Qui, descriviamo i protocolli per ottenere colture primarie di cellule epiteliali tubulari renali umane (HRTEC) dalla corteccia renale per sviluppare monostrati e colture tridimensionali su una matrice extracellulare (3D-HRTEC).
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Articolo metodologico
Sviluppo di colture primarie di cellule epiteliali tubulari renali umane in monostrati e condizioni tridimensionali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le colture primarie di cellule epiteliali tubulari renali umane (HRTEC) sono isolate da reni prelevati da pazienti pediatrici sottoposti a nefrectomia indicata dall'Unità di Nefrologia Pediatrica dell'Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde, Buenos Aires, Argentina. Macroscopicamente, la corteccia renale normale viene sezionata dal midollo renale e tagliata in frammenti. I frammenti corticali vengono quindi digeriti nella soluzione di Hank integrata con collagenasi di tipo 1 allo 0,1% e filtrati attraverso una rete di dimensioni dei pori di 70 μm per separare i tubuli renali dai glomeruli. I tubuli renali subiscono una seconda digestione con collagenasi per isolare le cellule epiteliali. Infine, la digestione enzimatica viene interrotta e le cellule epiteliali vengono coltivate in fiasche contenenti RPMI 1640 con integratori inferiori al 5% di CO2a 37 °C fino alla confluenza. Le cellule HRTEC possono essere coltivate come monostrati su piastre da 96 pozzetti, vetrini coprioggetti in piastre da 24 pozzetti o supporti per colture cellulari rivestiti con collagene. Inoltre, colture tridimensionali di cellule epiteliali tubulari renali umane (3D-HRTEC) sono ottenute da cellule HRTEC seminate su una matrice di membrana basale (BM). Vengono monitorate l'aggregazione cellulare e la formazione di strutture di forma tubolare. Abbiamo utilizzato colture primarie HRTEC per molti anni per studiare l'azione citotossica causata dalla tossina Shiga nel rene pediatrico, che porta ad alterazioni fisiopatologiche con conseguente sindrome emolitico uremica (SEU). Sia le colture HRTEC che 3D-HRTEC possono essere utilizzate per valutare gli effetti di diverse tossine, farmaci sintetici, fattori biologici, ormoni, ecc., in particolare sull'epitelio del tubulo prossimale renale umano.
Introduzione
Nel nostro gruppo, colture primarie di cellule epiteliali tubulari renali umane (HRTEC) sviluppate in monostrati e in condizioni tridimensionali (3D-HRTEC) sono state utilizzate per studiare nel rene pediatrico l'azione citotossica della tossina Shiga di tipo 2 (Stx2) causata dopo un'infezione gastrointestinale con Escherichia coli produttore della tossina Shiga (STEC).
Stx1 e Stx2 (Stxs) sono i principali fattori di virulenza della STEC in grado di causare la sindrome emolitico uremica post-diarroica (SEU)1. La SEUa è una complicanza sistemica che colpisce circa il 5-10% dei bambini con infezione da STEC e consiste in anemia emolitica, trombocitopenia e danno renale acuto pediatrico (AKI), che richiedono un trattamento di supporto2. In Argentina, la STEC-HUS è una malattia endemica con un'incidenza annuale di 6,52 casi ogni 100.000 bambini sotto i 5 anni di età (la più alta a livello mondiale), che rappresenta una delle principali cause di danno renale acuto3. Sebbene la mortalità sia inferiore al 4%3, circa il 50% dei pazienti sviluppa sequele renali, costituendo la seconda causa più frequente di trapianto di rene nelnostro Paese4,5.
Prima dell'internalizzazione e dell'esercizio della sua azione citotossica, Stx2 si lega specificamente al recettore glicolipidico globotriaosilceramide (Gb3) espresso sulla superficie cellulare degli organi bersaglio6. Il rene è il principale organo danneggiato da Stxs a causa della presenza di cellule sensibili a Stx, che esprimono elevate quantità di recettori Gb3 biologicamente attivi nelle cellule epiteliali ed endoteliali renali 7,8.
Precedenti lavori condotti su HRTEC coltivato come monostrati hanno dimostrato che Stx2 inibiva la sintesi proteica, diminuiva la vitalità cellulare e la proliferazione cellulare e induceva apoptosi e necrosi 9,10,11,12. Inoltre, l'esposizione di 3D-HRTEC a Stx2 ha inibito la migrazione cellulare e lo sviluppo di strutture tubulari con caratteristiche dei tubuli prossimali renali12,13.
Le colture primarie di HRTEC e 3D-HRTEC sono state utilizzate anche per valutare l'effetto dell'estradiolo sulla proliferazione cellulare misurando l'incorporazione di 5-bromo-2-deossiuridina (BrdU) nel DNA delle cellule nella fase S del ciclo cellulare14.
Per isolare le cellule epiteliali si parte da frammenti renali ottenuti da nefrectomie pediatriche indicate per la correzione delle condizioni urologiche.
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Protocollo
Il Comitato Etico dell'Hospital General de Niños Pedro de Elizalde ha approvato l'uso di tessuti renali umani per lo sviluppo di colture cellulari primarie a fini di ricerca. È stato ottenuto il consenso informato scritto da parte dei parenti più stretti o dei tutori per conto dei bambini per l'uso di campioni di rene per la ricerca.
NOTA: Le colture primarie di cellule epiteliali tubulari renali umane (HRTEC) derivano da pazienti pediatrici sottoposti a nefrectomie, indicate per la correzione di condizioni urologiche o resezioni tumorali, presso l'Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde di Buenos Aires, Argentina.
1. Sviluppo di colture primarie di cellule epiteliali tubulari renali umane (HRTEC)
NOTA: I frammenti renali corticali vengono sezionati dai reni prelevati da pazienti pediatrici sottoposti a nefrectomia in ospedale. La coltura primaria dell'HRTEC viene eseguita secondo il metodo descritto in precedenza11.
Il protocollo è descritto nei passaggi seguenti:
- Conservare il frammento di rene in frigorifero in soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) o in soluzione salina bilanciata di Hanks (Hanks) fino a quando non viene lavorato in laboratorio.
- Sezionare la capsula renale con una pinza. Separare la corteccia renale dal midollo e tagliarlo in piccoli frammenti di circa 1 mm.
- Per eseguire la digestione, porre i frammenti di rene in una soluzione sterile di Hanks senza Ca2+ e Mg2+, integrata con lo 0,1% di collagenasi di tipo I.
- Incubare i frammenti renali per 30 minuti a 37 °C agitandoli.
- Per arrestare la digestione, aggiungere un volume di PBS contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e lavare il campione tre volte mediante centrifugazione a 160 × g per 10 minuti ciascuna, in una centrifuga refrigerata a 4 °C. Ad ogni centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet nella stessa soluzione.
- Passare il prodotto della digestione attraverso una rete di pori di 70 μm per filtrare i tubuli e scartare i glomeruli che rimangono trattenuti nel filtro.
- Centrifugare i tubuli filtrati a 160 × g per 10 minuti a 4 °C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in soluzione sterile di Hanks, senza Ca2+ e Mg2+, addizionato con collagenasi 0,2% di tipo I.
- Incubare il campione per 30 minuti a 37 °C agitandolo.
- Per fermare la digestione, aggiungere un volume di PBS contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS).
- Lavare il campione tre volte centrifugandolo a 160 × g, 10 min ciascuna, in una centrifuga refrigerata a 4 °C. Ad ogni centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet nella stessa soluzione.
- Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in 5 mL di terreno di coltura completo (RPMI 1640 integrato con FBS al 5%, L-glutammina [2 mmol/L], penicillina [100 U/mL], streptomicina [100 μg/mL] e integratore per la crescita delle cellule endoteliali [ECGS, 1%]).
- Seminare la sospensione cellulare in un pallone di coltura da 25 cm2 con coperchio ventilato.
- Incubare le cellule a 37 °C in atmosfera umida e 5% di CO2.
- Il giorno successivo, lavare la coltura cellulare 3 volte, scartando il liquido dal pallone, aggiungendo 5 ml di PBS ciascuno e aggiungendo 5 ml di terreno di coltura completo al pallone. Questi lavaggi eliminano i globuli rossi e i frammenti tubulari che non sono stati completamente digeriti e non sono stati attaccati al pallone di coltura.
- Incubare le cellule epiteliali nell'incubatore per colture cellulari a 37 °C, in modo che crescano in monostrato fino alla confluenza.
- Sostituire il terreno con un terreno di coltura completo fresco ogni 3 giorni e osservare la coltura cellulare ogni giorno al microscopio invertito.
2. Sviluppo di colture tridimensionali HRTEC (3D-HRTEC)
NOTA: Questa sezione fornisce i passaggi per sviluppare colture tridimensionali (3D-HRTEC). Le colture 3D-HRTEC vengono eseguite secondo il metodo descritto in precedenza12.
- Utilizzare una matrice BM del sarcoma murino di Engelbreth-Holm-Swarm. Questa matrice BM viene consegnata congelata e, in questo stato, rimane solida. Scongelare la soluzione di matrice BM per una notte in un bagno di ghiaccio in frigorifero a 4 °C, come indicato dal produttore.
- Raffreddare i puntali nel congelatore prima di posizionare la matrice BM e lasciare la piastra a più pozzetti sul ghiaccio per evitare la solidificazione della matrice durante il processo.
- Prelevare un'aliquota di matrice BM liquida (150 mL/cm2) e posizionarla in ciascun pozzetto della piastra fino a coprire il fondo del pozzetto. Incubare la piastra nell'incubatore cellulare a 37 °C per 1 ora per trasformare la matrice midollare in uno stato gel.
- Nel frattempo, per staccare le colture primarie HRTEC confluenti, scartare il terreno di coltura dal pallone e aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% e una soluzione di EDTA allo 0,02%.
- Distribuire il liquido su tutta la superficie del pallone e incubare per 5 minuti a 37 °C nell'incubatore per colture cellulari.
- Osservare al microscopio invertito se tutte le cellule si sono staccate.
- Risospendere le cellule in 10 mL di terreno di coltura o PBS, passarle in una provetta da 15 mL e centrifugare a 160 × g per 10 min a 4 °C.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un terreno di coltura completo contenente gli stessi integratori utilizzati per le colture primarie HRTEC.
- Contare il numero di cellule in una camera di Neubauer.
- Seminare 4 × 104 cellule/150 μL per pozzetto sulla matrice BM. Incubare la coltura cellulare per diversi giorni in un incubatore per colture cellulari a 37 °C, in atmosfera umida e 5% di CO2.
- Cambiare il terreno ogni 2 giorni con un terreno fresco.
- Monitorare l'aggregazione cellulare e la formazione di strutture tubolari al microscopio ottico invertito.
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Risultati
Le colture primarie HRTEC confluenti hanno mostrato una morfologia simile osservata al microscopio ottico (Figura 1). Le cellule sono state caratterizzate da immunofluorescenza come descritto nelle nostre precedenti pubblicazioni utilizzando anticorpi contro l'acquaporina 1 (AQP1) e PECAM CD31 9,12,13. Gli studi di immunofluorescenza hanno dimostrato che oltre il 90% degli HRTEC era positivo per l'A...
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Discussione
Le colture primarie devono essere eseguite lo stesso giorno della nefrectomia. Le colture primarie HRTEC possono essere utilizzate tra 1 e 5 passaggi per garantire la stabilità morfogenetica delle cellule. Dopo il quinto passaggio, le cellule iniziano a modificare la loro morfologia, mostrando un aspetto simile a un fibroblasto o un aumento dei vacuoli, e possono diventare quiescenti.
Se viene utilizzato un frammento renale più grande, il DNA rilasciato dalla ...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Siamo grati all'équipe di Urologia Pediatrica della "Sección de Cirugía Pediátrica, Hospital General de Pediatría Pedro de Elizalde", Buenos Aires, Argentina, per aver fornito campioni di rene. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a C. Silberstein dell'Università di Buenos Aires (UBACYT20020190100072BA) e a C. Ibarra e C. Silberstein dal Consiglio Nazionale per la Ricerca Scientifica e Tecnica (CONICET: PUE 0041). Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED) (attraverso Red STEC/SUH Nº 224RT0152).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Collagenasi tipo I | Sigma Merck, St Louis, MO, Stati Uniti | 637958 | |
| Integratore per la crescita delle cellule endoteliali | Sigma Merck, St Louis, MO, Stati Uniti | E2759 | |
| Matrice della membrana basale Matrigel | BD Biosciences, Stati Uniti; Sigma Merck, St Louis, MO, Stati Uniti | 356234 | |
| 70 μ Filtro a rete a pori m | BD Bioscience, MA, Stati Uniti | css010070 | |
| RPMI 1640 medium con L-glutammina | Sigma Merck, St Louis, MO, Stati Uniti | R8758-500ml | |
| Hanks' Soluzione salina bilanciata Senza Ca2+ e Mg2+ | Gibco Invitrogen, NY, Stati Uniti | 14175046 | |
| Soluzione di tripsina-EDTA | Sigma Merck, St Louis, MO, Stati Uniti | T4049 |
Riferimenti
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