Articolo metodologico

Rilevamento della tenuta della membrana endoplasmatica associata ai mitocondri tramite biosensori FRET indutibili

DOI:

10.3791/67914

⸱

7 agosto 2026

 ,  , 
1Genetics and Aging Research Unit, MassGeneral Institute for Neurodegenerative Disease, Henry and Allison McCance Center for Brain Health, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School,

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un metodo per misurare i valori FRET di biosensori FRET indutibili che mirano al RE (marcato con CFP) o ai mitocondri (marcati con YFP) in vitro , per valutare la tenuta delle membrane ER associate ai mitocondri (MAMs), che influenzano la generazione di Aβ, e questo metodo può essere utilizzato per lo screening iniziale di agenti modulatori SINTETICI o naturali come potenziali terapie per l'AD.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Numerosi studi hanno dimostrato che il numero, la lunghezza e la larghezza (spessore) dei contatti ER-mitocondri, o membrane associate ai mitocondri (MAM), influenzano i loro ruoli biologici. I nostri lavori precedenti hanno mostrato che la stabilizzazione di MAM strette, caratterizzata da una larghezza di circa 7 nm, porta a un aumento dei livelli di β amiloide (Aβ), mentre la presenza di MAM lassi, con una larghezza di circa 40 nm, riduce la produzione di Aβ in un modello neurale tridimensionale (3D) del morbo di Alzheimer (AD). Per indagare gli effetti delle MAM con larghezze di gap differenti, sono stati sviluppati biosensori FRET (Förster Resonance Energy Transfer) mirati rispettivamente a ER e mitocondri, rispettivamente ER-CFP (proteina fluorescente cian) e Mito-YFP (proteina fluorescente gialla), per quantificare MAM strette (larghezza di gap di <10 nm) in contrasto con le MAMs sciolte o non le MAM. Il FRET si verifica quando il fluoroforo donatore (CFP) e il fluoroforo accettatore (YFP) sono a meno di 10 nm l'uno dall'altro, rendendo questo sistema adatto per valutare la prossimità del MAM. Questo protocollo delinea l'uso del FRET spettrale ratiometrico per misurare l'entità della formazione di MAM stretti.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I contatti del reticolo endoplasmatico associato ai mitocondri (MERC), isolati biochimicamente come membrane ER associate ai mitocondri (MAMs), sono implicati in diversi disturbi neurodegenerativi, tra cui la malattia di Alzheimer (AD)1. La recente proposta "ipotesi MAM" suggerisce che le MAM svolgano un ruolo centrale nella generazione della β amiloide (Aβ), dando così inizio alla cascata patogena dell'AD. Questa cascata include la formazione di grovigli neurofibrillari (NFT), la dishomeostasi calciale e laneuroinfiammazione 2. Le MAM sono costituite da microdomini ricchi di colesterolo, simili a zattere lipidiche, nel reticolo endoplasmatico e nella membrana mitocondriale esterna (OMM), collegati da specifiche proteine di collegamento che contribuiscono sia alla loro diversità strutturale chefunzionale 3. La stabilizzazione dei contatti dei mitocondri ER influenza vari processi cellulari, tra cui la segnalazione del calcio ER el'apoptosi 4,5. Si stima che il 5%-20% dei mitocondri avvicini a contatti fisici con la RE per stabilire laMAMs 6. Diversi studi hanno indicato che il numero, la lunghezza e la larghezza (spessore) tra il RE e i mitocondri nei siti MAM sono determinanti importanti dei loro ruoli funzionali. La criomicroscopia elettronica e le analisi in vivo del fegato del topo hanno dimostrato che lo stato metabolico degli epatociti modula sia lo spessore (da 14 nm a 20 nm) sia la lunghezza (da 145 nm a 270 nm) deiMAMs 7.

Le MAM stanno inoltre emergendo come potenziali bersagli terapeutici per vari disturbi, tra cui il cancro e i disturbi metabolici. Lo spessore o la larghezza della fessura del MAM regola la sopravvivenza cellulare. Gli stabilizzatori costitutivi MAM, MAM 1X e MAM 9X, progettati per stabilizzare rispettivamente MAM stretti (6 nm ± larghezza di gap 1 nm) e larghi (24 nm ± larghezza gap di 3 nm), hanno dimostrato che la stabilizzazione di MAM stretti ha aumentato drasticamente la generazione di Aβ in un nuovo modello di coltura neurale 3D dell'AD. Al contrario, la stabilizzazione delle MAM allentate non ebbe effetto8. Pertanto, convertire la stabilizzazione di MAM strette in MAM lassi può essere vantaggiosa per ridurre la patologia amiloide. Le complessità strutturali e funzionali e la mancanza di un'analisi quantitativa precisa del grado di stabilizzazione MAM rendono difficile indirizzare le MAM per la scoperta di farmaci. Una nuova analisi di imaging a cellule vive e basata sulla cimografia della velocità assonale dei mitocondri legati al RE ha dimostrato che la velocità assonale dei mitocondri può essere utilizzata come metrica per misurare quantitativamente la stabilizzazione del MAM, poiché un contatto più stretto con il RE ha ridotto significativamente la velocità assonale mitocondriale rispetto ai mitocondriliberi 8,9. Utilizzando uno stabilizzatore indutibile delle MAM nelle cellule Neuro 2A (N2AAPP) che esprimonohAPP 8, abbiamo riscontrato che il restringimento delle larghezze del gap MAM aumenta la generazione di Aβ in modo dipendentedalla dose 8. Gli stabilizzatori MAM indutibili sono plasmidi di espressione che codificano i biosensori di mira per ER (proteina di fluorescenza cian) e per i biosensori MITOCONDRI marcati da YFP (proteina di fluorescenza gialla) e per i mitocondri, fusi con i domini di legame della rapamicina indotti dalla rapamicina FK506 (FRB) o della proteina di legame FK506 a 12-kDa (FKBP). I biosensori erano indicati rispettivamente come ER-CFP e Mito-YFP. Il CFP è un fluoroforo donatore che trasferisce energia al fluoroforo accettore YFP quando sono separati da >10 nm. Le cellule (N2A APP) che esprimono i biosensori induttibili aumentano la generazione di Aβ dopo il trattamentocon rapamicina 8, suggerendo che l'aumento delle MAM strette aumenta la generazione di Aβ. Questi metodi saranno utili per lo screening dei modulatori di piccole molecole delle MAM e della loro concentrazione efficace necessaria per stabilizzare un livello ottimale di MAM stretti che convertano le MAM patogeniche ("aumento di Aβ") in terapiche ("abbassamento dell'Aβ") senza destabilizzare completamente i contatti di RE e mitocondri, importante per la sopravvivenza cellulare.

Modello sperimentale
Questo studio ha utilizzato cellule Neuro2A(N2A) che esprimono costitutivamente APP751 (N2A APP). Queste cellule rilasciano livelli rilevabili di Aβ nel mezzo condizionato (CM) rispetto alle cellule N2A ingenue. Le celluleN2A APP sono state mantenute in DMEM integrato con FBS al 10%, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di estreptomicina e 2 mM di L-glutammato integrato con 200 μg/mL di G418, come descritto inprecedenza 10.

Plasmide di espressione
Un plasmide di espressione è stato generato fondendo la sequenza di targeting mitocondriale marcata YFP (proteina fluorescente gialla) della proteina ancoraggio A-chinasi 1 [AKAP1(34-63)] e della sequenza di targeting ER marcata con CFP (proteina fluorescente cian ) della fosfatasi-Sac1 [Sac1(521-587)] con una sequenza auto-scindente di Tav2A che codifica per la sequenza peptidica EGRGSLLTCGDVEENPGP, indicata come pYFP-AKAP1-Tav2A-Sac1-CFP8. Il plasmide di espressione fuso con Tav2A è inoltre affiancato da sequenze nucleotidiche che codificano il dominio di legame della rapamicina FK506 (FRB) [EMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPL HAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNV (K 2095P)DLTQAWDLYYHVFRRISKQ] o il dominio della proteina di legame FK506 (FKBP) a 12-kDa (MGVEKQVIRPGNGPKPAPGQTVTVTVHCTGKD GDLSQKFWSTKDEGQKPFSFFFSFQIGKGAVIKGWDEGVIGMQ IGEVARLRCSSSDYAYGAGGFPAWGIQPNSVLDFEIEVLSVQ). Il plasmide di fusione FRB-YFP-AKAP1(34-63)-Tav2A-Sac1(521-587)-CFP-FKBP, qui indicato come MAM-Tav2A, è stato generato per ottenere livelli di espressione equimolare di FRB-YFP-AKAP1(34-63) e Sac1(521-587)-CFP-FKBP per l'analisi FRET ratiometrica. Il Sac1(521-587)-CFP-FKBP, indicato come ER-CFP, è il fluoroforo donatore, mentre Mito-YFP-FRB, indicato come Mito-YFP, è il fluoroforo accettore che genera FRET quando separato da ~10nm 8. Pertanto, i biosensori basati su FRET rilevano MAM stretti (6-10 nm, larghezza del divario). FRB e FKBP sono stati introdotti per indurre il restringimento delle larghezze del gap MAM all'aggiunta di rapamicina in modo dipendente dalla dose, quantificato misurando l'aumento del segnaleFRET 8.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Trasfezione

  1. Trasfettare le celluleN2A APP con plasmide di espressione MAM-Tav2A (14-18 ore).
    1. Prima di iniziare, la lastra 1 × 106 celluleN2A APP per pozzo di piastre a 6 pozzi contenenti coperture di vetro e mantenere le cellule nel mezzo di crescita per 12-16 ore.
    2. Trasfettare 1-3 μg MAM-Tav2A plasmide (File supplementare 1) utilizzando il reagente di transfezione Lipofectamina seguendo il protocollo del produttore.
    3. Dopo 12-16 ore di trasfezione, esegui un trattamento farmacologico.
      NOTA: Utilizzare sempre cellule trasfettate con un plasmide di espressione che codifica solo il donatore (ER-CFP) o l'accettatore (Mito-YFP) da utilizzare come fondo FRET.

2. Trattamento della droga

  1. Trattare le celluleN2A APP che esprimono MAM-Tav2A con rapamicina (Rapa) o Rapalog (Log) (3-6 ore).
    1. Prima del trattamento, preparare soluzioni stock (10 mM) di Rapa e Log.
    2. Sostituire il supporto con un substrato fresco contenente 0 nM, 100 nM o 250 nM Rapa o Log.
    3. Dopo 3 ore di trattamento, si aggiunge il 3,3% di paraformaldeide (PFA) per fissare le cellule.
    4. Preparare le vetrine per la microscopia confocale a fluorescenza applicando una goccia di reagente antifade.
    5. Monta le coperture sopra la goccia e premi delicatamente con la pinza.
      NOTA: Le coperture in vetro sono fragili e richiedono cautela. Come alternativa ai copri-lottole in vetro, si usano piastre inferiori in vetro. Il principale difetto dell'uso di piastre con fondo di vetro è che il reagente antifade non può essere utilizzato, il che rende difficile l'imaging a causa dello sbiancamento dei fluorofori. NON utilizzare un reagente antifade contenente DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) perché la sua fluorescenza blu interferirà con il FRET tra CFP e YFP.

3. Microscopia confocale per il trasferimento di energia da risonanza di fluorescenza (FRET)

  1. Posiziona le vetrine sotto un microscopio rovesciato e regola la messa a fuoco del microscopio finché le cellule non diventano visibili.
  2. Eccitare il fluoroforo con un laser da 440 nm e catturare immagini utilizzando un'emissione di 468-503 nm per il CFP DONATORE (FKBP-CFP-ER) o 525-565 nm per l'accettatore YFP (FRB-YFP-Mito).
  3. Regolare l'intensità del segnale usando il filtro fluorescente integrato finché il segnale di fondo non si è dissipato (dovrebbe essere quasi nero solido).
    NOTA: Un microscopio confocale è stato utilizzato per catturare immagini fluorescenti utilizzando il software NIS Element AR. È stato utilizzato un ingrandimento 60x a una risoluzione di 512 pixel.
  4. Salva le immagini come file .nds.
  5. Eseguire analisi FRET spettrale ratiometrica.

4. Analisi FRET ratiometrica (6 - 12 h)

NOTA: L'emissione di fluorescenza dal donatore ER-CFP (468-503 nm) e dall'accettatore Mito-YFP (525-565 nm) è stata rilevata utilizzando un microscopio confocale. Il software ImageJ è stato utilizzato per quantificare l'intensità media della fluorescenza dei pixel dopo la sottrazione dello sfondo. Il rapporto tra intensità di emissione YFP e CFP è stato calcolato e utilizzato come indicatore per l'analisi spettrale dei FRET.

  1. Immagine aperta J (Fiji).
  2. Trascina il file .nds su Image J, oppure premi File -> Open e seleziona l'Image.
  3. Nella schermata seguente, seleziona la casella Split Channels .
  4. Clicca sul pannello C = 0 .
  5. Clicca su Analizza -> misura.
    NOTA: Annota il Valore Medio per un calcolo successivo.
  6. Clicca su Processo -> Matematica -> Sottrare.
  7. Inserisci il valore medio.
  8. Ripeti il passo 4 per il pannello C = 1.
  9. Clicca sullo strumento di selezione a mano libera .
  10. Cerchia una cella di interesse, poi premi Ctrl+T per registrarlo nel ROI.
  11. Clicca su Mostra Tutto in fondo al ROI per mostrare ciò che hai già selezionato.
  12. Seleziona tutte le celle selezionate e clicca su Misura, registra questi valori in Excel.
  13. Clicca sul pannello C = 1 e poi su Mostra Tutto.
  14. Seleziona tutte le celle e clicca di nuovo su Misura, e registra questi valori in una colonna separata in Excel.
  15. In Excel, crea una funzione per mettere i valori del segnale donatore sul destinatario (C0/C1). Questo è il rapporto FRET.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'analisi ratiometrica FRETdelle cellule N2A APP arricchite da FACS che esprimono MAM-Tav2A ha dimostrato un aumento dei livelli di Aβ40 dipendente dalla dose dopo il trattamentocon rapamicina 8. La rapamicina agisce inebendo il bersaglio mammifero della via di segnalazione della rapamicina (mTOR), che a sua volta riduce l'espressione di TREM2 (Recettore Triggering Expresse sulle Cellule Mieloidi 2) nei microglia, portando a una riduzione della rimozione della placca Aβ nei modelli murini 5XFAD della malattia diAlzheimer 11. L'analogo della rapamicina AP21967, comunemente chiamato rapalog (Log), mostra una bassa affinità per l'mTOR ed è quindi relativamente non tossico per le cellule. Tuttavia, mantiene la capacità di legare il dominio FRB con la stessa affinità della rapamicina, grazie a una mutazione compensatoria che forma cavità (K2095P) introdotta nel dominioFRB 12.

Il trattamento con Rapa e Log ha aumentato il rapporto FRET (Figura 1). Il trattamento ha mostrato scarso o nullo effetto sui livelli di APP o di altre proteine MAM, come IP3R3 o VDAC1. Così, aumentare le MAM strette (<10 nm) aumentava la generazione di Aβ in vitro8. In particolare, anche i saggi FRET eseguiti in cellule N2A naïve hanno prodotto risultati simili.

figure-results-1
Figura 1: Il restringimento delle larghezze del gap del MAM ha aumentato la generazione di Aβ in vitro. (A) Schema dello stabilizzatore MAM indutibile CFP-FRB-ER-Tav2A-Mito-FKBP-YFP (MAM-Tav2A) che subisce auto-clivaggia, generando livelli equimolari del donatore (CFP-FRB-ER o ER-CFP) e dell'accettatore (Mito-FKBP-YFP o Mito-YFP), e promuove FRET/FLIM quando collegato ai MAM stretti endogeni o potenziando la formazione del MAM stretto inducendo l'interazione FRB e FKBP con Rapamicina (Rapa) o il suo analogo Rapalog (Log). (B) IB di cellule che esprimono MAM-Tav2A (Tav2A) che mostra espressione equimolare del CFP-ER (scatola blu) e Mito-YFP (scatola gialla) dopo l'auto-scissione di Tav2A. (C) Immagini confocali di cellule trattate con DMSO (Veh) o Rapa (250 nM) che sovraesprimono MAM-Tav2A. (D,E). Analisi FRET ratiometrica di cellule trattate senza (Veh) o con rapamicina a 100 nM (Rapa) (D) o rapalog (Log) (E). I valori FRET sono presentati come rapporti di intensità tra il canale 2 (465-500 nm) e il canale 1 (525-555 nm). Per ogni analisi FRET, sono state selezionate casualmente 40-50 celle per generare ROI cellula per cellula. ANOVA unidirezionale. p < 0,0001. (F) Immagine rappresentativa Western blotdelle cellule N2A APP che esprimono MAM-Tav2A dopo un trattamento di 24 ore con Rivastigmina (Riv: 0 o 50 μM). MAM-Tav2A generava livelli equimolari del donatore (CFP-ER) e dell'accettatore (Mito-YFP). (G) Quantificazione del rapporto FRET tra il donatore e l'accettatore di veicoli trattati (0 μM) o trattati con Riv (50 μM). (H) Aβ ELISA (Wako) del mezzo condizionato (CM) di cellule trattate con veicoli (0 μM) o trattate con Riv (50 μM) ha mostrato una significativa riduzione dei livelli di Aβ40 (pM) dopo 50 μM di trattamento con Riv. n = 6, p < 0,001. (I) I valori di FRET (rapporto) e Aβ (pM) sono tabulati. Le figure sono state modificate da Zellmer etal 8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: file di sequenza plasmidi MAM-Tav2A. La sequenza del DNA del plasmide di espressione che codifica la sequenza Sac1 ER targeting (521FLALPIIMVVAFSMCIICLLMA GDTWTETLAYVLFWGVASIGTFFIILYNGKDFVDAPRLVQKEKID 587) collegata alla sequenza FKBP e CFP e la sequenza AKAP1 che mira a mitocondri (34SSHDEQQVEAGAVQLRADPAIKEPLPVEDV63) collegata alla sequenza FRB e YFP collegata alla sequenza Tav2A auto-clivente (EGRGSLLTCGD VEENPGP). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La modulazione delle MAM è un'area emergente di ricerca con potenziali implicazioni per vari disturbi, tra cui cancro, disturbi metabolici e malattieneurodegenerative 13. Molti agenti farmacologici, tra cui l'antagonista della dinaina LDC-3/Dinastopina, il farmaco antidiabetico metformina e l'agente anticanceroso sulforafano, disturbano le MAM e sono attualmente in sperimentazione preclinica e clinica per tumori e disturbi metabolici. Questi agenti farmacologici modulano i contatti ER-mitocondri o le larghezze di contatto MAM regolando le interazioni tra proteine che attaccano MAM come PTPIP51, VAPB, VDAC1, PACS2, MFN2, VDAC1 e IP3R3 14,15,16,17,18,19,20. L'antagonista del recettore sigma-1 (S1R) (NE-100) ha detenuto le MAM e ridotto drasticamente i livelli assonali di Aβ in un modello neuronale 3D dell'AD21. Un recente rapporto ha dimostrato che la perdita di S1R ha aumentato le MAM lenti e diminuito quelle strette, suggerendo S1R come bersaglio terapeutico per modulare la rigiditàdella MAM 8,9.

L'imaging FRET (trasferimento di energia da risonanza di fluorescenza) dal vivo di neuroni derivati da ratti transgenici con la malattia di Alzheimer (AD) ha rivelato una significativa interruzione nelle MAM strette (<10 nm), senza alcuna variazione osservabile nelle MAM sciolte (~20 nm), rispetto a quelle nei controlli di tiposelvatico 1. Stabilizzatori MAM indutibili basati su FRET/FLIM che incorporano domini di dimerizzazione FRB e FKBP indotti da rapamicina (Rapa)/rapalog (Log), espressi nelle celluleN2A APP, hanno dimostrato che il trattamento Rapa/Log migliorava la strettezza del MAM e aumentava la produzione di Aβ40 in modo dipendente dalladose 8,9. Questo fornì la prima prova di concetto che restringere la larghezza dello spazio del MAM favorisce l'elaborazione amiloidogena. Il farmaco antiamnestico approvato dalla FDA rivastigmina, attualmente in fase di indagine preclinica per AD lieve amoderata 22,23, ha ridotto significativamente i livelli di Aβ40 (p < 0,001) senza alterare l'espressione di VDAC1 o BACE1, né influenzare la frequenza di colocalizzazione tra CFP-ER e Mito-YFP 8,9. La rivastigmina sembra influenzare la stabilizzazione del MAM modulando i livelli della proteina ancoratrice del MAM mitofusina-2 (MFN2)24. Questo risultato è in linea con altri studi che riportano che la rivastigmina riduce i livelli di Aβ nei neuroni coltivati e nei modelli murini con AD (3xTg)25,26. Poiché la larghezza del gap del MAM regola vari processi cellulari essenziali per la sopravvivenzacellulare 27, la modulazione mirata della stabilità del MAM può offrire una strategia terapeutica più efficace contro l'accumulo di Aβ rispetto alla destabilizzazione completa delle MAM, che potrebbe portare a effetti avversi indesiderati.

Una limitazione importante del metodo è che la tecnica FRET ratiometrica si basa sull'espressione equimolare del donatore e dell'accettore. La co-espressione dei plasmidi di espressione che codificano per il donatore, o l'accettore, produrrà risultati incoerenti. L'uso di un Tav2A auto-clivellante che collega i biosensori donatori e accettori garantisce l'espressione equimolare dei biosensori. Tuttavia, i livelli di espressione dei biosensori sono stati controllati utilizzando l'analisi Western blot prima dell'analisi FRET.

La rapamicina (Rapa) potrebbe non essere ideale per valutare gli effetti del restringimento del MAM sulla produzione di Aβ, poiché inibisce la via di segnalazione del bersaglio mammifero della rapamicina (mTOR), portando alla ridimensionamento del TREM2 (recettore attivante espresso sulle cellule mieloidi 2) nella microglia e riducendo di conseguenza la rimozione della placca Aβ nei modelli murini per la malattia di Alzheimer (AD) (5XFAD)11. Come alternativa, può essere utilizzato il AP21967 analogo della rapamicina, comunemente chiamato rapalog (Log). Il log mostra una bassa affinità di legame per mTOR, rendendolo relativamente non tossico per le cellule. Tuttavia, mantiene la capacità di legare il dominio FRB con affinità simile alla rapamicina, grazie all'introduzione di una mutazione compensatoria formatrice di cavità (K2095P) nel dominioFRB 12.

Il metodo descritto ha un alto significato. Nonostante le evidenze di diversi studi preclinici che mostrano effetti terapeutici promettenti dei modulatori sintetici o naturali a piccole molecole delle MAM nel cancro e nei disturbi metabolici, non sono ancora stati condotti studi clinici. Una delle ragioni principali è la mancanza di un metodo affidabile che possa misurare quantitativamente la stabilità del MAM, un prerequisito per sviluppare terapie efficaci. La quantificazione della relazione struttura-funzione della MAM richiede una visione completa della cellula, cosa che non può essere ottenuta per i neuroni maturi con le tradizionali microscopie TEM o altre microscopie ad alta risoluzione, ma può essere acquisita con un ingrandimentoa basso 28. Pertanto, tecniche tradizionali come TEM, crio-TEM o microscopie elettroniche a scansione (SEM) possono rilevare strutture cellulari a livello nanoscalare ma presentare limitazioni nel misurare il grado di stabilizzazione MAM perché la natura altamente dinamica dei mitocondri29 e ER30,31 rende le strutture MAMtransitorie 32,33,34 . Per indagare la relazione struttura-funzione della MAM, è stata proposta la misurazione della velocità assonale dei mitocondri collegati al RE tramite MAM stretti o lassi, utilizzando imaging a cellule vive e analisi di una kimografia. Ciò è coerente con i rapporti che mostrano una diminuzione del trasporto assonale dei mitocondri nei neuroni corticali provenienti dai cervelli AD35 e dalle cellule differenziate di ADcybrid 36. Nonostante l'elevata accuratezza quantitativa, la tecnica di imaging a cellule vive potrebbe non essere utile per lo screening farmacologico ad alto rendimento. Al contrario, l'analisi FRET/FLIM può essere applicata come una tecnica quantitativa più veloce rispetto alla microscopia a cellule vive o ad alta risoluzione esistente in futuro per identificare terapie a piccole molecole per l'Alzheimer.

Il protocollo FRET descritto qui è stato dimostrato applicabile specificamente nel contesto del collegamento artificialmente indotto tra RE e mitocondri. La sua semplicità consente una valutazione efficiente della stabilità del contatto ER-mitocondri e l'indagine degli effetti risultanti sulla patologia amiloide, che costituisce l'obiettivo principale di questo approccio. Miriamo a utilizzare ulteriormente questo metodo per selezionare una libreria di potenziali piccole molecole modulanti MAM all'interno di una piattaforma di screening tridimensionale (3D) per farmaciAD recentemente sviluppata, la 37. I risultati saranno estremamente utili per selezionare potenziali modulatori MAM a piccole molecoleanti-Aβ 13 in vitro che potranno essere estesi in futuro a studi in vivo o clinici.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo sinceramente il dottor Rudolph E. Tanzi, Professore al Massachusetts General Hospital (MGH), per i suoi commenti perspicaci sul manoscritto. Ringraziamo il Dr. Masato Maesako, Professore Associato presso il MGH, per aver condiviso la sua esperienza nei saghi FLIM. Ringraziamo il dottor Gyorgy Hajnoczky, professore presso la Thomas Jefferson University di Philadelphia, per averci generosamente fornito plasmidi di espressione che codificano ER-CFP o Mito-YFP. Questo studio è stato finanziato dal Cure Alzheimer's Fund per RB.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BSAFisher Scientific501781532
Microscopio confocal Olympus FV3000RS (Tokyo, Japan)N/A
DMEM con supplemento GlutaMAXGibco/Thermo Fisher Scientific10564011
EDTA  Life Technologies41116134
Piastre Falcon a 6 pozzetti VWR International41122107
Anticorpo policlonale GAPDHThermo Fisher ScientificPA1-988
GelatinVWR International9000-70-8
Geneticina (G418 solfato)Gibco/Thermo Fisher Scientific10131035
Anticorpo monoclonal GFPInvitrogenMA5-15256
Graphpad Prism N/APrism 9, versione 9.5.0N/A
EparinaSigma-Aldrich H0200000
Software ImageJ ImageJ 1.53aN/A
Microscopio confocal invertito Nikon (C2 Eclipse Ti2)N/A
Lipofectamine2000Invitrogen11668027
MS Excel  Microsoft Excel, versione 2302N/A
NaCl  Fisher Scientific7647145
Gel NuPAGE 4–12% Bis-Tris  InvitrogenNP0321BOX
Penicillina/Streptomicina/Anfotericina B Lonza 17-745E
PhotoshopAdobe Photoshop CC 20.0.10 N/A
Tris-HCL, pH 7.6  Boston BioProducts42000000
Triton X-100  Sigma-AldrichT8787
Trypsin-EDTAGibco/Thermo Fisher Scientific25200056
Tween 20Fisher Scientific501657287

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Martino Adami, P. V., et al. Perturbed mitochondria-ER contacts in live neurons that model the amyloid pathology of Alzheimer's disease. J Cell Sci. 132 (20), 229906(2019).
  2. Area-Gomez, E., Schon, E. A. On the pathogenesis of Alzheimer's disease: The MAM hypothesis. FASEB J. 31 (3), 864-867 (2017).
  3. Fujimoto, M., Hayashi, T. New insights into the role of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane. Int Rev Cell Mol Biol. 292, 73-117 (2011).
  4. Prudent, J., et al. MAPL SUMOylation of Drp1 stabilizes an ER/mitochondrial platform required for cell death. Mol Cell. 59 (6), 941-955 (2015).
  5. Carpio, M. A., et al. controls apoptosis by Ca2+ through ER-mitochondrial contact sites. Cell Rep. 34 (10), 108827(2021).
  6. Degechisa, S. T., Dabi, Y. T., Gizaw, S. T. The mitochondrial associated endoplasmic reticulum membranes: A platform for the pathogenesis of inflammation-mediated metabolic diseases. Immun Inflamm Dis. 10 (7), e647-e658 (2022).
  7. Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: Structure and signaling functions. Trends Cell Biol. 28 (7), 523-540 (2018).
  8. Zellmer, J. C., et al. Stabilization of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes regulates Aβ generation in a three-dimensional neural model of Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 21 (2), e14417(2024).
  9. Zellmer, J. C., Lomoio, S., Tanzi, R. E., Bhattacharyya, R. Quantitative analysis of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) stabilization in a neural model of Alzheimer's disease (AD). J Vis Exp. (215), e66129(2025).
  10. Bhattacharyya, R., et al. The neuronal-specific isoform of BIN1 regulates beta-secretase cleavage of APP and Abeta generation in a RIN3-dependent manner. Sci Rep. 12 (1), 3486-3500 (2022).
  11. Shi, Q., et al. Microglial mTOR activation upregulates Trem2 and enhances β-amyloid plaque clearance in the 5XFAD Alzheimer's disease model. J Neurosci. 42 (27), 5294-5313 (2022).
  12. Wilmington, S. R., Matouschek, A. An inducible system for rapid degradation of specific cellular proteins using proteasome adaptors. PLoS One. 11 (4), e0152679(2016).
  13. Magalhaes Rebelo, A. P., et al. Chemical modulation of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites. Cells. 9 (7), 1637-1655 (2020).
  14. De Vos, K. J., et al. VAPB interacts with the mitochondrial protein PTPIP51 to regulate calcium homeostasis. Hum Mol Genet. 21 (6), 1299-1311 (2012).
  15. Yang, M., et al. Mitochondria-associated ER membranes: The origin site of autophagy. Front Cell Dev Biol. 8, 595(2020).
  16. Filadi, R., et al. Mitofusin 2 ablation increases endoplasmic reticulum-mitochondria coupling. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (17), E2174-E2181 (2015).
  17. Filadi, R., et al. On the role of Mitofusin 2 in endoplasmic reticulum-mitochondria tethering. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), E2266-E2267 (2017).
  18. Xie, Q., et al. ABT737 reverses cisplatin resistance by regulating ER-mitochondria Ca2+ transduction in human ovarian cancer cells. Int J Oncol. 49 (6), 2507-2519 (2016).
  19. Tsunoda, T., et al. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 modulates the acquisition of cisplatin resistance in bladder cancer cell lines. Oncogene. 24 (8), 1396-1402 (2005).
  20. Tubbs, E., et al. Sulforaphane improves disrupted ER-mitochondria interactions and suppresses exaggerated hepatic glucose production. Mol Cell Endocrinol. 461, 205-214 (2018).
  21. Bhattacharyya, R., et al. Axonal generation of amyloid-beta from palmitoylated APP in mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes. Cell Rep. 35 (7), 109134(2021).
  22. Alhazmi, H. A., Albratty, M. An update on the novel and approved drugs for Alzheimer disease. Saudi Pharm J. 30 (12), 1755-1764 (2022).
  23. Rountree, S. D., et al. Effectiveness of antidementia drugs in delaying Alzheimer's disease progression. Alzheimers Dement. 9 (3), 338-345 (2013).
  24. Hadwen, J., et al. Transcriptomic RNAseq drug screen in cerebrocortical cultures: Toward novel neurogenetic disease therapies. Hum Mol Genet. 27 (18), 3206-3217 (2018).
  25. Ray, B., et al. Rivastigmine modifies the α-secretase pathway and potentially early Alzheimer's disease. Transl Psychiatry. 10 (1), 47(2020).
  26. Bailey, J. A., Ray, B., Greig, N. H., Lahiri, D. K. Rivastigmine lowers Aβ and increases sAPPα levels, which parallel elevated synaptic markers and metabolic activity in degenerating primary rat neurons. PLoS One. 6 (7), e21954(2011).
  27. Ziegler, D. V., Martin, N., Bernard, D. Cellular senescence links mitochondria-ER contacts and aging. Commun Biol. 4 (1), 1323(2021).
  28. Neikirk, K., et al. Call to action to properly utilize electron microscopy to measure organelles to monitor disease. Eur J Cell Biol. 102 (4), 151365(2023).
  29. Liu, X., et al. Mitochondrial 'kiss-and-run': Interplay between mitochondrial motility and fusion-fission dynamics. EMBO J. 28 (20), 3074-3089 (2009).
  30. Szymanski, J., et al. Interaction of mitochondria with the endoplasmic reticulum and plasma membrane in calcium homeostasis, lipid trafficking and mitochondrial structure. Int J Mol Sci. 18 (7), ijms18071576(2017).
  31. Tikhomirova, M. S., et al. A role for endoplasmic reticulum dynamics in the cellular distribution of microtubules. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (15), e2104309119(2022).
  32. Stacchiotti, A., et al. Perspective: Mitochondria-ER contacts in metabolic cellular stress assessed by microscopy. Cells. 8 (1), 8010005(2018).
  33. Cieri, D., et al. SPLICS: A split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  34. Giacomello, M., Pellegrini, L. The coming of age of the mitochondria-ER contact: A matter of thickness. Cell Death Differ. 23 (9), 1417-1427 (2016).
  35. Dai, J., et al. Impaired axonal transport of cortical neurons in Alzheimer's disease is associated with neuropathological changes. Brain Res. 948 (1), 138-144 (2002).
  36. Trimmer, P. A., Borland, M. K. Differentiated Alzheimer's disease transmitochondrial cybrid cell lines exhibit reduced organelle movement. Antioxid Redox Signal. 7 (9-10), 1101-1109 (2005).
  37. Quinti, L., et al. Neurotherapeutics in the Era of Translational. Smith, R. A., Kaspar, B. K., Svendsen, C. N. , Academic Press. 311-331 (2021).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

BiologiaNumero 234Numero 234Questo mese in JoVENumero
Video in arrivo

Articoli correlati