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Articolo metodologico

Somministrazione orofaringea di bleomicina nel modello murino di fibrosi polmonare

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DOI:

10.3791/67953

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9 maggio 2025

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary & Critical Care, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Medicine, Pulmonary & Critical Care Section, VA Greater Los Angeles Healthcare System, 3Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo dimostra la tecnica di aspirazione orofaringea per l'uso nel modello murino di bleomicina di fibrosi polmonare.

Abstract

La malattia polmonare interstiziale (ILD) rappresenta un ampio spettro di malattie caratterizzate dalla cicatrizzazione progressiva e spesso irreversibile del parenchima polmonare, la più comune delle quali è la fibrosi polmonare idiopatica (IPF). Sono stati sviluppati diversi modelli animali di IPF, con il modello murino di bleomicina che è il più utilizzato. La bleomicina è un chemioterapico noto per indurre danni al DNA nell'epitelio alveolare, con conseguente danno polmonare acuto e fibrosi polmonare nell'uomo. I modelli di IPF nei roditori utilizzano la somministrazione di bleomicina attraverso vari metodi, il più comune dei quali è quello intratracheale (IT). Recentemente, la tecnica di aspirazione orofaringea (OA) ha dimostrato di essere altrettanto efficace dell'IT per più agenti fibrosanti, con un numero considerevolmente inferiore di effetti collaterali e una via di somministrazione più semplice. Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo OA di somministrazione della bleomicina nel polmone murino ed evidenzia esempi di potenziali applicazioni a valle per la quantificazione dei dati. Questa metodologia offre un modo semplice, rapido e sicuro per utilizzare questo modello animale ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi molecolari alla base dell'IPF.

Introduzione

La malattia polmonare interstiziale (ILD) si riferisce a un gruppo eterogeneo di malattie caratterizzate da cicatrici progressive e irreversibili dello spazio alveolico, dell'interstizio e delle vie aeree distali1. La fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è la forma più comune di ILD e comporta una sopravvivenza mediana di circa tre anni2. L'IPF è una condizione terminale, con il trapianto di polmone ortotopico che è una terapia di salvataggio per pazienti selezionati. Attualmente esistono due terapie approvate dalla FDA per l'IPF, entrambe le quali si limitano a rallentare il tasso di progressione piuttosto che stabilizzare o migliorare la funzione polmonare per i pazienti 3,4. Sono in corso significativi sforzi di ricerca per chiarire le basi dell'IPF e identificare nuovi bersagli terapeutici. Esistono una miriade di modelli animali per studiare la patogenesi dell'IPF, ognuno con i propri vantaggi e svantaggi5. Sebbene nessun modello sia in grado di ricapitolare completamente la complessità della malattia umana, questi approcci offrono una visione significativa dei meccanismi molecolari dell'IPF e possono integrare gli studi traslazionali.

Il modello murino di bleomicina rimane il modello in vivo più utilizzato e ben caratterizzato di IPF6. La bleomicina è un agente peptidico che induce rotture del DNA a singolo e doppio filamento. Dopo la sua scoperta nel 1962, la bleomicina si è rivelata efficace nel trattamento di una serie di tumori, tra cui i tumori testicolari e il linfoma, tuttavia il suo uso è stato limitato dalla polmonite dose-dipendente e dalla conseguente fibrosi polmonare 7,8. Questa tossicità polmonare è ricapitolata nei topi. Se somministrata in una singola dose, dopo una fase infiammatoria iniziale, la fibrosi può essere osservata a partire dal giorno 5, con un picco nei giorni 14-21 9,10,11 (Figura 1). La risoluzione spontanea si verifica dopo circa 6 settimane, anche se è possibile ottenere cambiamenti fibrotici permanenti con dosaggi ripetitivi12. Data la natura transitoria e infiammatoria, ci sono alcuni inconvenienti intrinseci con il modello13 della bleomicina, tuttavia offre un sistema rapido, robusto e riproducibile per iniziare a rispondere ad alcune delle principali lacune nella comprensione dell'ILD nel nostro campo e consente ai ricercatori di confrontare i risultati negli ultimi cinque decenni. Altri approcci all'installazione includono i modelli murini di asbestosi e silice, che offrono corsi temporali simili (giorni 14-28)6,14,15,16. Tuttavia, questi modelli generano un pattern istologico più coerente con la pneumoconiosi rispetto all'IPF e richiedono l'uso di particolato atmosferico, richiedendo un'attenta manipolazione. In alternativa, esistono modelli animali che utilizzano l'espressione transgenica guidata dall'epiteliale, come la tossina difterica e il TGF-β1. Questi ricapitolano il danno non infiammatorio delle cellule epiteliali alveolari di tipo 2 osservato nell'IPF, tuttavia richiedono un po' più di tempo (21-30d) e richiedono l'uso di animali specializzati che devono essere reincrociati in qualsiasi modello transgenico esistente di interesse. Infine, è stato dimostrato che la sovraespressione adenovirale-mediata di citochine, tra cui TGF-β1, IL-β1 e TNF-α, induce fibrosi polmonare nei roditori, tipicamente entro il giorno 14 17,18,19. Questi modelli di sovraespressione delle citochine consentono una comoda somministrazione intranasale, sebbene richiedano un'attenta purificazione e manipolazione.

Esistono diversi approcci per la somministrazione di bleomicina, tra cui via intratracheale (IT), intranasale, intraperitoneale, sottocutanea ed endovenosa6. La somministrazione di IT è il metodo più comune, tradizionalmente coinvolto nell'intubazione endotracheale o nella tracheostomia chirurgica20, che richiedono entrambe una sedazione profonda, finezza tecnica e sono associate a morbilità e mortalità perioperatoria. Recentemente, la tecnica di aspirazione orofaringea (OA) ha dimostrato di essere altrettanto efficace dell'IT, con un numero considerevolmente inferiore di effetti collaterali e una via di somministrazione più semplice 14,21,22,23,24,25,26. Qui, presentiamo un protocollo visivo dettagliato per il metodo OA di somministrazione di bleomicina nel polmone murino e evidenziamo varie potenziali applicazioni a valle per la quantificazione dei dati.

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Protocollo

Gli studi sugli animali descritti in questi esperimenti sono stati condotti secondo i protocolli (ARC-2021-025, ARC-2010-039) approvati dall'UCLA Animal Research Committee (ARC) e dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). È stata mantenuta la piena conformità con tutte le normative e le politiche statali e federali relative all'uso degli animali da laboratorio. Gli animali sono stati ospitati nella struttura per la cura degli animali dell'UCLA e curati dal personale qualificato della Divisione di Laboratorio e Medicina Animale (DLAM) dell'UCLA in condizioni prive di agenti patogeni. I topi Wildtype C57BL/6 sono stati ottenuti commercialmente e lasciati acclimatare per almeno 14 giorni. Per questi studi sono stati utilizzati topi maschi di età compresa tra 8 e 12 settimane, con un peso corporeo medio di 20-25 g. Possono essere utilizzati anche topi femmine, sebbene sia importante per far corrispondere il sesso e l'età degli animali in gruppi e condizioni sperimentali27. I dettagli commerciali degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Somministrazione orofaringea di bleomicina

  1. Preparazione della bleomicina
    NOTA: Utilizzare bleomicina di grado farmaceutico per garantire coerenza e riproducibilità tra animali ed esperimenti. Dose di bleomicina in unità di farmaco per kg di animale (U/kg), non in milligrammi (mg) per kg.
    1. Sciogliere la polvere di bleomicina in PBS sterile di grado farmaceutico a una concentrazione stock di 10 U/mL. La bleomicina deve essere preparata sotto una cappa chimica utilizzando adeguate precauzioni chemioterapiche. Conservare le aliquote a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
    2. Prepara la concentrazione di lavoro finale. La dose si basa sul peso (0,5-3 U/kg) e gli aggiustamenti necessari vengono apportati a seconda della bleomicina utilizzata e dello scopo dell'esperimento (ad esempio, sopravvivenza o dosaggio letale).
    3. Regolare il volume finale di somministrazione in base alle esigenze. Per questi studi, diluire la bleomicina a 0,375 U/mL, che equivale a 50 μL per un topo di 25 g, ottenendo una concentrazione di lavoro finale di 0,75 U/kg.

2. Induzione dell'anestesia

  1. Preparare il cocktail di anestesia diluendo la ketamina e la xilazina in PBS a concentrazioni di lavoro rispettivamente di 10 mg/mL e 1 mg/mL. Eseguire questo passaggio in condizioni sterili utilizzando reagenti di grado farmaceutico e in conformità con i protocolli approvati dall'istituto.
  2. Somministrare 10 μl del cocktail per grammo di peso corporeo dell'animale (concentrazione di lavoro: ketamina 100 mg/kg, xilazina 10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale utilizzando un ago da 27,5 G e una siringa da 1 mL.
    1. Assicurarsi che il mouse sia adeguatamente anestetizzato e non risponda a stimoli nocivi, come il pizzicamento delle dita dei piedi. Gli effetti dovrebbero essere visibili entro 5 minuti. Se ancora reattivo, somministrare ulteriore ketamina/xilazina con incrementi di 20 μl fino a raggiungere il livello di anestesia desiderato. Applicare un unguento oftalmico per prevenire la secchezza oculare durante l'anestesia.
      NOTA: La ketamina è preferita rispetto ad altri anestetici e sedativi iniettati grazie al suo profilo di effetti collaterali favorevoli. Ha effetti minimi sull'emodinamica, compresa la frequenza cardiaca e la frequenza respiratoria. L'isoflurano per via inalatoria può essere utilizzato come agente anestetico alternativo. In questi studi, la ketamina/xilazina è preferita perché provoca una sedazione prolungata e una tosse o reflusso minimi di bleomicina dopo la somministrazione.

3. Somministrazione orofaringea

  1. Una volta sedato correttamente, sospendere il topo sulla piattaforma procedurale con un angolo di 60°-80° appendendolo per gli incisivi anteriori per aprire efficacemente l'orofaringe (Figura 2A).
  2. Occluda il passaggio nasale con un morsetto microvascolare liscio, costringendo il topo a respirare attraverso la sua orofaringe.
  3. Ritrarre la lingua fuori dall'orofaringe usando una pinza.
  4. Utilizzando una pipetta passo-passo con punta stub leur-stub, posizionare delicatamente il volume desiderato di bleomicina, o controllo salino, nella parte posteriore dell'orofaringe. Assicurarsi che una bolla di liquido sia visibile grossolanamente (Figura 2B).
  5. Continua a tenere la lingua in posizione finché l'animale non aspira la soluzione. Questo dovrebbe essere visibile e spesso udibile.
    NOTA: Se l'animale aspira rapidamente la soluzione, la visualizzazione nella parte posteriore dell'orofaringe può essere transitoria, entro pochi secondi. Indipendentemente da ciò, in caso di successo, l'animale dimostrerà un cambiamento brusco e transitorio nel suo schema respiratorio, facendo respiri rapidi e superficiali. Può verificarsi un gorgogliamento del liquido, che indica ulteriormente che il fluido è entrato con successo nel tratto respiratorio inferiore. Occasionalmente può verificarsi anche tosse. Questo è solitamente un volume trascurabile della soluzione di bleomicina e non dovrebbe influenzare i risultati sperimentali, consentendo all'animale di rimanere incluso nello studio. Evitare dosaggi ripetitivi, in quanto aumentano il rischio di asfissia e alterano il dosaggio finale in base al peso.
  6. Dopo che l'aspirazione è stata confermata, rimuovere con cautela la clip nasale.
  7. Osservare l'animale in posizione sospesa per 15-30 s per assicurarsi che non vi sia reflusso della soluzione di bleomicina, quindi rimetterlo nella sua gabbia.
    NOTA: Si raccomanda un volume massimo di 50 μl per ridurre al minimo il rischio di asfissia. A seconda della dose desiderata di bleomicina e del peso del topo, regolare la concentrazione della soluzione di bleomicina secondo necessità. Quando si pratica questa tecnica, utilizzare un colorante a base d'acqua come il blu di Evans per confermare che la soluzione viene somministrata nel tratto respiratorio inferiore, piuttosto che nello stomaco14.

4. Recupero degli animali

  1. Dopo il trattamento, posizionare l'animale su un fianco nella sua gabbia con un termoforo sottostante per mantenere la termoneutralità.
  2. Monitora i topi fino a quando non sono completamente coscienti. Questo richiede in genere 1-2 ore, a seconda della dose di ketamina utilizzata e del metabolismo dell'animale. Pizzicare delicatamente le dita dei piedi e mantenere gli animali eutermici per facilitare il risveglio.
  3. Monitorare clinicamente i topi su base giornaliera per i cambiamenti nel peso corporeo, nella toelettatura, nel livello di attività e nello stato respiratorio. Analogamente ad altri metodi di somministrazione di bleomicina, gli animali possono sperimentare una significativa perdita di peso nel corso di 14-21 giorni, che è un indicatore chiave dell'efficacia del modello.
  4. Secondo i protocolli ARC e IACUC, sopprimere gli animali se la perdita di peso supera il 20% del peso iniziale dell'animale. La prevalenza e la gravità della perdita di peso dipendono dalla dose di bleomicina utilizzata e dai dati demografici dei topi (vedi sopra).

5. Raccolta, lavorazione e analisi dei tessuti

  1. A seconda della domanda sperimentale e del momento desiderato, sopprimere i topi seguendo i protocolli IACUC e prelevare i loropolmoni 28 al momento opportuno. Gli effetti della bleomicina sono spesso grossolanamente evidenti rispetto al controllo, indicando una somministrazione di successo. In questi studi, i topi sono stati sacrificati nei giorni 7, 14 e 21.
  2. Per l'istologia, sezionare i polmoni in blocco e fissarli in PFA al 4% per 24 ore. Procedere con l'inclusione di paraffina, il sezionamento, l'ematossilina e l'eosina (H&E) e/o la colorazione tricromica di Masson come precedentemente descritto 28,29,30.
  3. Per la misurazione del collagene, omogeneizzare il polmone destro e utilizzare un kit disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) per misurare il contenuto di idrossiprolina come descritto in precedenza31.
  4. Per la citometria a flusso, digerire il polmone destro utilizzando il dissociatore tissutale e una soluzione enzimatica per ottenere una sospensione unicellulare. Eseguire la colorazione e l'analisi citofluorimetrica come descritto in precedenza 32,33,34.

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Risultati

Il protocollo qui descritto riassume la via di somministrazione dell'aspirazione orofaringea nel modello murino di bleomicina. In questi esperimenti, gli animali sono stati trattati con bleomicina (0,75U/kg di peso corporeo) o PBS per il controllo fittizio. Nei giorni 7, 14 e 21, i topi sono stati soppressi, i loro polmoni espiantati e il tessuto riparato, come precedentemente descritto35. La fibrosi è stata valutata utilizzando la colorazione istologica con ematossilina ed eosina (H&E). Entro...

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Discussione

Viene fornito un protocollo video dettagliato sulla tecnica di aspirazione orofaringea per la somministrazione di bleomicina da utilizzare nel modello murino di fibrosi polmonare. Inoltre, evidenziamo le potenziali applicazioni a valle per quantificare i cambiamenti fibrotici e infiammatori indotti dalla bleomicina OA.

Sebbene nessun animale riassuma completamente la complessità della malattia umana, il modello murino di bleomicina è stato utilizzato negli ult...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH Ruth L. Kirchstein National Research Service Award (NRSA) Institutional Research Training Grant (T32) assegnato a RW (2T32HL072752-16). Gli autori desiderano anche riconoscere il sostegno del Saul and Joyce Brandman Foundation Lung Health Center.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
anti-topo CD45, Brlliant Violet 605BioLegend103155
anti-topo CD64, AlexaFluor 647BioLegend139322
anti-topo Ly6G, AlexaFluor 700BioLegend127622
anti-topo MerTK, PE/Cy7BioLegend151522
anti-topo SiglecF, PEBD Biosciences552126
Adattatori BD Luer-StubFisher Scientific13-681-21
BleomicinaMcKesson1129996da NorthStar Rx 16714088601
Kit per intubazione endotracheale del topoKent ScientificETI-MSE
Fixable Live/Dead VioletThermoL34955
FlowJo v10 SoftwareFlowJo
gentleMACS DissociatoreMiltenyi130-093-235
Kit di dosaggio dell'idrossiprolinaSigmaMAK463
Liberase TMRoche5401127001
Morsetto per vasi MoriaStrumenti per la scienza fine18350-11
Kit per intubazione endotracheale per topoKentETI-MSE
Pipetta passo-passoDymaxTI15469
Topi Wildtype C57BL/6Jackson LaboratoriesJAX, colorante #000664

Riferimenti

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