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Articolo metodologico

Imaging a super-risoluzione del biofilm di Proteus mirabilis mediante microscopia ad espansione

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DOI:

10.3791/67932

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18 luglio 2025

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1Laboratory for Scientific Image Analysis SCIAN-Lab, Integrative Biology Program, Centro de Informática Médica y Telemedicina CIMT, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 2Biomedical Neuroscience Institute BNI, 3Advanced Center for Chronic Diseases ACCDiS, 4Laboratorio de Biofilms Microbianos, Departamento de Microbiología, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 5Red de Equipamiento Científico Avanzado REDECA, Institute of Biomedical Sciences ICBM, Faculty of Medicine, University of Chile, 6National Center for Health Information Systems CENS, 7Centro de Modelamiento Matemático, Universidad de Chile

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo completo per PmbExM, una tecnica di microscopia ad espansione progettata specificamente per i biofilm di Proteus mirabilis . PmbExM utilizza un trattamento enzimatico graduale di campioni di biofilm per ottenere un'espansione isotropa di 4,3 volte, consentendo l'analisi a super-risoluzione dell'organizzazione spaziale delle strutture cellulari e subcellulari all'interno di queste comunità microbiche sessili.

Abstract

L'accesso a informazioni visive dettagliate e dati quantitativi da campioni microbiologici utilizzando la microscopia ottica convenzionale è limitato dalla barriera di diffrazione. Una soluzione per migliorare la risoluzione è la microscopia ad espansione (ExM), una tecnica di super-risoluzione innovativa ed economica che ingrandisce fisicamente i campioni di circa quattro volte le loro dimensioni originali. Per un'espansione di successo, è essenziale omogeneizzare le proprietà meccaniche del materiale biologico. I biofilm sono comunità batteriche, aderenti a una superficie e incorporate in una matrice extracellulare che producono; richiedono che i protocolli ExM siano adattati per accogliere i loro componenti strutturali unici. Questo articolo presenta il biofilm Proteus mirabilis ExM (PmbExM), una variante specializzata di ExM che consente la visualizzazione a super risoluzione di biofilm di P. mirabilis cresciuti per 48 ore. Il protocollo si concentra sulla degradazione mirata dei componenti strutturali chiave dei campioni attraverso digestioni enzimatiche seriali, ottimizzate in prossimità delle loro condizioni teoriche. PmbExM utilizza una combinazione di enzimi, tra cui α-amilasi, cellulasi e glicoside-idrolasi liticasi per l'idrolisi dei polisaccaridi; mutanolisina per l'idrolisi del peptidoglicano; e proteinasi K per l'idrolisi delle proteine. Queste procedure di digestione sono indipendenti dal processo di gelificazione, consentendo modifiche per soddisfare specifici requisiti di omogeneizzazione in diversi modelli di biofilm. Questa adattabilità offre un grande potenziale per l'applicazione in varie specie batteriche e condizioni di crescita. L'ExM è stato applicato a diverse specie di biofilm con fattori di espansione complessivamente non ottimali. Al contrario, PmbExM raggiunge il fattore di espansione massimo teorico dell'idrogel standard di acrilammide-acrilato ExM, senza distorsioni significative della morfologia o della topologia. Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo accessibile a super-risoluzione per visualizzare l'architettura, l'assemblaggio e le caratteristiche cellulari e intracellulari dei biofilm di P. mirabilis .

Introduzione

La microscopia a fluorescenza è uno strumento ampiamente utilizzato per studiare l'architettura, la composizione e la funzione del biofilm1. Tuttavia, la capacità della microscopia ottica di risolvere le caratteristiche strutturali, cellulari e subcellulari dei biofilm è limitata dalla barriera di diffrazione. La microscopia ad espansione (ExM) è una tecnica di super-risoluzione innovativa, accessibile e facile da usare che ha un grande potenziale per rivelare la struttura del biofilm oltre il limitedi diffrazione 2,3. ExM migliora la risoluzione espandendo isotropicamente i campioni biologici circa quattro volte la loro dimensione originale. Il metodo prevede la polimerizzazione in situ di un idrogel ionico rigonfiabile in tutto il campione e la conservazione della disposizione spaziale relativa dei bersagli molecolari quando applicato con cura 4,5.

Affinché l'ExM funzioni correttamente, l'omogeneizzazione delle proprietà meccaniche del materiale biologico è un passaggio cruciale6. Le varianti standard di ExM sono state sviluppate su colture e tessuti cellulari di mammifero, dove hanno raggiunto in modo efficiente l'omogeneizzazione solo attraverso la digestione proteolitica della proteinasi K 4,5 o la denaturazione delle proteine morbide con detergenti e autoclave7, producendo un'espansione isotropa di 4 volte. Tuttavia, nel caso di batteri e biofilm batterici, la parete cellulare del peptidoglicano e gli elementi della matrice EPS, come i polisaccaridi strutturali, sono ostacoli all'espansione 2,3,8,9.

Questo articolo descrive le procedure della microscopia ad espansione del biofilm Proteus mirabilis (PmbExM), una variante ExM su misura progettata per espandere i biofilm di P. mirabilis, un bacillo gram-negativo clinicamente rilevante associato a un'elevata resistenza agli antibiotici e alle infezioni del tratto urinario associate al catetere10. PmbExM utilizza una combinazione di mutanolisina, α-amilasi, cellulasi, liticasi e trattamenti enzimatici della proteinasi K per idrolizzare rispettivamente la parete cellulare del peptidoglicano, i polisaccaridi e le proteine. I risultati dimostrano che questo metodo raggiunge un'espansione isotropa di 4,3 volte dei biofilm di P. mirabilis di 48 ore. La tecnica consente la visualizzazione a super-risoluzione dell'architettura, dell'assemblaggio e delle caratteristiche intracellulari del biofilm di P. mirabilis attraverso la doppia colorazione3. Inoltre, PmbExM può essere adattato ad altri modelli di biofilm regolando i trattamenti enzimatici per colpire i componenti del biofilm specie-specifici.

L'obiettivo di questo articolo è fornire una descrizione dettagliata delle procedure coinvolte nella gelificazione, digestione, espansione e montaggio di campioni di biofilm per PmbExM. Inoltre, questo lavoro delinea le condizioni di crescita batterica, i formati dei campioni e le tecniche di colorazione fluorescente utilizzate dagli autori, insieme a una routine di elaborazione e analisi dei dati che può essere facilmente applicata da ricercatori con esperienza limitata nell'elaborazione delle immagini. Per una guida più completa e approfondita sull'elaborazione e l'analisi delle immagini, si rimanda a Castagnini, D. et al.3.

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Protocollo

Il processo complessivo di PmbExM è riassunto nella Figura 1. Si prega di fare riferimento al File supplementare 1 per trovare la composizione di tutte le soluzioni nominate (ad esempio, soluzione monomerica, soluzione di digestione della proteinasi K, ecc.) utilizzate in questo lavoro. Allo stesso modo, fare riferimento al file supplementare 2, al file supplementare 3 e al file supplementare 4 per una routine semplificata di elaborazione e analisi dei dati che può essere utilizzata da ricercatori senza una vasta esperienza nell'elaborazione delle immagini. Il protocollo può essere comodamente eseguito per un periodo di 2,5-3 settimane: la prima settimana dedicata alla pulizia e sterilizzazione del vetrino, alla crescita del biofilm e alla fissazione del campione; la seconda settimana per la colorazione dei campioni e il protocollo PmbExM stesso, e la terza per il montaggio dei campioni e l'acquisizione delle immagini. Inoltre, considera 1 settimana di preparativi preliminari per i materiali e le soluzioni richieste. I dettagli sui reagenti, i materiali, le attrezzature e il software impiegati in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

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Figura 1: Ancoraggio, polimerizzazione, digestione e dialisi del protocollo PmbExM per il successo dell'espansione, dell'osservazione e dell'analisi del biofilm di P. mirabilis . La colonna di sinistra identifica sei stati del campione in corrispondenza di passaggi selezionati durante il protocollo di espansione. Si parte dal campione di biofilm fissato, permeabilizzato e colorato, seguendo quattro stati intermedi fino allo stato finale gelificato ed espanso, pronto per la microscopia e l'analisi delle immagini in super-risoluzione. La matrice EPS del biofilm è mostrata in verde, la parete cellulare batterica è rappresentata da linee viola, la struttura generale della cellula proteica è mostrata in grigio e il polimero ExM acrilammide-acrilato è mostrato come linee blu ondulate. Tutti gli enzimi coinvolti nel processo sono rappresentati dai simboli di Pac-Man: 3 glicoside-idrolasi (verde) per l'idrolisi degli esopolisaccaridi: α-amilasi, cellulasi e liticasi; mutanolisina (viola) per la degradazione della parete cellulare del peptidoglicano; e proteinasi K (grigia) per la digestione generale delle proteine. I colori dei simboli di Pac-Man corrispondono alle rispettive strutture di destinazione. Tutti gli oggetti mostrati con bassa opacità o bordi tratteggiati rappresentano uno stato di degradazione enzimatica. Questa figura è modificata da Castagnini, D. et al.3. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Pulizia e sterilizzazione di vetrini coprioggetti per la formazione di biofilm

  1. Ultrasuoni vetrini coprioggetti da 12 mm in idrossido di sodio 1 M per 20 minuti a temperatura ambiente e quindi risciacquare con abbondante acqua deionizzata.
  2. Ultrasuoni sui vetrini coprioggetti in etanolo al 70% (v/v) per 15 minuti a temperatura ambiente e quindi risciacquare con etanolo al 95% (v/v).
  3. Lasciare asciugare i vetrini coprioggetti all'aria a temperatura ambiente.
  4. Sterilizzare in autoclave.

2. Crescita del biofilm di Proteus mirabilis

  1. Coltivare P. mirabilis in 10 mL di brodo di Luria Bertani (LB) per 24 ore a 37 °C senza agitare.
    NOTA: In questo studio è stato acquisito e impiegato un ceppo di tipo P. mirabilis disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali), ma è incoraggiato l'uso di qualsiasi ceppo di P. mirabilis prontamente disponibile.
  2. Prelevare 1 mL dalla coltura e aggiungerlo a 9 mL di brodo LB fresco e sterile per generare una sospensione batterica di diluizione 1:10.
  3. Verificare che la densità ottica (OD) a 600 nm della sospensione batterica 1:10 sia 0,1. Se necessario, regolare aggiungendo piccoli volumi di coltura fresca di LB o P. mirabilis fino a raggiungere OD600 = 0,1.
  4. Introdurre vetrini coprioggetti in vetro da 12 mm (precedentemente puliti e sterilizzati) in una piastra sterile di polistirene a 24 pozzetti (un vetrino coprioggetti per pozzetto).
    NOTA: Assicurarsi che l'intera superficie del vetrino coprioggetti tocchi il fondo del pozzetto. Il biofilm si formerà sul lato del vetrino coprioggetti, che è rivolto verso l'alto.
  5. Seminare i pozzetti della piastra con 350 μL di sospensione batterica OD600 = 0,1.
    NOTA: Si consiglia di seminare solo i pozzetti interni della piastra, riempiendo i pozzetti esterni (cioè i pozzetti nelle file A e D e nelle colonne 1 e 6) con acqua sterile o brodo LB. Questo perché i pozzetti esterni sono soggetti a tassi di evaporazione del liquido più elevati rispetto ai pozzetti interni, il che influisce sulla crescita del biofilm.
  6. Posizionare la piastra seminata all'interno di un'incubatrice e posizionarla con un'inclinazione di 45 gradi.
    NOTA: Utilizzare materiale di laboratorio comune come provette da centrifuga da 50 ml o scatole di puntali per micropipette. La posizione inclinata consentirà la formazione di un'interfaccia aria-liquido sulla superficie dei vetrini coprioggetti in cui il biofilm di P. mirabilis stabilirà la sua regione più spessa.
  7. Lasciare formare i biofilm per 48 ore a 37 °C, senza agitare.
    NOTA: Questa configurazione di crescita del biofilm non è adatta per tempi di incubazione superiori a 48 ore a causa dell'essiccazione del biofilm dovuta all'evaporazione del terreno.

3. Fissazione e conservazione del campione di biofilm

  1. Rimuovere con cautela il terreno di coltura dai pozzetti e lavare delicatamente i vetrini coprioggetti contenenti biofilm due volte con 300 μl di soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS) per 5 minuti a temperatura ambiente con un'agitazione molto lieve.
    NOTA: Evitare la distruzione dei biofilm con lo scambio ripetitivo di fluidi utilizzando piccoli volumi per incubazioni o lavaggi. 300-400 μL di liquido sono sufficienti per immergere i biofilm in una piastra a 24 pozzetti. Si consiglia vivamente un pipettaggio lento e metodico, oltre a evitare di colpire direttamente i biofilm con le soluzioni scambiate.
  2. Rimuovere con cautela il PBS e sostituirlo con 400 μl di paraformaldeide (PFA) al 4% (p/v) in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente per il fissaggio del biofilm.
  3. Rimuovere il PFA e sostituirlo con 300 μl di PBST all'1% (1% v/v Triton X-100 in PBS) per la permeabilizzazione cellulare. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  4. Sostituire la soluzione di PBST all'1% con 300 μl di PBST allo 0,3% (3% v/v Triton X-100 in PBS). Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Rimuovere il PBST allo 0,3% e sostituirlo con 300 μl di una miscela 50:50 di metanolo e PBST allo 0,3% per la disidratazione del campione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente e quindi sostituire la miscela con 1 mL di metanolo assoluto.
    NOTA: Aggiungere 1 ml di metanolo lentamente, dirigendolo contro le pareti del pozzetto. Questo volume più elevato di metanolo viene utilizzato per impedirne la completa evaporazione durante la conservazione del campione.
  6. Conservare i campioni a -20 °C per almeno 1 giorno e fino a un mese.
    NOTA: Si consiglia di sigillare le piastre utilizzando un film di cera flessibile per ritardare l'evaporazione del metanolo e l'essiccazione dei campioni.
  7. Dopo l'uso, reidratare in sequenza i campioni sostituendo il metanolo con 300 μl di una miscela 50:50 di metanolo e PBST 0,3%, e quindi con 300 μl 0,3% PBST, a temperatura ambiente.

4. Colorazione fluorescente del biofilm

  1. Incubare i campioni di biofilm reidratati con 300 μL di 50 μg/mL di coniugato di lectina fluorescente agglutinina agglutinina germe di grano (di seguito denominato semplicemente coniugato WGA; vedere la Tabella dei materiali) in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente per la colorazione della parete cellulare/capsula/esopolisaccaridi.
    NOTA: Si prega di consultare gli argomenti pertinenti relativi alla colorazione fluorescente nella sezione Discussione. D'ora in poi, proteggete i campioni dalla luce.
  2. Rimuovere la soluzione coniugata WGA e lavare delicatamente due volte con 300 μL di PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.

5. Passaggi PmbExM

  1. Ancoraggio MA-NHS e polimerizzazione acrilammide-acrilato
    1. Incubare i campioni di biofilm colorati con 400 μL di 1 mM di acido metacrilico N-idrossisuccinimidil estere (MA-NHS) in PBS per 1 ora a temperatura ambiente con lieve agitazione.
      NOTA: MA-NHS è un estere attivato che è soggetto a idrolisi in un mezzo acquoso, quindi trattare i campioni immediatamente dopo aver preparato 1 mM in soluzione PBS.
    2. Eseguire tre lavaggi delicati di 10 minuti con 300 μL di PBS a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere il PBS e sostituirlo con 300 μL di soluzione monomerica. Incubare per una notte (O.N.) a 4 °C.
    4. Costruisci le precamere di gelificazione. Usa un vetrino come base e posiziona su di esso due pezzi di nastro biadesivo piegato che fungano da distanziatori da 400 μm. Disporre i distanziatori a 8-10 mm l'uno dall'altro.
      NOTA: Vedere la Figura 2A per ulteriori chiarimenti su come costruire la precamera di gelificazione. Il nastro biadesivo utilizzato qui aveva uno spessore di circa 100 μm, quindi è stato rifilato e piegato su se stesso per creare distanziatori di 3 mm x 5 mm x 0,4 mm. Misurare lo spessore del nastro biadesivo disponibile e disporlo di conseguenza. L'assorbimento della soluzione gelificante da parte dei distanziatori del nastro è trascurabile. In alternativa al nastro biadesivo, i vetrini coprioggetti rotondi da 12 mm possono essere incollati insieme a gocce d'acqua e impilati fino all'altezza desiderata.
    5. Disporre le camere a umido per proteggere i campioni dall'essiccazione durante la polimerizzazione.
      NOTA: Una comune scatola di puntali per micropipette può essere facilmente convertita in una camera umida rimuovendo l'impalcatura di plastica dei puntali e sostituendola con salviette di carta bagnate.
    6. Preparare un nuovo volume madre di soluzione gelificante mescolando accuratamente volumi di soluzione monomerica, rispettivamente 10 % (p/v) N, N, N', N'-tetrametiletilendiammina (TEMED), 0,5 % (p/v) 4-idrossi-TEMPO (4-HT) e 10 % (p/v) persolfato di ammonio (APS) in proporzione 47:1:1:1. Miscelare l'APS con il resto dei reagenti della soluzione gelificante solo quando sono stati completati i passaggi fino al punto 5.1.5.
      NOTA: Il volume totale della soluzione gelificante madre da preparare dipenderà dalla quantità di campioni di biofilm che vengono elaborati. Ad esempio, per elaborare tre campioni di biofilm, preparare 900 μL di soluzione gelificante mescolando 846 μL di soluzione monomerica con 18 μL di TEMED al 10 % (p/p), 18 μL di 4-HT allo 0,5 % (p/p) e 18 μL di APS al 10 % (p/p). Per evitare una polimerizzazione prematura, l'APS deve essere aggiunto per ultimo alla miscela e solo quando i campioni, le precamere di gelificazione e le camere umide sono pronti per essere utilizzati. Durante questa fase, mantenere tutti i reagenti menzionati e la soluzione gelificante preparata di recente raffreddata.
    7. Subito dopo aver preparato la soluzione gelificante, rimuovere delicatamente la soluzione monomerica e sostituirla con 300 μl della prima. Incubare a 4 °C per 5 min.
    8. Mentre è in corso il passaggio 5.1.7, rimuovere la copertura protettiva rimanente delle strisce di nastro biadesivo disposte sui vetrini e, nello spazio tra di esse, posizionare 40 μL di soluzione gelificante.
    9. Al termine del passaggio 5.1.7, rimuovere ciascun vetrino coprioggetti contenente biofilm dal suo pozzetto e posizionarlo sopra la goccia di 40 μl di soluzione gelificante precedentemente posata su un vetrino. Orientare il vetrino coprioggetti in modo che il biofilm sulla sua superficie entri in contatto con la soluzione gelificante.
    10. Terminare la costruzione della camera di gelificazione premendo delicatamente sul vetrino coprioggetto contenente biofilm utilizzando una pinzetta per assicurarne l'aderenza ai distanziatori del nastro biadesivo.
      NOTA: Questa configurazione a sandwich è costituita da quella che viene chiamata camera di gelificazione (Figura 2B).
    11. Lasciare polimerizzare i campioni all'interno di una camera umida e incubare per 2 ore a 37 °C senza agitazione.
    12. Visualizzare i campioni al microscopio a fluorescenza (vedere il passaggio 6.2.1) senza smontare le camere di gelificazione per l'acquisizione dell'immagine pre-espansione.
      NOTA: Non lasciare i campioni gelificati fuori dalla camera umida per più di un'ora, poiché i gel pre-espansi sono soggetti a essiccazione, il che rende il campione inutilizzabile. Si prega di consultare il passaggio SF2.3 (File supplementare 2) per le procedure di acquisizione pre-espansione pertinenti.
    13. Smontare le camere di gelificazione e tagliare il gel in eccesso attorno alla regione di interesse nel campione di biofilm utilizzando una lama chirurgica.
      NOTA: Si consiglia vivamente di tagliare i gel per facilitare la manipolazione e il montaggio di campioni espansi. Inoltre, per tenere traccia dell'orientamento spaziale della regione di interesse all'interno dei campioni, tagliare i gel in una forma asimmetrica o lasciare un caratteristico ritaglio nel gel per un facile riconoscimento dell'orientamento corretto.
    14. Posizionare i vetrini coprioggetti che trasportano i gel tagliati all'interno di una nuova piastra a 24 pozzetti, con il gel rivolto verso l'alto.
      NOTA: In questa fase, i campioni gelificati devono rimanere aderenti al vetrino originale del vetrino.
  2. Digestione enzimatica I-III e colorazione del DNA
    NOTA: L'omogeneizzazione delle proprietà meccaniche dei campioni di biofilm di P. mirabilis segue una serie di digestioni enzimatiche che gli autori hanno classificato in 3 fasi, in base alla struttura biologica che si vuole degradare: idrolisi dei polisaccaridi (Digestione I), idrolisi dei peptidoglicano (Digestione II) e idrolisi delle proteine (Digestione III).
    1. Digestione I
      1. Immergere i campioni in 1 mL di soluzione per digestione di α-amilasi. Incubare il N.O. a 50 °C.
        NOTA: Grandi volumi (ad es. 0,5-1 mL) di soluzione enzimatica vengono utilizzati per prevenire l'essiccazione del campione a causa dell'elevata temperatura di incubazione.
      2. Rimuovere la soluzione di α-amilasi e lavare i gel per 5 minuti a temperatura ambiente con 300 μL di tampone per la digestione della cellulasi.
      3. Rimuovere il tampone di digestione della cellulasi e sostituirlo con 500 μL di soluzione di digestione della cellulasi. Incubare per 2 ore a 45 °C.
      4. Rimuovere la soluzione di digestione della cellulasi e lavare i gel per 5 minuti a temperatura ambiente con 300 μL di tampone per digestione liticasi.
      5. Rimuovere il tampone di digestione lyticase e sostituirlo con 500 μl di soluzione di digestione lyticase. Incubare per 2 ore a 30 °C.
    2. Digestione II
      1. Rimuovere la soluzione digestiva di lyticase e lavare i gel per 5 minuti a temperatura ambiente con 300 μL di tampone per la digestione della mutanolisina.
      2. Rimuovere il tampone per la digestione della mutanolisina e sostituirlo con 1 mL di soluzione per la digestione della mutanolisina. Incubare il N.O. a 55 °C.
    3. Digestione III
      1. Rimuovere la soluzione digestiva di mutanolisina e lavare i gel per 5 minuti a temperatura ambiente con 300 μL di tampone digestivo proteinasi K. Rimuovere il tampone di digestione della proteinasi K e sostituirlo con 500 μL di soluzione di digestione della proteinasi K. Incubare per 2 ore a 37 °C.
    4. (FACOLTATIVO) Colorazione del DNA
      1. Rimuovere la soluzione di proteinasi K e lavare i gel con 300 μL di 10x PBS per 5 minuti a temperatura ambiente.
      2. Rimuovere il PBS 10x e sostituirlo con 300 μL di colorante di acido nucleico fluorescente rosso da 5 μM in 10x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
        NOTA: Vedere la sezione Discussione per commenti sulla colorazione del DNA per le procedure ExM.
  3. Espansione
    1. Rimuovere la soluzione di proteinasi K (o la soluzione di colorazione del DNA se è stato eseguito il passaggio facoltativo 5.2.4) e trasferire i gel in una piastra di Petri da 60 mm. Mettere un gel per ogni capsula di Petri.
      NOTA: Utilizzare un piccolo pennello piatto per spingere il gel sul vetrino coprioggetti. Con le pinzette da laboratorio, afferra il vetrino coprioggetto e usalo come piattaforma per il gel. Evitare che il gel cada dal vetrino coprioggetti con l'aiuto del pennello quando lo si solleva dal pozzetto della piastra. Evita che i gel si pieghino su se stessi.
    2. Riempire la capsula di Petri con acqua deionizzata in eccesso, immergere completamente il gel e incubare in leggera agitazione a temperatura ambiente per 20 minuti. Scambia l'acqua 4-5 volte.
      NOTA: Si noti che il gel espandibile diventa praticamente invisibile quando viene immerso in acqua. Posizionare la piastra di Petri in controluce per facilitare la localizzazione del gel per evitare di danneggiarlo con l'aspirazione della pipetta o micropipetta Pasteur durante i cambi d'acqua.

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Figura 2: Camera di gelificazione e montaggio del campione. (A) Camera di pregelificazione. Su una slitta, posizionare 2 distanziatori di nastro biadesivo (gialli). Un vetrino coprioggetti (figure-protocol-3 = 12 mm) si trova sopra come riferimento di distanza. (B) Camera di gelificazione. Il biofilm batterico (verde) si forma sulla superficie inferiore del vetrino. I distanziatori di 400 μm di spessore (arancione) sono realizzati con ritagli di nastro biadesivo di 100 μm di spessore. I distanziatori consentono al gel di incorporare l'intero campione ed evitare il trabocco della soluzione gelificante dai bordi della camera, impedendo che il campione venga schiacciato tra il vetrino e il vetrino coprioggetti. (C) Camere di imaging stampate in 3D (visitare il seguente link per accedere ai file .stl https://github.com/scianlab/ExM). Un campione di gel espanso (a sinistra) e un campione di gel espanso immersi in acqua deionizzata (a destra). I gel espansi diventano praticamente invisibili quando vengono immersi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Osservazione e analisi

  1. Montaggio di campioni espansi
    1. Preparare le camere di imaging con rivestimento in poli-lisina per l'immobilizzazione del campione durante l'imaging11: Immergere la superficie di vetro della camera di imaging (vedere la tabella dei materiali) con poli-L-lisina allo 0,1% (p/v) per 20 minuti a temperatura ambiente.
    2. Rimuovere la soluzione di poli-L-lisina ed eseguire due lavaggi con eccesso di acqua deionizzata. Lasciare asciugare all'aria per 1 ora o posizionare all'interno di un'incubatrice a 37 °C per accelerare il processo di essiccazione.
    3. Dopo il quinto ciclo di dialisi dal passaggio 5.3.2, rimuovere l'acqua che copre i gel e utilizzare un piccolo pennello piatto per spingere il campione su un vetrino coprioggetti di 24 mm x 50 mm. Usa il vetrino coprioggetti rettangolare come piattaforma per il gel e sollevalo dalla capsula di Petri.
    4. Rimuovere l'acqua in eccesso dal gel utilizzando carta velina per evitare che l'acqua blocchi il contatto diretto tra la superficie del gel e il rivestimento in polilisina sulla superficie di vetro della camera di imaging.
    5. Posizionare con cura il gel sulla superficie di vetro della camera di imaging, evitando la ritenzione di bolle d'aria tra il gel e il vetro.
      NOTA: La superficie in vetro della camera di imaging deve essere completamente asciutta. Se sono state scattate immagini pre-espansione, considerare un orientamento corretto del gel espanso per facilitare la ricerca dei campi visivi precedentemente acquisiti nel campione pre-espanso.
    6. Aggiungere acqua deionizzata fino a quando il gel non è completamente immerso (vedere la Figura 2C).
      NOTA: I gel espansi devono rimanere idratati durante l'intero processo di imaging per evitare il restringimento durante l'acquisizione.
  2. Acquisizione delle immagini
    1. Visualizzate e acquisite immagini dei campioni su un microscopio a fluorescenza a diffrazione limitata disponibile.
      NOTA: Gli autori hanno utilizzato un microscopio confocale a disco rotante, con un obiettivo a immersione in acqua 63x di apertura numerica (NA) di 1,2. Per l'eccitazione del fluoroforo è stata utilizzata una linea laser a stato solido a 488 e 647 nm. Le acquisizioni sono state effettuate con una fotocamera CMOS digitale a 16 bit controllata da un software proprietario (vedi Tabella dei materiali). La dimensione del voxel è stata impostata su 64,4 mm x 64,4 mm x 200 nm (assi XYZ ).
  3. Elaborazione di immagini
    1. Fare riferimento al File supplementare 2 per trovare una routine di elaborazione digitale delle immagini per la segmentazione dei batteri (sezione SF2.1), la misurazione della larghezza cellulare (sezione SF2.2), la determinazione dell'EF (sezione SF2.3) e la corrispondenza delle immagini per condizioni pre-espanse ed espanse (sezione SF2.4).

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Risultati

PmbExM ha ampliato il biofilm di P. mirabilis di 4,3 volte e ha preservato la morfologia e la topologia
La Figura 3A-D evidenzia l'ingrandimento fisico delle cellule del biofilm di P. mirabilis e l'aumento della risoluzione portato dalla tecnica. Inoltre, questo non è stato osservato solo in regioni di biofilm sottili dove le cellule si organizzano in un layout simile a un monostrato, ...

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Discussione

Passaggi critici di PmbExM
Come per qualsiasi variante ExM, una delle fasi più critiche del protocollo è l'omogeneizzazione delle proprietà meccaniche del campione. Nel caso del PmbExM, questo si ottiene attraverso una serie di trattamenti enzimatici. Una digestione insufficiente può causare bassi EF e potenziali danni alla morfologia e/o alla topologia del biofilm, portando a una risoluzione non ottimale e a risultati inaffidabili. Al contrario, digestioni troppo agg...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse finanziari o personali relativi a questo lavoro.

Ringraziamenti

Gli autori estendono la loro gratitudine al Dr. Juan Eduardo Rodríguez e al Prof. Dr. Ulrich Kubitschek (U-Bonn) per il loro contributo all'implementazione delle tecniche di espansione presso SCIAN-Lab. Questo lavoro è stato finanziato dai progetti ANID ICM P09-015-F (SH, DC, KP, JJW), FONDECYT 1211988 (SH, DC, KP), FONDECYT 3220832 (JJW), FONDEQUIP EQM210020 (DC, KP, JJW, JT, NCH, PS, SH); Núcleo SELFO NCN2024_068 (SH, KP, JJW), CORFO 16CTTS- 66.390, MINEDUC grant RED 21994 (SH), BASAL FB210005 (SH), DAAD 57519605 (SH, NC), Centro CTI230006 (SH), FONDEF ID 23I10337 (SH) e Regional Binational Project Cooperación SUR-SUR AUCI / AGCID BIL-URY-2019-661 (SH, NCH, PS, MJG).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
&alfa;-amilasi da Bacillus sp.Sigma-Aldrich 10070Digestione di polisaccaridi
0,1% (p/v) soluzione acquosa di poli-L-lisina Sigma-AldrichP8920Immobilizzazione del campione per l'imaging
Vetrini coprioggetti in vetro da 12 mmChemglass Life SciencesCLS-1760Componente della camera di gelificazione
Fotocamera C13440-20CU a 16 bitHamamatsu FotonicaNon disponibileFotocamera digitale CMOS per l'acquisizione di immagini
Vetrini coprioggetti in vetro da 24 mm x 50 mmChemglass Life SciencesCLS-1764Manipolazione/manipolazione dei campioni
Camera di imaging stampata in 3DDesigninterno-Opzionecamera di imaging
4-idrossi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-ossile (4-idrossi-TEMPO)Sigma-Aldrich176141Componente della soluzione gelificante
Piastra con fondo in vetro a 6 pozzetti con pareti nereCelVisP06-1.5H-NOpzione camera di imaging
Acido acetico Sigma-Aldrich818755Componente tampone enzimatico
acrilammide Sigma-AldrichA4058Componente della soluzione monomerica
Persolfato di ammonioSigma-AldrichA3678Componente della soluzione gelificante
Microscopio Axiovert 200ZeissNon disponibileMicroscopio confocale
Cloruro di calcioSigma-AldrichC8106Componente tampone enzimatico
C-Apocromatico 63x 1,2 NA obiettivo ad immersione in acquaZeissNon disponibileObiettivo per microscopio
Cellulasi da Aspergillus nigerSigma-Aldrich 22178Digestione polisaccaridica
Chamlide CMB Camera di imaging magnetica a piastra da 35 mmStrumento a cellule viveNon disponibileOpzione camera di imaging
DimetilsolfossidoSigma-Aldrich472301MA-NHS soluzione stock di reagenti di ancoraggio 
Fosfato disodicoSigma-AldrichS3264Componente tampone enzimatico
EtanoloSigma-AldrichE7023Pulizia e sterilizzazione
Acido etilendiamminotetraaceticoMerck324503Componente tampone enzimatico Piastre
a 24 pozzetti in polistirene FalconCorning351147Piattaforma per procedure generali
SoftwareFIJINational Institutes ofHealth-Softwareelaborazione delle immagini
GlycerolSigma-AldrichG7893Componente tampone enzimatico
Guanidina cloridratoThermo Scientific24115Componente tampone enzimatico
Huygens SoftwareScientific Volume Imaging-Deconvoluzionesoftware per il ripristino delle immagini
Acido cloridricoSupelco1.00317Preparazione del tampone
Kimwipes carta velinaFisher Scientiffic06-666Rimozione dell'acqua in eccesso
Pinzette da laboratorioMicroscopia elettronicaScienze M5EManipolazione/manipolazione generale dei campioni
Luria Bertani brodoInvitrogen12795-027Terreno di crescita del biofilm
Lyticase da Arthrobacter luteusSigma-Aldrich L4025Digestione dei polisaccaridi
Cloruro di magnesioSigma-AldrichD5652Componente tampone enzimatico
Acido metacrilico N-idrossisuccinimidil estereSigma-Aldrich730300Reagente di ancoraggio
MetanoloSigma-Aldrich32213Disidratazione e conservazione dei campioni
MicrobeJ --Plug-in del software di elaborazione delle immagini
Vetrini per microscopiaChemglass Life SciencesCG-8221Componente della camera di gelificazione
Fosfato monosodicoSigma-AldrichS9638Componente tampone enzimatico
Mutanolisina da Streptomyces globisporusSigma-Aldrich M990Digestione del peptidoglicano
N, N, N', N'-tetrametiletilendiamminaSigma-AldrichT7024Componente della soluzione gelificante
N,N′-metilenbisacrilammideSigma-AldrichM1533Componente della soluzione monomerica
Nunc 40,4 mm con fondo di vetroThermo Fisher12-567-400Opzione camera di imaging
ParaformaldeideSigma-Aldrich158127Fissazione del campione
Soluzione salina tampone fosfatoSigma-Aldrich79383Componente della soluzione monomerica, lavaggio, tampone enzimatico
Proteinasi K da Engyodontium albumInvitrogen25530-031Digestione proteica
Proteus mirabilis ATCC 12453Microbiologics0440PSoggetto dello studio
Piccolo pennello piattoNegozio di ferramentalocale-Manipolazione/manipolazione dei campioni
Acetato di sodioSigma-Aldrich241245Componente tampone enzimatico
Acrilato di sodioSigma-Aldrich408220Componente soluzione monomerica
Bicarbonato di sodioSigma-AldrichS5761Componente tampone enzimatico
Cloruro disodioSigma-AldrichS9888Componente della soluzione monomerica, componente tampone enzimatico
Idrossido di sodioSigma-Aldrich221465Pulizia dei vetrini
Linea laser a stato solidoOmicronNon disponibile488, 568 e 647 nm Linea laser di eccitazione
SYTO 61 colorazione con acido nucleicoInvitrogenS11343Colorante
fluorescente Tris(idrossimetil)amminometano cloridratoSAFC108219Componente tampone enzimatico
Triton X-100Sigma-AldrichX100Permeabilizzazione del campione, componente tampone enzimatico
Software di acquisizione Volocity 7.0.0QuorumTechnologies-Microscoy
Sistema di dischi rotanti Volocity ViewVoxPerkin-ElmerNon disponibileSistema di dischi rotanti per confocali microscopio
Agglutinina del germe di grano – Alexa Fluor 488 coniugato di lectina fluorescenteInvitrogenW11261Colorante fluorescente
di Software di acquisizione

Riferimenti

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