavori in rapido movimento". |
| Fogli di silicone spessore 0,5 mm | Fornitori vari | N/A | I fogli di silicone traslucido sono stati acquistati da più fornitori |
| Speedball Pop-in Brayer in gomma dura con telaio in plastica, 4 pollici " | Speedball | 793728 | "Il brayer Speedball Pop-In Hard Brayer è dotato di un rullo che si stacca a scatto per una facile pulizia. Telaio in plastica in un unico pezzo con rullo staccabile largo 4 pollici. Realizzato in pura gomma naturale con finitura rettificata. Il braciere in gomma dura è largo 4 pollici con un robusto telaio in plastica ed è ottimo per l'applicazione della colla" |
| Tappi a vite SureSTART da 9 mm, livello 2 Applicazioni ad alta produttività, Tipo: Tappo a vite AVCS PP nero, silicone bianco/PTFE ROSSO Septa 1,0 mm | Termo Scientifico | 6ASC9ST1B | "Utilizzare i tappi a vite Thermo Scientific SureSTART da 9 mm con fiale a vite con un'apertura di 9 mm. I tappi di livello 2 sono prodotti e testati per garantire un basso sanguinamento, robustezza e riproducibilità dei risultati per le analisi GC-MS e LC-MS di routine. È possibile scegliere tra cappucci in polipropilene con setti multiuso in silicone/PTFE di vari valori di durezza, progettati per ridurre i problemi dell'ago dell'autocampionatore. I nostri tappi AVCS incorporano la tecnologia Advanced Vial Closure System per garantire una compressione ottimale della tenuta durante la chiusura di una fiala". |
| Ultane Sevoflurano | AbbVie Inc | NDC # 0074-4456-04 | Volatile Liquid for Inhalation, è confezionato in flaconi di colore ambrato contenenti 250 mL di sevoflurano. Conservato a temperatura ambiente controllata 15º a 30º C |
| Fiale a scintillazione liquida Wheaton, tappi attaccati alle fiale, vetro, lamina / polpa di metallo, 24-400, 20 mL | DWK Scienze della vita | 986561 | Fiale di scintillazione da 20 mL convertite da tubi in vetro borosilicato di Tipo I, PET o HDPE. Disponibile con tappo attaccato. |
Riferimenti
- Wasilczuk, A. Z., Maier, K. L., Kelz, M. B. The mouse as a model organism for assessing anesthetic sensitivity. Methods Enzymol. 602, 211-228 (2018).
- Shortal, B. P., et al. Development and validation of brain target-controlled infusion of propofol in mice. PLoS One. 13, 1-14 (2018).
- Halbach, K., et al. Yolk sac of zebrafish embryos as backpack for chemicals. Environ Sci Technol. 54 (16), 10159-10169 (2020).
- Bedell, V. M., Meng, Q. C., Pack, M. A., Eckenhoff, R. G. A vertebrate model to reveal neural substrates underlying the transitions between conscious and unconscious states. Sci Rep. 10, 1-10 (2020).
- Stetter, M. D., et al. Isoflurane anesthesia in amphibians: Comparison of five application methods. In American Association of Zoo Veterinarians. , Puerto Vallarta, Mexico. 255-257 (1996).
- Woll, K. A., Eckenhoff, R. G. High-throughput screening to identify anesthetic ligands using Xenopus laevis tadpoles. Methods Enzymol. 602, 177-187 (2018).
- Meyer, H. Zur Theorie der Alkoholnarkose. Arch Exp Pathol Pharmakol. 46, 338-346 (1901).
- Downes, H., Courogen, P. M. Contrasting effects of anesthetics in tadpole bioassays. J Pharmacol Exp Ther. 278, 284-296 (1996).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10, 70-86 (2013).
- Abramova, V., et al. Effects of pregnanolone glutamate and its metabolites on GABAA and NMDA receptors and zebrafish behavior. ACS Chem Neurosci. 14, 1870-1883 (2023).
- Germann, A. L., et al. Comparison of behavioral effects of GABAergic low-and high-efficacy neuroactive steroids in the zebrafish larvae assay. ACS Chem Neurosci. 15, 909-915 (2024).
- Hoyt, H., et al. Photomotor responses in zebrafish and electrophysiology reveal varying interactions of anesthetics targeting distinct sites on gamma-aminobutyric acid type A receptors. Anesthesiology. 137, 568(2022).
- Li, F., et al. Characterization of the locomotor activities of zebrafish larvae under the influence of various neuroactive drugs. Annals Trans Med. 6, 173(2018).
- McCarroll, M. N., Gendelev, L., Kinser, R. Zebrafish behavioural profiling identifies GABA and serotonin receptor ligands related to sedation and paradoxical excitation. Nat Commun. 10, 4078(2019).
- Plasencia, D. M., Rodgers, L. H., Knighton, A. R., Eckenhoff, R. G., White, E. R. Antagonism of propofol anesthesia by alkyl-fluorobenzene derivatives. Sci Rep. 14, 15943(2024).
- Dash, S. N., Lipika, P. Flight for fish in drug discovery: A review of zebrafish-based screening of molecules. Biology Lett. 19, 20220541(2023).
- Nelson, J. C., Michael, G. Zebrafish behavior as a gateway to nervous system assembly and plasticity. Development. 149, 177998(2022).
- Zhang, L., et al. Sevoflurane postconditioning ameliorates cerebral hypoxia/reoxygenation injury in zebrafish involving the Akt/GSK-3β pathway activation and the microtubule-associated protein 2 promotion. Biomed Pharmacother. 175, 116693(2024).
- Abdallah, S. J., Thomas, B. S., Jonz, M. G. Aquatic surface respiration and swimming behaviour in adult and developing zebrafish exposed to hypoxia. J Exp Biol. 218, 1777-1786 (2015).
- Targ, A. G., Yasuda, N., Eger, E. I. Solubility of I-653, sevoflurane, isoflurane, and halothane in plastics and rubber composing a conventional anesthetic circuit. Anesth Analg. 69, 218-225 (1989).
- Yang, X., et al. Drug-selective Anesthetic insensitivity of zebrafish lacking γ-aminobutyric acid Type A receptor β3 subunits. Anesthesiology. 131, 1276-1291 (2019).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
