Articolo metodologico

Studio della morte cellulare programmata indotta da nanoparticelle di rame nei batteri

DOI:

10.3791/67951

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16 maggio 2025

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1Department of Laboratory Medicine and Biotechnology, College of Medicine, Tzu Chi University, 2Graduate Institute of Microbiology, College of Medicine, National Taiwan University, 3Department of Biological Sciences, Missouri University of Science and Technology

In questo articolo

Sommario

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Le nanoparticelle di rame agiscono come agenti antimicrobici generando specie reattive dell'ossigeno. Qui vengono presentate le procedure che dimostrano che le nanoparticelle di rame sono efficaci contro tre agenti patogeni clinicamente rilevanti e che alcune vie di morte cellulare programmata sono coinvolte in questo processo battericida.

Abstract

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Recentemente, le preoccupazioni per i patogeni multiresistenti ai farmaci e le infezioni incurabili sono aumentate a causa dell'uso eccessivo e improprio di antibiotici. I nanomateriali, come le nanoparticelle metalliche e di ossidi metallici, hanno guadagnato popolarità nel campo biomedico come potenziali nuove strategie per combattere i patogeni multiresistenti. Questo studio ha studiato l'uso di nanoparticelle di rame (CuNP) come battericida contro tre comuni agenti patogeni opportunistici acquisiti in ospedale - Escherichia coli (E. coli), Acinetobacter baumannii (A. baumannii) e Staphylococcus aureus (S. aureus) - che stanno sviluppando sempre più resistenza ai farmaci. Vengono presentati protocolli dettagliati per la sintesi di CuNP di due dimensioni (20 nm e 60 nm) e per la valutazione della loro efficacia battericida attraverso saggi di colonie. I meccanismi d'azione antimicrobica alla base delle CuNP sono stati esplorati valutando i cambiamenti nella produzione di specie reattive dell'ossigeno. Inoltre, sono stati applicati quattro modulatori che inibiscono le funzioni delle proteine umane per studiare il potenziale coinvolgimento delle vie di morte cellulare programmata (PCD) nell'uccisione batterica. Attraverso questo approccio, viene suggerita la potenziale comparsa di ceppi resistenti al rame, basandosi sulla ricerca sulle proteine dell'omeostasi del rame, compresi i regolatori trascrizionali rame-dipendenti. Questi risultati forniscono una metodologia completa per studiare gli effetti battericidi delle CuNP e il loro potenziale ruolo nell'affrontare la resistenza agli antibiotici.

Introduzione

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I batteri resistenti ai farmaci sono una seria causa di preoccupazione in medicina. La loro rapida comparsa ha ridotto l'efficacia degli antibiotici convenzionali, con conseguenti complicanze cliniche maggiori. Rappresentano una grave minaccia per la salute pubblica e creano un urgente bisogno di nuovi agenti antimicrobici. Una via di ricerca sono i nanomateriali. I nanomateriali possiedono proprietà fisico-chimiche uniche che consentono loro di interagire con i microbi in modi che ne compromettono la vitalità. Ad esempio, le nanoparticelle d'argento (AgNP) inducono stress ossidativo nei batteri, con conseguente disfunzione proteica, rottura della membrana, danni al DNA e, infine, morte cellulare1. Le nanoparticelle d'oro (AuNP), d'altra parte, sono note per le loro proprietà antimicotiche e possono migliorare l'effetto battericida degli antibiotici fungendo da vettori2.

Inoltre, anche le nanoparticelle di rame (CuNP) hanno attirato una notevole attenzione grazie al loro potente effetto antimicrobico e al basso costo di produzione. Gli studi suggeriscono che le CuNP mostrano un'attività battericida ad ampio spettro attraverso l'interruzione dell'attività enzimatica e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS)3. La carica positiva delle CuNP ne facilita la penetrazione nei batteri, migliorandone l'assorbimento cellulare4. Questo meccanismo rende le CuNP un'opzione promettente per il rivestimento superficiale, ad esempio sugli impianti, per prevenire le infezioni3. Una scoperta interessante, tuttavia, è che l'effetto battericida delle CuNP sembra essere dipendente dalle dimensioni. Alcuni studi hanno scoperto che le CuNP più piccole mostrano una maggiore attività antibatterica, probabilmente a causa del loro superiore rapporto superficie/volume5.

La generazione di ROS provoca danni diffusi a cellule e batteri, tra cui perossidazione lipidica, disfunzione proteica, frammentazione del DNA e inibizione della gluconeogenesi/glicogenolisi, ed è coinvolta nella necrosi o morte cellulare programmata (PCD)6,7,8. Studi recenti hanno rivelato che i sistemi PCD esistono nei batteri, con modalità d'azione ed effettori simili a quelli dei sistemi eucariotici9. Le comunità batteriche possono indurre la PCD in risposta allo stress, incluso lo stress ossidativo, attraverso un sistema tossina-antitossina (TA)10. In termini semplici, il sistema tossina-antitossina è costituito da tossine che possono interrompere i processi cellulari essenziali e antitossine che possono formare complessi stabili con le tossine per inibire la loro tossicità in condizioni di crescita normali. La maggior parte dei batteri e degli archei contiene loci TA nei loro genomi, spesso presenti in più copie di DNA extracromosomico e cromosomico. Esistono diversi tipi di sistemi TA, con il tipo II TA (noto come modulo MazE/MazF) di particolare interesse. In condizioni di stress, le antitossine vengono degradate, consentendo alle tossine di inibire i loro bersagli cellulari. In E. coli e S. aureus, la tossina MazF viene attivata in risposta a condizioni di stress come lo stress ossidativo, l'alta temperatura e la carenza di aminoacidi. Di conseguenza, l'espressione dell'antitossina MazE si riduce, rilasciando la tossina MazF10. Gli studi hanno scoperto che MazF consente la sintesi di proteine che consentono a una piccola sottopopolazione di sopravvivere in condizioni avverse, mentre la maggior parte della popolazione subisce la morte cellulare mediata da mazEF. Questa morte cellulare può essere ROS-dipendente, dove i ROS inducono l'inibizione trascrizionale o traduzionale, o ROS-indipendente, dove il danno al DNA innesca le vie di morte11.

Questo studio esplora i meccanismi attraverso i quali le CuNP inducono la morte batterica. Piuttosto che concentrarsi esclusivamente sul sistema TA, quattro modulatori PCD, precedentemente utilizzati nella nostra ricerca 7,12, sono stati impiegati per studiare potenziali percorsi PCD nei batteri.

Esaminando gli effetti battericidi di CuNP di due diverse dimensioni (20 e 60 nm) a concentrazioni variabili e utilizzando metodi come saggi di colonie, rilevamento di ROS e modulatori della PCD (SBI, Z-VAD, NSA e Wortmannin), questa ricerca evidenzia che la PCD non è esclusiva degli organismi multicellulari, ma si verifica anche nelle comunità batteriche sotto stress. Fornendo protocolli dettagliati, questo lavoro mira a consentire ai ricercatori di valutare l'efficacia delle CuNP e i meccanismi battericidi nei propri sistemi. Inoltre, questi risultati fanno progredire la comprensione della PCD batterica e supportano lo sviluppo di terapie a base di CuNP per combattere i batteri resistenti agli antibiotici.

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Protocollo

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I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione della nanoparticella di rame

  1. Ottenere nanopolveri di rame commerciali (25 nm e 60-80 nm) da una fonte commerciale.
  2. Utilizzare 1,0 mM di sodio dodecil solfato (SDS) come disperdente per due dimensioni di nanoparticelle da 1 mg/mL.
  3. Disperdere le nanoparticelle utilizzando un bagno ad ultrasuoni per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Le nanoparticelle completamente disperse sono quindi pronte per l'uso negli esperimenti successivi.

2. Preparazione dei batteri

  1. Procuratevi E. coli (Migula) Castellani e Chalmers ceppo 25922 e A. baumannii ceppo Bouvet e Grimont dall'American Type Culture Collection. Ottieni S. aureus dal Centro di raccolta e ricerca delle biorisorse.
  2. Coltura dei batteri in brodo di Luria-Bertani (LB) in condizioni aerobiche a 37 °C.
  3. Diluire le colture batteriche in terreno LB a una densità ottica a 600 nm (OD600) di circa 0,5.

3. Valutazione della vitalità cellulare

  1. Saggio delle colonie
    1. Utilizzare soluzioni stock di CuNP (1 mg/mL) per preparare varie concentrazioni di due dimensioni di CuNP, tra cui 0 μg/mL, 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL e 100 μg/mL.
    2. Dividere le colture batteriche preparate al punto 2.3 in provette da microcentrifuga e centrifugare a 3300 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
    3. Trattenere i pellet batterici e aggiungere diverse concentrazioni di due dimensioni di CuNP, rispettivamente, con un pipettaggio delicato.
    4. Trattare i pellet batterici con PBS e alcol al 70% rispettivamente come controlli negativi e positivi.
    5. Incubare tutti i batteri trattati agitando a 200 giri/min a 37 °C per 24 ore.
    6. Dopo l'incubazione, lavare tutti i batteri trattati con PBS e distribuirli su piastre di agar LB. Mettere le piastre in un'incubatrice a 37 °C per 24 ore.
    7. Conta il numero di colonie in ciascun gruppo di trattamento il giorno successivo ed esegui l'analisi statistica. Si consiglia di eseguire questa operazione in triplice copia per garantire l'accuratezza statistica.
  2. Studio del meccanismo battericida
    1. Preparare i batteri come descritto al punto 3.1.2 e trattarli con 5 μM di SBI-0206965 (SBI) per 2 ore, 0,5 μM di necrosulfonamide (NSA) per 1 ora, 100 nM di wortmannina (mosto) per 30 minuti o 100 nM di Z-VAD-FMK (Z-VAD) per 30 minuti.
    2. Co-trattare i batteri con diverse concentrazioni di due dimensioni di soluzioni di CuNP, come descritto nel passaggio 3.1.1, in presenza o assenza di 5 μM di SBI, 0,5 μM di NSA, 100 nM di mosto e 100 nM di Z-VAD.
    3. Centrifugare i batteri dopo i trattamenti modulatori (passaggio 3.2.1) e rimuovere i surnatanti.
    4. Risospendere i pellet batterici nelle soluzioni preparate al punto 3.2.2 e incubarli agitandoli a 200 giri/min a 37 °C per 24 ore.
    5. Trattare i batteri con etanolo al 70% e PBS come controlli positivi e negativi, rispettivamente. Utilizzare una soluzione senza CuNP come controllo in bianco CuNP (0 μg/mL; mock) nelle stesse condizioni di inibitore per ciascun gruppo. Incubare tutti i campioni per altre 24 ore.
    6. Dopo l'incubazione, aggiungere il reagente di vitalità cellulare alle colture con un rapporto di volume di 1:10. Incubare le colture per altre 2 ore agitando a 37 °C.
    7. Centrifugare le colture (passaggio 3.1.2) dopo 2 ore di incubazione. Trasferire i surnatanti fluorescenti in piastre a 96 pozzetti. Misura la fluorescenza utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 560 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 590 nm con un lettore di micropiastre.
    8. Diluire il surnatante rimanente a 10-5 e 10-4 e distribuirlo su piastre di agar LB per la coltivazione.
    9. Conta le singole colonie il giorno seguente.

4. Rilevamento di specie reattive dell'ossigeno

  1. Preparare le colture batteriche come descritto al punto 2.3 e dividerle in provette da microcentrifuga.
  2. Trattare i batteri con varie condizioni di stress come gruppi di controllo positivi che inducono ROS (dati non mostrati nei risultati). I trattamenti sono descritti nelle fasi 4.2.1-4.2.4.
    1. Esporre i batteri alla luce UV a 405 nm per 3 ore. Incubare i batteri a 45 °C per 2 ore.
    2. Successivamente, incubare i batteri a 4 °C per 2 ore.
    3. Trattare i batteri con il 3% di H2O2 per 30 min.
    4. Mantenere i batteri a 37 °C in brodo LB come controllo negativo.
  3. Preparare varie concentrazioni di CuNP come descritto al punto 3.1.1 e trattare i batteri con CuNP da 20 nm o 60 nm a concentrazioni di 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL e 100 μg/mL per 24 ore.
  4. Lavare i batteri incubati due volte con PBS per rimuovere eventuali nanoparticelle rimanenti.
  5. Preparare il colorante 2′,7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato (H2DCFDA) in PBS a una concentrazione finale di 5 μM.
  6. Risospendere i pellet batterici in 5 μM di H2DCFDA e misurare l'intensità della fluorescenza a 520/30 nm di emissione utilizzando un citometro a flusso.
    NOTA: L'intensità della fluorescenza verde FL1 è correlata al livello di ROS nella coltura trattata. Si consiglia di eseguire questa operazione in triplice copia per l'accuratezza statistica.

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Risultati

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Attività antimicrobiche di CuNP di due dimensioni in tre patogeni
Tre patogeni opportunisti (E. coli, S. aureus e A. baumannii) sono stati utilizzati per testare le attività battericide delle CuNP. I batteri sono stati trattati con 0 μg/mL, 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL e 100 μg/mL di CuNP da 20 nm o 60 nm e le attività battericide sono state determinate utilizzando la concentrazione battericida minima (MBC) derivata dalla conta delle colonie. I nostri risultati hanno...

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Discussione

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Questo studio ha studiato gli effetti antimicrobici e i meccanismi delle CuNP a due dimensioni e varie concentrazioni contro E. coli, S. aureus e A. baumannii. Utilizzando i protocolli stabiliti, è stato osservato che gli effetti battericidi indotti da CuNP coinvolgono lo stress ossidativo e la potenziale attivazione della PCD. Tuttavia, l'interazione tra l'omeostasi dei metalli e le risposte allo stress batterico rimane in gran parte inesplorata. Studi precede...

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Dichiarazioni

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L'autore dichiara di non avere alcun conflitto di interessi, finanziario o di altro tipo.

Ringraziamenti

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Siamo grati per il supporto del Core Facility Center, Tzu Chi University, Taiwan.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acinetobacter baumannii ceppo Bouvet e GrimontAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA17978Batteri per l'esperimento di toxocità
CuNP Bio-Rad iMark Lettore di micropiastreBio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA168-1130Utilizzato per misurare l'assorbanza nei saggi di vitalità batterica.
2',7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato perreso da cellule  (H2DCFDA)Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USAD6883Utilizzato per la rilevazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle cellule batteriche trattate.
Nanoparticelle di rame (CuNPs) 25 nmSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA774081Utilizzato per preparare la soluzione madre di CuNP
Nanoparticelle di rame (CuNPs) 60-80 nmSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA774103Utilizzato per preparare la soluzione madre di CuNP
Escherichia coli (Migula) Castellani e ChalmersAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA25922Batteri per l'esperimento di tossia CuNP
Citometro a flusso di GalliosBeckman Coulter, Brea, CA, USAUtilizzato per l'analisi citometrica a flusso in molteplici esperimenti, compreso il rilevamento di specie reattive dell'ossigeno.
LB agarFocusBio, Miaoli, TaiwanLBA500Utilizzato per la coltura di batteri
Luria-Bertani (LB) brodoBecton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA244620Utilizzato per la coltura di batteri
Necrosulfonamide (NSA)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA480073Utilizzato come modulatore per il pretrattamento negli studi sulla via di morte batterica.
PrestoBlue Cell Viability ReagentInvitrogen, Carlsbad, CA, USAP50200Utilizzato per valutare la vitalità cellulare tramite fluorescenza.
SBI-0206965 (SBI)BioVision, Milpitas, CA, USA9580Utilizzato come modulatore per il pretrattamento negli studi sulle vie di morte batteriche.
Sodio dodecil solfato (SDS)Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USAL4509Utilizzato come disperdente per nanoparticelle di rame per ridurre l'aggregazione.
Staphylococcus aureusAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA
Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Hsinchu, Taiwan		13567Batteri per l'esperimento di tossia CuNP
Lettore di micropiastre multimodale Varioskan LUXThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAVLBLATGD2Utilizzato per misurare la fluorescenza nei saggi di vitalità cellulare
Wortmannin (Wort)Abcam, MA, USAab120148Utilizzato come modulatore per il pretrattamento negli studi sulla via di morte batterica.
Z-VAD-FMK (Z-VAD)sigma-aldrich, St. Louis, MO, USAV116Utilizzato come modulatore per il pretrattamento negli studi sulle vie di morte batteriche.

Riferimenti

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