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Articolo metodologico

Saggio del biofilm per Clostridioides difficile con applicazioni per la scoperta di farmaci

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DOI:

10.3791/67913

⸱

8 luglio 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology and The South Texas Center for Emerging Infectious Diseases (STCEID), The University of Texas at San Antonio

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I biofilm del patogeno batterico Clostridioides difficile e il loro significato nella malattia non sono ben compresi. Recenti scoperte hanno suggerito un ruolo nella recidiva, sottolineandone l'importanza. Qui, descriviamo l'adattamento di un saggio di biofilm accoppiato a una lettura metabolica con applicazioni per la scoperta di farmaci contro i biofilm.

Abstract

Il Clostridioides difficile è un patogeno batterico gastrointestinale in grado di sfruttare un ambiente disbiotico del microbiota per proliferare, secernere tossine e danneggiare l'epitelio intestinale. Un sottogruppo di pazienti con infezione da C. difficile (CDI) sperimenterà il fallimento del trattamento con antibiotici (15%-30%) o trapianto di microbiota fecale (FMT) (<10%). Pertanto, lo sviluppo di ulteriori interventi terapeutici è di fondamentale importanza. Il ruolo dei biofilm di C. difficile nella recidiva non è chiaro. Tuttavia, i biofilm in altri organismi sono responsabili della malattia cronica e recidivante, suggerendo che questo potrebbe essere anche il caso della CDI ricorrente. Ipotizziamo che i biofilm di C. difficile rappresentino un prezioso bersaglio terapeutico. L'obiettivo del protocollo qui presentato è quello di adattare un saggio di formazione di biofilm per l'identificazione di composti riposizionabili con attività contro biofilm di C. difficile stabiliti. Il protocollo perfeziona un test robusto e riproducibile per la formazione di biofilm, lo accoppia a un test metabolico e lo applica alla scoperta di farmaci. Questo protocollo delinea il saggio di formazione del biofilm, le letture della biomassa e dell'attività metabolica, i test di suscettibilità ai farmaci, lo screening farmacologico di una libreria di riposizionamento e i risultati rappresentativi.

Introduzione

Il Clostridioides difficile è un patogeno batterico anaerobio sporigeno in grado di infliggere gravi danni al tratto gastrointestinale umano (GI) producendo tossine. C. difficile è responsabile di quasi mezzo milione di casi all'anno, con ~30.000 decessi (CDC, 2015). Il trattamento dell'infezione da C. difficile (CDI) aggiunge un costo significativo al sistema sanitario già sotto pressione (~4,8 miliardi di dollari)1,2,3. Gli individui più a rischio sono quelli con immunosoppressione, esposizione agli antibiotici e/o anziani, tutte popolazioni che continuano ad espandersi in modo significativo sia negli Stati Uniti che in tutto il mondo 4,5,6,7.

C. difficile dipende fortemente dallo stato del microbiota gastrointestinale dell'ospite e, come tale, il trattamento antibiotico è un fattore predisponente chiave per la CDI. L'identificazione di isolati clinici resistenti agli antibiotici di C. difficile complica ulteriormente il trattamento 8,9,10. Inoltre, tra il 15% e il 30% dei pazienti trattati con antibiotici per CDI fallirà il trattamento iniziale 5,11,12,13,14,15,16. Una volta che un paziente sperimenta un episodio di recidiva, la probabilità di episodi di recidiva aumenta al 45%-64% (scala mobile di recidiva) ed è accompagnata da un aumento del rischio di ulteriori fallimenti del trattamento16,17. È importante sottolineare che la maggior parte dei casi di recidiva di CDI sono causati dal ceppo originale che ha stabilito il primo episodio di infezione nell'ospite 18,19, suggerendo una continua colonizzazione da parte di C. difficile anche dopo un trattamento di successo. Mentre è stato dimostrato che le spore persistono nel tratto gastrointestinale e portano a recidive in modelli ex vivo e murini20, i biofilm di C. difficile e il loro ruolo nella malattia e nella recidiva sono poco esplorati. I biofilm sono comunità microbiche protette da una matrice extracellulare autoprodotta, caratteristica che li rende altamente recalcitranti agli insulti ambientali come il trattamento antibiotico e le risposte immunitarie21. Inoltre, la formazione di biofilm è un fattore di virulenza significativo 22,23,24,25 e nelle infezioni batteriche, come quelle causate da Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, i biofilm sono fondamentali nelle recidive e nelle manifestazioni croniche26,27. Recentemente, i biofilm di C. difficile sono stati proposti come serbatoio per infezioni ricorrenti 28,29,30 e rappresentano quindi un bersaglio di alto valore per il trattamento e/o la prevenzione della recidiva di CDI.

I modelli attuali per studiare i biofilm di C. difficile includono i modelli di biofilm di colonia31,32, i microfermentatori33, i modelli di intestino chemostatico34,35 e i sistemi di coltura liquida che utilizzano fiasche o piastre a pozzetti36,37. Tutti questi modelli hanno fornito informazioni chiave sui biofilm di C. difficile in diversi stadi di sviluppo e in ambienti distinti. Tuttavia, alcuni di questi modelli (ad esempio, microfermentatori, modelli intestinali di chemostato, biofilm di colonie) non sono adatti per gli sforzi di scoperta di farmaci. Ad oggi, la maggior parte degli studi che coinvolgono gli sforzi di scoperta di farmaci si sono concentrati sullo stile di vita planctonico di C. difficile 38,39,40,41. Pertanto, il protocollo qui descritto mira ad adattare, standardizzare e convalidare l'attuale modello di biofilm su piastra a 96 pozzetti con l'obiettivo di sviluppare una piattaforma per librerie di screening per identificare molecole riposizionabili con la capacità di uccidere i biofilm di C. difficile stabiliti (24 ore fa). La convalida del protocollo è stata eseguita confrontando le capacità di formazione di biofilm tra un ceppo adattato in laboratorio (630 Δerm) e un isolato clinico epidemico (ceppo UK1 isolato durante un'epidemia del 2006 presso lo Stoke-Mandeville Hospital nel Regno Unito42). La formazione del biofilm è stata quantificata utilizzando il classico saggio Crystal violet per misurare la biomassa e un test metabolico per misurare la vitalità dei biofilm. Sono state identificate differenze significative nelle capacità di formazione del biofilm tra i ceppi, suggerendo potenziali implicazioni cliniche. Inoltre, il test è stato utilizzato per determinare i profili di suscettibilità agli antibiotici di biofilm stabiliti. Infine, come prova di concetto, è stata esaminata la Global Health Priority box di Medicines for Malaria Venture (MMV), un'organizzazione senza scopo di lucro focalizzata sulla scoperta di nuove terapie contro malattie trascurate come la malaria, per identificare i composti con attività contro i biofilm consolidati di C. difficile. Il protocollo qui descritto adatta e convalida un classico saggio del biofilm per l'uso come piattaforma di screening farmacologico mirato ai biofilm maturi.

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Protocollo

1. Preparazione delle cellule per il saggio del biofilm

ATTENZIONE: Clostridioides difficile è un patogeno umano e richiede il contenimento di BSL-2.

NOTA: Le spore utilizzate per questo studio sono state acquisite dalla dottoressa Carol Kumamoto presso la Tufts University School of Medicine. Gli stock di spore di C. difficile sono stati preparati come descritto in precedenza 43,44,45. Le spore vengono quindi aliquotate come volumi di 10 μl in provette PCR per la striatura delle piastre. Tutti i terreni e la soluzione salina tampone fosfato (PBS) necessari per l'esperimento devono essere pre-ridotti nella camera anaerobica 24 ore prima dell'uso. Ciò si ottiene allentando il tappo del flacone contenente il terreno o il PBS all'interno della camera.

  1. Pre-ridurre una piastra di agar Brain Heart Infusion integrata con taurocolato allo 0,1% (p/v) e L-cisteina allo 0,1% (p/v) (BHIS) nella camera anaerobica, preferibilmente durante la notte o per almeno 3 ore per consentire una riduzione completa. Impostare la temperatura della camera anaerobica a 37 °C.
  2. Riscaldare la provetta per PCR contenente 10 μl di spore per 20 minuti a 70 °C. Questo può essere fatto a bagnomaria o in un termociclatore.
  3. Portare le spore nella camera anaerobica, mescolare pipettando delicatamente 5x-6x e pipettare 10 μl sulla piastra BHIS pre-ridotta. Eseguire una striscia di quattro quadranti come descritto in precedenza46 e incubare la piastra per una notte a 37 °C (temperatura della camera anaerobica).
  4. Dopo 24 ore di crescita, le colonie isolate dovrebbero essere visibili. Selezionare una singola colonia e, utilizzando un ansa monouso, trasferirla in una provetta contenente 10 ml di liquido BHIS. Incubare per una notte (14-18 h).
  5. Determinare la densità cellulare diluendo in serie la coltura notturna nella camera.
    1. Eseguire diluizioni di 10 volte della coltura notturna. La diluizione 103 produce un campione numerabile per ciascuno dei ceppi utilizzati in questo protocollo. Tuttavia, la standardizzazione di questo passaggio potrebbe essere necessaria per gli isolati clinici con differenze di crescita.
    2. Estrarre le provette dalla camera anaerobica, posizionare 10 μl di ciascun campione in un emocitometro e contare utilizzando un microscopio a campo chiaro come descritto dal produttore dell'emocitometro.
    3. Seguire le istruzioni del produttore per determinare la concentrazione delle cellule dopo il conteggio.

2. Formazione del biofilm

NOTA: Sebbene questo protocollo sia adattabile a pozzetti di dimensioni diverse, è stato ottimizzato per la piattaforma a 96 pozzetti. Se la dimensione del pozzetto viene modificata, la concentrazione della cella dovrà essere regolata in base alla superficie del pozzetto.

  1. Dopo aver determinato la concentrazione cellulare dalla coltura notturna, regolare la concentrazione cellulare a 1 x 107 cellule/mL in BHIS (integrato con L-cisteina al 10% (p/v) e glucosio 0,1M).
    NOTA: L'integrazione di glucosio 0,1M ha precedentemente dimostrato di aumentare la formazione di biofilm da parte del C . difficile 630 Δerm ceppo47. Per questo protocollo, la concentrazione di 1 x 107 cellule/mL è stata selezionata dopo aver testato concentrazioni iniziali distinte (Figura 1). La formazione di biofilm robusti può ancora essere ottenuta senza l'integrazione di glucosio.
  2. Erogare 100 μl di cellule nei pozzetti di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti (fondo piatto e coltura tissutale trattata), lasciando colonne di controllo (solo cellule) e vuote (solo terreni). Incubare per 24 ore in camera anaerobica (37 °C).
    1. Se l'evaporazione del fluido diventa un problema, posizionare le piastre di biofilm lontano da qualsiasi unità di riscaldamento. In alternativa, posizionare i biofilm all'interno di un contenitore aggiuntivo o coprire con membrane permeabili a piastre a 96 pozzetti.
  3. Rimuovere delicatamente il supporto da tutti i pozzetti, iniziando dal grezzo. Questo rimuoverà le cellule non aderenti e lascerà dietro di sé un biofilm. Questo passaggio è fondamentale in quanto solo le cellule all'interno del biofilm sono di interesse.
  4. Lavare delicatamente i biofilm 2 volte con 200 μL di PBS preridotto. Per eseguire questo lavaggio delicatamente, inclinare leggermente la piastra a 96 pozzetti, inserire i puntali della pipetta contro la parete del pozzetto, far scorrere i puntali vicino al fondo del pozzetto senza raschiare il fondo e aspirare lentamente. Se PBS viene lasciato in fondo, ripetere nuovamente il processo. In questa fase, le cellule non aderenti possono essere rimosse ed è normale. Rimuovere il PBS prima di estrarre la piastra dalla camera anaerobica.
  5. A questo punto, utilizzare i biofilm per: Misure di biomassa (Vedi Step 3); misure dell'attività metabolica (Vedi Step 4); test di suscettibilità ai farmaci e screening dei farmaci (vedere la fase 5).
    NOTA: Questo protocollo è stato convalidato per il ceppo 630 Δerm adattato in laboratorio e per il ceppo epidemico UK1. Isolati e ceppi clinici distinti potrebbero mostrare deboli capacità di formazione di biofilm. Per ridurre al minimo l'interruzione del biofilm, lavare con PBS 1x invece di 2x e ridurre il volume di lavaggio a 100 μl.

3. Misura della biomassa del biofilm mediante il saggio Crystal violet

NOTA: La colorazione con cristallovioletto si basava su un protocollo48 precedentemente descritto.

  1. Dopo aver lavato i biofilm nella camera anaerobica (vedi passaggio 2.4), rimuovere la piastra e trasferirla in una cappa chimica.
  2. Per fissare i biofilm, aggiungere delicatamente 150 μL di metanolo a ciascun pozzetto. Coprire il piatto con il coperchio per 10 minuti.
  3. Rimuovere il metanolo e lasciare asciugare completamente i pozzetti con il coperchio rimosso. Questo dovrebbe richiedere tra i 30 minuti e i 45 minuti.
  4. Aggiungere 100 μl di cristallovioletto allo 0,3% a tutti i pozzetti e colorare per 10 minuti. Rimuovere accuratamente il cristallovioletto per evitare di macchiare il bordo del pozzetto e le pareti, poiché ciò può influire sulla lettura.
  5. Lasciare asciugare il piatto senza il coperchio. Questo dovrebbe richiedere tra i 30 e i 45 minuti.
  6. Lavare i pozzetti 3 volte con 200 μL di acqua distillata e lasciare asciugare completamente la piastra. Questo dovrebbe richiedere dai 30 ai 45 minuti.
  7. Una volta asciutti, utilizzare un microscopio a campo chiaro per visualizzare i biofilm (Figura 2A). Sebbene questo passaggio sia facoltativo, consente un'osservazione più approfondita delle cellule nel biofilm.
    1. Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un microscopio a campo chiaro invertito con un adattatore per piastre. Identificare pozzetti rappresentativi per ogni ceppo testato.
    2. Scatta immagini per ogni pozzetto all'ingrandimento desiderato. Le immagini presentate in questo protocollo sono state scattate con un ingrandimento di 40x.
  8. Una volta acquisite le immagini desiderate, trasferire nuovamente la lastra in una cappa chimica per la decolorazione.
  9. Per decolorare il biofilm, aggiungere 150 μL di acido acetico al 33% e porre su uno shaker a velocità media per 10 minuti.
  10. Rimuovere 90 μl da ciascun pozzetto e trasferirlo in una nuova piastra a fondo piatto da 96 pozzetti. Leggere l'assorbanza a 595 nm utilizzando un lettore di piastre (Figura 2B).

4. Misurazione della vitalità del biofilm con il colorante metabolico PrestoBlue

  1. Eseguire la misurazione dell'attività metabolica seguendo il protocollo del produttore per il test con le modifiche chiave. Riscaldare il lettore di piastre a 37 °C prima di preparare i biofilm per il saggio. Si consiglia un lettore di piastre in grado di misurare la fluorescenza.
    NOTA: In alternativa, l'attività metabolica può essere letta a OD600; Tuttavia, non abbiamo riscontrato che questo approccio sia sufficientemente sensibile per questi saggi. Si consiglia agli utenti di rivedere il protocollo del produttore e di standardizzarlo se necessario.
  2. Dopo aver lavato i biofilm con PBS nella camera anaerobica come descritto sopra (vedere il passaggio 2.4), rimuovere la piastra dalla camera.
  3. Insieme alla piastra, rimuovere 9 ml di BHIS pre-ridotto (integrato con il 10% (p/v) di L-cisteina e 0,1 M di glucosio).
  4. Aggiungere rapidamente 1 mL di reagente PrestoBlue a 9 mL di BHIS pre-ridotto e vortex. Non pre-ridurre il reagente in quanto ciò può influire sulla colorazione del reagente (vedere la discussione).
  5. Aggiungere 100 μl di miscela BHIS-PrestoBlue a ciascun pozzetto. Posizionare la piastra in un lettore di piastre con le seguenti impostazioni: Temperatura a 37 °C, tipo di saggio come Kinetic; tempo di lettura come 30 min; frequenza di lettura ogni 2 minuti; intensità di fluorescenza a seconda del tipo di lettore di piastre disponibile. Le misure descritte in questo protocollo sono state eseguite utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 560 nm/ 590 nm, rispettivamente.
  6. Dopo la lettura, scartare le tavole.
  7. Una volta acquisiti i valori di fluorescenza dalle letture delle piastre, utilizzare pozzetti vuoti (solo terreni) per sottrarre il rumore da tutti i pozzetti del campione. Successivamente, dividere i pozzetti del biofilm trattati con ciascun composto dal pozzetto di controllo contenente un biofilm non trattato (100%) per ottenere l'attività metabolica.

5. Aggiunta di farmaci ai biofilm

NOTA: La configurazione descritta di seguito può essere modificata per i test di suscettibilità ai farmaci e lo screening dei farmaci a concentrazione fissa. Per entrambi i metodi descritti di seguito, si consiglia il test PrestoBlue.

  1. Determinazione delle concentrazioni minime inibitorie (MIC) di antibiotici distinti
    NOTA: I biofilm vengono gestiti per un periodo di 48 ore, aumentando la possibilità di contaminazione. È di grande importanza trattare prima i pozzetti in bianco e seguire le procedure asettiche. I valori di MIC riportati in letteratura per altri ceppi di C. difficile e i saggi di risposta alla dose di prova sono stati utilizzati per informare le concentrazioni iniziali di antibiotico per i saggi MIC presentati in questo protocollo. Questo approccio sarà utile per determinare le concentrazioni iniziali di antibiotici quando si lavora con isolati clinici.
    1. Lavare i biofilm maturi (24 ore) con PBS nella camera anaerobica come descritto sopra (vedere il passaggio 2.4).
    2. Aggiungere 200 μl di terreno BHIS pre-ridotto (integrato con L-cisteina al 10% (p/v) e glucosio 0,1 M) contenente due diluizioni dell'antibiotico in esame a ciascun pozzetto, ad eccezione delle colonne di controllo (solo cellule) e vuote (solo terreni) nella piastra.
    3. Incubare per altre 24 ore. In questo studio, per convalidare il test sono stati utilizzati vancomicina (concentrazione iniziale di 200 μg/mL), metronidazolo (concentrazione iniziale di 16 μg/mL) e fidaxomicina (concentrazione iniziale di 4 μg/mL). I valori di MIC sono riportati nella Tabella 1.
    4. Per evitare l'essiccazione delle piastre, tenere lontano dall'unità di riscaldamento nella camera anerobica o utilizzare una membrana permeabile ai gas.
      NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un PBS pre-ridotto o un fossato di terreno (300 μL) sui pozzetti esterni della piastra.
    5. Dopo 24 ore di incubazione con i farmaci, rimuovere il terreno e lavare delicatamente i biofilm 1 volta con PBS. Processare i biofilm utilizzando il saggio Crystal violet o il saggio PrestoBlue.
  2. Screening delle librerie di farmaci
    1. Lavare i biofilm maturi (24 ore) con PBS nella camera anaerobica come descritto sopra (vedere il passaggio 2.4).
    2. Aggiungere 200 μL di terreno contenente una concentrazione fissa di composti della libreria di farmaci a ciascun pozzetto, ad eccezione delle colonne di controllo (cellule in terreno senza antibiotici) e vuote (terreno senza antibiotici) nella piastra. Incubare per altre 24 ore. Per evitare l'essiccazione delle piastre, tenerle lontane dall'unità di riscaldamento nella camera anerobica.
    3. Dopo 24 ore di incubazione con i farmaci, rimuovere il terreno e lavare delicatamente i biofilm 1 volta con PBS. Processare i biofilm utilizzando il saggio Crystal violet o il test metabolico.

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Risultati

Lo scopo del protocollo sopra descritto è quello di adattare e validare il modello di formazione di biofilm su piastra a 96 pozzetti come piattaforma di screening farmacologico per l'identificazione di composti riposizionabili con attività contro biofilm stabiliti di C. difficile. È stato determinato l'impatto di densità cellulari distinte (10,4, 10,5, 10,6 e 10,7 cellule/mL) sulla formazione del biofilm e la formazione del biofilm è st...

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Discussione

La formazione del biofilm di C. difficile e il ruolo che svolge nella malattia non sono ben compresi. Recenti scoperte suggeriscono un ruolo dei biofilm nella recidiva della malattia 28,34. La formazione di biofilm è un fattore di virulenza significativo 22,23,24,25 e nelle infezioni batteriche,

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Ringraziamenti

J.A.R. ha progettato lo studio e il protocollo e ha scritto il manoscritto. A.S. e P.Z. hanno condotto gli esperimenti e hanno contribuito a perfezionare il protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi di avviamento dell'Università del Texas a San Antonio (UTSA) a J.A.R., e A.S. è stato supportato dal programma UTSA MARC (T34GM145507). Gli autori ringraziano Medicines for Malaria Venture (MMV, Svizzera) per aver fornito la libreria Global Health Priority Box.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ACIDO ACETICO SAF-CT ACS 500MLFisher ScientificA38S500
AGAR BATTERIOLOGICO GR 1KGFisher ScientificAC443570010
BioTek Synergy H1 lettore di piastreFisher ScientificBTH1MG
FLACONE ESTRATTO DI LIEVITO 500GFisher ScientificDF0127179
BRODO PER INFUSIONE CUORE FisherScientific
Crystal Violet USP grado 100GVWR97061-850Per la colorazione di biofilm per saggi di biomassa
Piastra TC a 96 pozzetti CytoOne, fondo piatto, trasparente, indiv.wrapped withlids, 50/caseUSA ScientificCC7682-7596
D-(+)-Glucosio, anidroFisher Scientific50712744
Dimetil solfossido per biologia molecolare (DMSO)Millipore SigmaD8418-250ML
FIDAXOMICIN 250MGFisher ScientificAC468312500
L-CISTEINA 98+% 1KGFisher Scientific AAA104350BPer terreni C. difficile
METANOLO 99,8 ACROSEAL 1LTFisher ScientificAC364390010
METRONIDAZOLO, 99% 5GRFisher ScientificAC210340050
Soluzione salina tampone fosfato (PBS) 10XFisher ScientificBP3991
Reagente per la vitalità cellulare PrestoBlueFisher ScientificA13262
SILVERSEAL OPAQUE ADHES 100/CSFisher Scientific7000379Utilizzato per sigillare le piastre dei farmaci madre e figlia prima della conservazione
TAUROCOLATO DI SODIO 100MG VWR100291-598
VANCOMICINAFisher ScientificBP29581
CM1135R

Riferimenti

  1. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S88-S92 (2012).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  3. Sheitoyan-Pesant, C., et al. Clinical and healthcare burden of multiple recurrences of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 62 (5), 574-580 (2016).
  4. Abou Chakra, C. N., Pepin, J., Sirard, S., Valiquette, L. Risk factors for recurrence, complications and mortality in Clostridium difficile infection: A systematic review. PLoS One. 9 (6), e98400(2014).
  5. Aslam, S., Hamill, R. J., Musher, D. M. Treatment of Clostridium difficile-associated disease: Old therapies and new strategies. Lancet Infect Dis. 5 (9), 549-557 (2005).
  6. Brown, K. A., Khanafer, N., Daneman, N., Fisman, D. N. Meta-analysis of antibiotics and the risk of community-associated Clostridium difficile infection. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2326-2332 (2013).
  7. Dicks, L. M. T., Mikkelsen, L. S., Brandsborg, E., Marcotte, H. Clostridium difficile, the difficult "kloster" fuelled by antibiotics. Curr Microbiol. 76 (6), 774-782 (2019).
  8. Sholeh, M., et al. Antimicrobial resistance in Clostridioides (Clostridium) difficile derived from humans: A systematic review and meta-analysis. Antimicrob Resist Infect Control. 9 (1), 158(2020).
  9. Peng, Z., et al. Update on antimicrobial resistance in Clostridium difficile: Resistance mechanisms and antimicrobial susceptibility testing. J Clin Microbiol. 55 (7), 1998-2008 (2017).
  10. Dilnessa, T., Getaneh, A., Hailu, W., Moges, F., Gelaw, B. Prevalence and antimicrobial resistance pattern of Clostridium difficile among hospitalized diarrheal patients: A systematic review and meta-analysis. PLoS One. 17 (1), e0262597(2022).
  11. Hopkins, R. J., Wilson, R. B. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis: A narrative review. Gastroenterol Rep (Oxf). 6 (1), 21-28 (2018).
  12. Bartlett, J. G. Treatment of antibiotic-associated pseudomembranous colitis. Rev Infect Dis. 6 (Suppl 1), S235-S241 (1984).
  13. Merino, E., Salavert, M. Treatment of Clostridioides difficile infection: From guidelines to clinical practice. Rev Esp Quimioter. 35 (Suppl 3), 97-101 (2022).
  14. Pepin, J., et al. Increasing risk of relapse after treatment of Clostridium difficile colitis in Quebec, Canada. Clin Infect Dis. 40 (11), 1591-1597 (2005).
  15. Cornely, O. A., Miller, M. A., Louie, T. J., Crook, D. W., Gorbach, S. L. Treatment of first recurrence of Clostridium difficile infection: Fidaxomicin versus vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S154-S161 (2012).
  16. Mcfarland, L. V., Elmer, G. W., Surawicz, C. M. Breaking the cycle: Treatment strategies for 163 cases of recurrent Clostridium difficile disease. Am J Gastroenterol. 97 (7), 1769-1775 (2002).
  17. Mcfarland, L. V., et al. A randomized placebo-controlled trial of Saccharomyces boulardii in combination with standard antibiotics for Clostridium difficile disease. JAMA. 271 (24), 1913-1918 (1994).
  18. Kamboj, M., et al. Relapse versus reinfection: Surveillance of Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 53 (10), 1003-1006 (2011).
  19. Figueroa, I., et al. Relapse versus reinfection: Recurrent Clostridium difficile infection following treatment with fidaxomicin or vancomycin. Clin Infect Dis. 55 (Suppl 2), S104-S109 (2012).
  20. Castro-Cordova, P., et al. Entry of spores into intestinal epithelial cells contributes to recurrence of Clostridioides difficile infection (vol 12, 1140, 2021). Nat Commu. 13 (1), 2456(2021).
  21. Orazi, G., O'toole, G. A. "It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  22. Costerton, J. W., et al. Bacterial biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
  23. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  24. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 167-193 (2002).
  25. Donlan, R. M. Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  26. Scherr, T. D., Heim, C. E., Morrison, J. M., Kielian, T. Hiding in plain sight: Interplay between Staphylococcal biofilms and host immunity. Front Immunol. 5, 37(2014).
  27. Thomsen, K., et al. Animal models of chronic and recurrent Pseudomonas aeruginosa lung infection: Significance of macrolide treatment. Apmis. 130 (7), 458-476 (2022).
  28. Normington, C., et al. Biofilms harbour Clostridioides difficile, serving as a reservoir for recurrent infection. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 16(2021).
  29. Frost, L. R., Cheng, J. K. J., Unnikrishnan, M. Clostridioides difficile biofilms: A mechanism of persistence in the gut. PLoS Pathog. 17 (3), e1009348(2021).
  30. Meza-Torres, J., Auria, E., Dupuy, B., Tremblay, Y. D. N. Wolf in sheep's clothing: Clostridioides difficile biofilm as a reservoir for recurrent infections. Microorganisms. 9 (9), 1922(2021).
  31. James, G. A., et al. Analysis of Clostridium difficile biofilms: Imaging and antimicrobial treatment. J Antimicrob Chemother. 73 (1), 102-108 (2018).
  32. Brauer, M., et al. What's a biofilm?-how the choice of the biofilm model impacts the protein inventory of Clostridioides difficile. Front Microbiol. 12, 682111(2021).
  33. Poquet, I., et al. Clostridium difficile biofilm: Remodeling metabolism and cell surface to build a sparse and heterogeneously aggregated architecture. Front Microbiol. 9, 2084(2018).
  34. Crowther, G. S., et al. Comparison of planktonic and biofilm-associated communities of Clostridium difficile and indigenous gut microbiota in a triple-stage chemostat gut model. J Antimicrob Chemother. 69 (8), 2137-2147 (2014).
  35. Crowther, G. S., et al. Development and validation of a chemostat gut model to study both planktonic and biofilm modes of growth of Clostridium difficile and human microbiota. PLoS One. 9 (2), e88396(2014).
  36. Dawson, L. F., Valiente, E., Faulds-Pain, A., Donahue, E. H., Wren, B. W. Characterisation of Clostridium difficile biofilm formation, a role for spo0a. PLoS One. 7 (12), e50527(2012).
  37. Dubois, T., et al. A microbiota-generated bile salt induces biofilm formation in Clostridium difficile. NPJ Biofilms Microbiomes. 5 (1), 14(2019).
  38. Abdelkhalek, A., Mohammad, H., Mayhoub, A. S., Seleem, M. N. Screening for potent and selective anticlostridial leads among fda-approved drugs. J Antibiot (Tokyo). 73 (6), 392-409 (2020).
  39. Chen, J., Lu, Y., Du, Y., Wang, H., Wu, Q. Recent development of small-molecular inhibitors against Clostridioides difficile infection. Bioorg Chem. 125, 105843(2022).
  40. Katzianer, D. S., Yano, T., Rubin, H., Zhu, J. A high-throughput small-molecule screen to identify a novel chemical inhibitor of Clostridium difficile. Int J Antimicrob Agents. 44 (1), 69-73 (2014).
  41. Pal, R., Dai, M., Seleem, M. N. High-throughput screening identifies a novel natural product-inspired scaffold capable of inhibiting Clostridioides difficile in vitro. Sci Rep. 11 (1), 10913(2021).
  42. Sun, X., et al. Mouse relapse model of Clostridium difficile infection. Infect Immun. 79 (7), 2856-2864 (2011).
  43. Edwards, A. N., Mcbride, S. M. Isolating and purifying Clostridium difficile spores. Methods Mol Biol. 1476, 117-128 (2016).
  44. Romo, J. A., Kumamoto, C. A. Characterization of the effects of Candida gastrointestinal colonization on Clostridioides difficile infection in a murine model. Methods Mol Biol. 2542, 271-285 (2022).
  45. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. Chapter 9 (Unit9A), 1(2009).
  46. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: Plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  47. Dapa, T., Unnikrishnan, M. Biofilm formation by Clostridium difficile. Gut Microbes. 4 (5), 397-402 (2013).
  48. O'toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis Exp. (47), e2437(2011).
  49. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J Bacteriol. 195 (3), 545-555 (2013).
  50. Morais, M., et al. Comparative biofilm-forming ability between Clostridioides difficile strains isolated in Latin America and the epidemic nap1/027 strain. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1033698(2022).

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