Articolo metodologico

Isolamento rapido di vescicole extracellulari derivate dal latte materno umano

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DOI:

10.3791/67954

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14 novembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics/Division of Neonatology and Center of Glial Biology in Medicine, University of Alabama at Birmingham School of Medicine, 2School of Health Professions/Department of Clinical and Diagnostic Sciences, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Biological Sciences, Alabama State University, 4Department of Pediatric Surgery, Washington University-St. Louis

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo è progettato per accelerare e consentire l'isolamento efficace delle vescicole extracellulari dal latte materno umano con elevata purezza.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV), particelle di dimensioni nanometriche di circa 20-1000 nm, stanno rapidamente attirando l'attenzione per il loro potenziale terapeutico. In particolare, è stato dimostrato che le vescicole extracellulari derivate dal latte materno umano (HBMDEV) conferiscono protezione in modelli sperimentali di enterocolite necrotizzante, una malattia intestinale che colpisce principalmente i neonati prematuri, con conseguente mortalità fino al 50%. Tuttavia, le tradizionali tecniche di isolamento delle vescicole extracellulari, come l'ultracentrifugazione differenziale, la cromatografia ad esclusione dimensionale, ecc., richiedono molto tempo o una strumentazione specializzata, nessuna delle quali è pratica in ambito clinico. Pertanto, è necessario un metodo di isolamento semplice che consenta una rapida somministrazione reattiva di HBMDEV ai pazienti. Qui viene proposta una combinazione di centrifugazione del latte materno umano per rimuovere il grasso e i detriti cellulari, accoppiata con una rapida ultrafiltrazione del latte scremato rimanente che produce vescicole extracellulari funzionali e ad alta resa. L'uso di questa tecnica può consentire l'uso di HBMDEV come opzione terapeutica pratica in ambito clinico.

Introduzione

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle ubiquitarie di circa 20-1000 nm di dimensione, sia attraverso le vie endosomiali (quando i corpi microvescicolari si fondono con la membrana plasmatica, che facilita il rilascio del carico cellulare nello spazio extracellulare) sia attraverso le vie della membrana plasmatica (cioè la gemmazione). Le vescicole extracellulari contengono carico cellulare ospite come lipidi, proteine, acidi nucleici, vari metaboliti e altri contenuti a seconda della loro fonte. Inoltre, le vescicole extracellulari sono importanti nella comunicazione intercellulare, nell'angiogenesi, nella soppressione immunitaria, nel rimodellamento del microambiente tumorale, nella progressione del cancro, ecc.1,2,3,4. In particolare, il latte materno umano (HBM) è ricco di EV e facilmente accessibile dalle madri che allattano5. Recentemente, le vescicole extracellulari derivate dal latte materno umano (HBMDEV) hanno attirato l'attenzione come vettori terapeutici per il trattamento della malattia 1,2. I neonati prematuri o con basso peso alla nascita sono suscettibili a diverse infezioni, tra cui l'enterocolite necrotizzante. L'enterocolite necrotizzante, caratterizzata da necrosi ileale o del colon, varia da una lieve infiammazione intestinale a un'insufficienza multisistemica d'organo con un tasso di mortalità infantile fino al 50%6. Il pre-trattamento con EVs derivate dal latte materno è sufficiente per proteggere dall'infiammazione intestinale in modelli sperimentali di NEC in vitro e in vivo 2,7. Pertanto, l'utilizzo di HBMDEV può essere un'opzione praticabile per il trattamento della NEC in contesti clinici.

Nonostante le promesse terapeutiche degli HBMDEV, ci sono limiti noti nell'utilizzo delle attuali tecniche di isolamento, in quanto richiedono molto tempo o attrezzature specializzate, nessuna delle quali è universalmente pratica per l'ambiente clinico. Il "gold standard" dell'isolamento delle vescicole extracellulari prevede diversi cicli di ultracentrifugazione differenziale che, sebbene producano una resa soddisfacente delle vescicole extracellulari, possono influire sulla loro integrità strutturale e funzionalità 8,9. Inoltre, i tempi di ultracentrifugazione possono essere di almeno 2 ore, una risorsa costosa in ambito clinico9. I kit di isolamento hanno dimostrato di far risparmiare tempo e di essere in qualche modo convenienti. Tuttavia, l'isolamento con tali metodi comporta anche bassi rendimenti e quindi una bassa scalabilità. Pertanto, sono necessarie tecniche di isolamento HBMDEV che consentano di risparmiare tempo ed essere convenienti senza sacrificare la resa dei veicoli elettrici.

Questo protocollo mira a delineare un metodo graduale per isolare rapidamente le vescicole extracellulari da HBM utilizzando strumenti esistenti clinicamente disponibili e approvati dalla FDA. Per ottenere ciò, sono stati utilizzati la centrifugazione standard e un sistema di estensione del filtro di livello clinico per isolare le vescicole extracellulari da HBM. Queste vescicole rientrano nell'intervallo di dimensioni previste, mostrano una morfologia coerente con le vescicole extracellulari note, sono arricchite per i marcatori EV e funzionalmente simili alle vescicole extracellulari isolate utilizzando le tradizionali tecniche di isolamento con ultracentrifugazione. Pertanto, questo protocollo di isolamento delle vescicole extracellulari HBM può consentire un isolamento pratico e rapido e l'applicazione di vescicole extracellulari isolate da HBM in ambito clinico.

Protocollo

Il latte materno è stato raccolto nell'unità di terapia intensiva regionale dell'Università dell'Alabama a Birmingham (UAB). I campioni recuperati sono stati raccolti dopo che il latte materno è stato scongelato per l'uso da parte del paziente e il paziente non è stato in grado di assumere l'intera alimentazione. Questi alimenti vengono normalmente scartati, ma sono stati raccolti per scopi di ricerca. I campioni sono stati raccolti da individui anonimizzati e conservati a -80 °C fino al momento degli esperimenti. La raccolta è stata approvata dal protocollo N160203002 del comitato di revisione interna dell'UAB. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Isolamento delle vescicole extracellulari (ultracentrifugazione differenziale)

  1. In una cappa di biosicurezza, diluire il latte materno 1:10 in PBS sterile in una provetta conica da 15 mL.
  2. Centrifugare il latte materno a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, dovrebbero esserci 3 strati distinti: grasso del latte (strato superiore), siero di latte o latte scremato (strato acquoso intermedio) e cellule e altri detriti (pellettati nella parte inferiore). In una cabina di biosicurezza, filtrare il grasso del latte e gli strati di siero attraverso un filtro da 70 μm (consente una più facile rimozione del grasso) lasciando il pellet indisturbato. Trasferire il flusso in un nuovo tubo.
  3. Centrifugare il campione a 2600 x g per 10 minuti a 4 °C. In questa fase vengono rimossi il grasso del latte, le cellule e i detriti residui. In una cabina di biosicurezza, filtrare il surnatante attraverso un filtro da 70 μm. Trasferire il surnatante in una provetta da ultracentrifuga. Verificare che ci siano almeno 10 ml di liquido nella provetta prima dell'ultracentrifugazione.
  4. Ultracentrifugare il campione a 20.000 x g per 45 minuti a 4 °C. Dopo l'ultracentrifugazione, possono esserci tre strati simili alla fase 1.2: grasso del latte, siero di latte o latte scremato e cellule e altri detriti. In una cabina di biosicurezza, filtrare il grasso del latte e gli strati di siero di latte attraverso un filtro da 70 μm senza disturbare il pellet. Trasferire il surnatante in una provetta conica da 15 mL.
  5. In una cappa di biosicurezza, filtrare il latte materno con una siringa con un filtro da 0,22 μm. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per ultracentrifuga. Verificare che ci siano almeno 10 ml di liquido nella provetta prima dell'ultracentrifugazione.
  6. Ultracentrifugare il campione a 110.000 x g per 70 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 mL di PBS sterile.
  7. Centrifugare nuovamente il campione a 110,00 x g per 70 min a 4 °C.
  8. In una cappa di biosicurezza, risospendere il pellet in 150-200 μL di PBS sterile.

2. Isolamento delle vescicole extracellulari (metodo di filtrazione rapida)

  1. In una cappa di biosicurezza, diluire il latte materno (1:10) in PBS sterile.
  2. Centrifugare il latte materno a 300 x g per 10 minuti a 4°C. Dopo la centrifugazione, dovrebbero esserci tre strati distinti: grasso del latte (strato superiore), siero di latte o latte scremato (strato acquoso intermedio) e cellule e altri detriti (pellettati nella parte inferiore). In una cabina di biosicurezza, filtrare il grasso del latte e gli strati di siero attraverso un filtro da 70 μm (consente una più facile rimozione del grasso) lasciando il pellet indisturbato. Trasferire il flusso in un nuovo tubo.
  3. Centrifugare il campione a 2600 x g per 10 minuti a 4°C. In questa fase vengono rimossi il grasso del latte, le cellule e i detriti residui. In una cabina di biosicurezza, filtrare il surnatante attraverso un filtro da 70 μm. Trasferire il surnatante in una provetta da 15 mL.
  4. In una cappa di biosicurezza, adescare un set di prolunga del filtro da 0,22 μm da 16 pollici con PBS da 5,4 mL.
    1. Per il sistema di prima qualità, prendere 5,4 mL di PBS sterile in una siringa e lavare il sistema fino a quando il PBS non fuoriesce dall'altra estremità del tubo.
  5. La siringa filtra il latte materno attraverso un set di prolunga del filtro da 0,22 μm e 16 pollici. In questa fase vengono rimossi il grasso del latte, le cellule e i detriti residui.
    NOTA: Potrebbe essere necessario più di un set di estensione del filtro a seconda della quantità di detriti presenti nel campione.
  6. Raccogliere il flusso in una provetta conica da 15 mL.

3. Analisi del tracciamento Nanosight

  1. Diluire il campione (1:1000) in PBS sterile. I campioni filtrati rapidamente possono essere utilizzati non diluiti.
  2. Agitare brevemente il campione. Caricare 1 mL del campione in una siringa di tubercolina.
  3. Collegare la siringa all'apparecchio per l'iniezione e fissarla.
  4. Impostare la pompa di iniezione su 50. Accendi la fotocamera per assicurarti che le particelle visualizzate non siano troppe o troppo poche. Assicurarsi che il flusso di particelle sia costante, senza salti o salti improvvisi nel flusso del campione.
  5. Impostare la pompa di iniezione su 100. Eseguire il protocollo.
    NOTA: Il software è stato impostato per essere letto una volta al minuto per un totale di 5 letture.
  6. Leggi l'esempio.
  7. Lava Nanosight tra i campioni con PBS.
    NOTA: È stato utilizzato un sistema di analisi del tracciamento delle nanoparticelle per determinare la dimensione e la concentrazione delle particelle per millilitro. La concentrazione media del campione ultracentrifugato è stata di 3,30 e+08 +/- 4,08 e+06 particelle/mL, mentre il metodo di filtrazione rapida è stato di 5,50e+08 +/- 1,16e+08 particelle/mL.

4. Colorazione negativa di vescicole extracellulari e microscopia elettronica a trasmissione

NOTA: Per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) sono stati utilizzati campioni con concentrazione di esosomi nell'intervallo 10-8.

  1. Griglie EM in rame a rete rivestite con film di carbonio/a a scarica a bagliore per 25 s a 20 mA utilizzando l'apparato di scarica.
  2. Caricare 7 μl della soluzione di sospensione EV sulla rete e incubare per 1 minuto.
  3. Stoppinare l'eccesso con la carta da filtro Whatman assorbendo da sotto la griglia per "tirare" il campione verso la griglia piuttosto che allontanarlo da essa.
  4. Colorare immediatamente il campione con 7 μL di soluzione filtrata di acetato di uranile (UA) all'1% sulla superficie della griglia EM mediante pipetta.
  5. Dopo 15 s, la soluzione di UA in eccesso è stata rimossa dalla griglia a contatto con il bordo della griglia con carta da filtro. Visualizza il campione immediatamente (entro 24 ore) sul TEM a 80 kv.

5. Concentrazione proteica

  1. Precipitato di acetone 250 μl di EV purificate (1:4) per 1 ora a -20 °C.
    NOTA: Utilizzare 100 μl di esosomi purificati per il metodo di ultracentrifugazione.
  2. Centrifugare il campione a 16.000 x g per 30 minuti.
  3. Essiccare il pellet all'aria, quindi ri-sospendere in 100 μL di tampone RIPA.
  4. Seguire il protocollo del kit per il dosaggio delle proteine BCA per determinare le concentrazioni proteiche. L'assorbanza è stata misurata a 562 nm utilizzando un lettore di micropiastre.
    NOTA: 1 mL di latte materno produce normalmente circa 1,3 μg/mL di proteine utilizzando l'ultracentrifugazione e circa 0,2-1 μg/mL di proteine utilizzando la filtrazione rapida.

6. Macchia occidentale

  1. Incubare un campione di proteine da 1 volume con un marcatore a 4 corsie di volume, ridurre il tampone del campione e farlo bollire per 7 minuti a 90°C.
  2. Caricare ed eseguire 10 μg di proteine su un gel SDS 10% a 70 V per 15 minuti. Successivamente, aumentare la tensione a 100 V e farla funzionare per altri 90 minuti.
  3. Trasferire il gel su una membrana di nitrocellulosa utilizzando l'apparecchio semisecco per 30 minuti a 15 V.
  4. Lavare la membrana 3 volte con TBS-0,1% Tween (TBS-T) per 10 minuti ciascuna.
  5. Bloccare la membrana per 30 minuti utilizzando la soluzione tampone bloccante rapido (diluita a 1x).
  6. Incubare l'anticorpo primario (Hsp70-1:1000; CD63-1:1000 e CD9-1:1000) in soluzione tampone 1x, per una notte a 4°C su un bilanciere 10,11,12.
  7. Lavare la membrana tre volte per 10 minuti ciascuna con TBS-T.
  8. Aggiungere (H+L) anticorpo secondario anti-topo coniugato HRP, a una diluizione 1:1000 per tutte le proteine interrogate (Hsp70, CD9 e CD63) in latte al 2% in TBS-T e incubare per 2 ore a temperatura ambiente su un bilanciere.
  9. Lavare la membrana tre volte per 10 minuti ciascuna con TBS-T.
  10. Sviluppa utilizzando ECL (1:1) e filma con lo sviluppatore.

7. Coltura in vitro di cellule IEC-6

  1. Seminare 1,0 x 106 cellule in un pallone T-25 in 5 mL di terreno RPMI completo. Lascia che le cellule aderiscano durante la notte.
  2. Rimuovere il terreno completo e lavare con 1-2 ml di PBS.
  3. Aspirare il PBS e aggiungere 5 ml di RPMI completo senza EV.
  4. Aggiungere una concentrazione finale di 400 μM H2O2 per pozzetto e 10 μg/mL di EV contemporaneamente alle cellule durante la notte.
  5. Rimuovere il terreno e lavare le celle con 1-2 ml di PBS.
  6. Aspirare il PBS e aggiungere 1 ml di tripsina.
    1. Posizionare le cellule nell'incubatore a 37°C per 5 minuti.
  7. Disattivare la tripsina aggiungendo il doppio del volume dell'RPMI completo. Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL e centrifugare a 125 x g per 5 minuti.
  8. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS.
  9. Contare le celle utilizzando un contatore di celle.

Risultati

Isolamento delle vescicole extracellulari mediante ultracentrifugazione e isolamento rapido
Dogmaticamente, l'isolamento delle vescicole extracellulari da HBM comporta la centrifugazione per rimuovere il grasso del latte e altre particelle di grandi dimensioni, seguita da filtraggio, diversi cicli di ultracentrifugazione e risospensione del campione arricchito con vescicole extracellulari in PBS. Il metodo di filtrazione rapida utilizza la centrifugazione per rimuovere il grasso del latte e i detriti cellulari, seguita dalla filtrazione tramite un filtro di estensione del filtro da 0,22 μm, rimuovendo ulteriormente i detriti residui, che produce un campione arricchito con EV paragonabile all'ultracentrifugazione tradizionale (Figura 1).

Caratterizzazione di HBMDEV dal sistema di filtrazione rapida con estensione del filtro
L'analisi di tracciamento Nanosight ha rivelato dimensioni delle particelle comparabili tra gli HBMDEV ultracentrifugati (Figura 2A) e quelli isolati con filtro rapido (Figura 2B). Entrambi i metodi indicano che le vescicole extracellulari isolate hanno una dimensione media di circa 100 nm. Le vescicole extracellulari trasportano vari carichi (ad esempio, proteine, lipidi, miRNA, ecc.) per la secrezione dalle cellule ospiti ai loro vari bersagli. Pertanto, la prima proteina bersaglio esaminata è stata la proteina da shock termico 70 (Hsp70), una proteina nota per essere trasportata attraverso le EV13. L'analisi Western blot mostra che le vescicole extracellulari isolate mediante filtrazione rapida hanno mostrato un'espressione di Hsp70 comparabile a quella isolata mediante ultracentrifugazione (Figura 3A e Figura 1A supplementare). Inoltre, le vescicole extracellulari possono essere identificate attraverso l'espressione superficiale di tetraspanine come CD9 e CD6314. L'analisi del Western blot ha rivelato che le vescicole extracellulari isolate tramite filtrazione rapida esprimono effettivamente CD9 (Figura 3B e Figura 2B supplementare) e CD63 (Figura 3C e Figura 3C supplementare). Infine, l'analisi morfologica degli HBMDEV tramite microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato una morfologia delle vescicole simile tra le due tecniche di isolamento (Figura 4A-D).

Diversi laboratori hanno dimostrato che le vescicole extracellulari conferiscono proprietà protettive che promuovono la sopravvivenza cellulare durante lo stress cellulare 2,3,7. Analogamente ai rapporti pubblicati in precedenza, le vescicole extracellulari isolate con il metodo di filtrazione rapida sono in grado di proteggere le cellule epiteliali intestinali (IEC-6) dalla morte cellulare indotta dal perossido di idrogeno2 (Figura 5A, B). Questi dati suggeriscono che gli HBMDEV isolati con il metodo di filtrazione rapida non solo possiedono qualità paragonabili a quelli isolati con l'ultracentrifugazione differenziale, ma sono anche funzionalmente simili.

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Figura 1: Schema che delinea le differenze tra l'ultracentrifugazione e i metodi di filtrazione rapida per l'isolamento delle vescicole extracellulari dal latte materno umano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Analisi di tracciamento nanosight di vescicole extracellulari isolate dal latte materno umano mediante ultracentrifugazione e metodo di filtrazione rapida. (A) NTA di vescicole extracellulari di latte materno umano (diluite 1:1000 in 1x PBS) isolate mediante ultracentrifugazione. I dati mostrati sono un'unica rappresentazione di 3-4 studi indipendenti. (B) NTA di vescicole extracellulari del latte materno umano isolate mediante filtrazione rapida. I dati mostrati sono un'unica rappresentazione di 3-4 studi indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Analisi Western blot di vescicole extracellulari isolate mediante ultracentrifugazione e filtrazione rapida. (A) Esposizione di un secondo di 10 μg di proteina da shock termico 70 (Hsp70). "L" indica la scala, la "U" l'ultracentrifugazione e la "R" la filtrazione rapida. I campioni ottenuti mediante filtrazione rapida sono stati ulteriormente concentrati mediante centrifugazione a 110.000 × g per 70 minuti, eseguita due volte. L'immagine mostrata rappresenta uno dei quattro studi indipendenti. (B) Esposizione ventiduesima di 10 μg di CD9. "L" indica la scala, la "U" l'ultracentrifugazione e la "R" la filtrazione rapida. I campioni di filtrazione rapida sono stati concentrati mediante centrifugazione a 110.000 × g per 70 minuti, eseguita due volte. L'immagine mostrata rappresenta uno dei quattro studi indipendenti. (C) Esposizione ventiduesima di 10 μg di CD63. "L" indica la scala, la "U" l'ultracentrifugazione e la "R" la filtrazione rapida. I campioni di filtrazione rapida sono stati concentrati mediante centrifugazione a 110.000 × g per 70 minuti, eseguita due volte. L'immagine mostrata rappresenta uno dei quattro studi indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Analisi al microscopio elettronico a trasmissione di vescicole extracellulari isolate mediante ultracentrifugazione e filtrazione rapida. (A) Micrografia elettronica di vescicole extracellulari isolate mediante ultracentrifugazione con ingrandimento di 8.000×. Barra di scala = 800 nm. L'immagine mostrata rappresenta uno dei tre studi indipendenti. (B) Micrografia elettronica di vescicole extracellulari isolate mediante ultracentrifugazione con ingrandimento di 20.000×. Barra della scala = 200 nm. L'immagine mostrata rappresenta uno dei tre studi indipendenti. (C) Micrografia elettronica di vescicole extracellulari isolate mediante filtrazione rapida con ingrandimento di 8.000×. Barra di scala = 800 nm. Le vescicole extracellulari sono state concentrate mediante centrifugazione a 110.000 × g per 70 minuti, eseguita due volte. L'immagine mostrata rappresenta uno dei tre studi indipendenti. (D) Micrografia elettronica di vescicole extracellulari isolate mediante filtrazione rapida a 20.000× di ingrandimento. Barra della scala = 200 nm. Le vescicole extracellulari sono state concentrate mediante centrifugazione a 110.000 × g per 70 minuti, eseguita due volte. L'immagine mostrata rappresenta uno dei tre studi indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Analisi funzionale di vescicole extracellulari isolate mediante ultracentrifugazione e filtrazione rapida. (A) Vitalità cellulare di cellule IEC-6 coltivate in terreno RPMI-1640 completo privo di EV. Le cellule sono state trattate durante la notte con 400 μM H, 2O2 e 10 μg/mL di EV contemporaneamente. I dati mostrati rappresentano uno dei due studi indipendenti. (B) Conta cellulare di cellule IEC-6 coltivate in terreno RPMI-1640 completo privo di EV. Le cellule sono state trattate durante la notte con 400 μM H, 2O2 e 10 μg/mL di EV contemporaneamente. I dati mostrati rappresentano uno dei due studi indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Caratterizzazione Western blot di Hsp70 in vescicole extracellulari isolate mediante ultracentrifugazione e filtrazione rapida. Esposizione di un secondo di 10 μg di proteina da shock termico 70 (Hsp70). "L" indica la scala, la "U" l'ultracentrifugazione e la "R" la filtrazione rapida. I campioni di filtrazione rapida sono stati concentrati mediante centrifugazione a 110.000 × g per 70 minuti, eseguita due volte. Ogni campione rappresenta una singola replica biologica. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 2 supplementare: Caratterizzazione Western blot di CD9 in vescicole extracellulari isolate mediante ultracentrifugazione e filtrazione rapida. Esposizione di cinque minuti di 10 μg di CD9. "L" indica la scala, la "U" l'ultracentrifugazione e la "R" la filtrazione rapida. I campioni di filtrazione rapida sono stati concentrati mediante centrifugazione a 110.000 × g per 70 minuti, eseguita due volte. Ogni campione rappresenta una singola replica biologica. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura 3 supplementare: Caratterizzazione Western blot di CD63 in vescicole extracellulari isolate mediante ultracentrifugazione e filtrazione rapida. Esposizione di dieci minuti di 10 μg di CD63. "L" indica la scala, la "U" l'ultracentrifugazione e la "R" la filtrazione rapida. I campioni di filtrazione rapida sono stati concentrati mediante centrifugazione a 110.000 × g per 70 minuti, eseguita due volte. Ogni campione rappresenta una singola replica biologica. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Le vescicole extracellulari stanno attirando l'attenzione poiché la letteratura suggerisce che possono regolare vari meccanismi infiammatori e possono offrire benefici protettivi 2,7. Tuttavia, un limite all'uso pratico delle vescicole extracellulari in ambito clinico è il tempo necessario per isolare le vescicole extracellulari ed estrarre una resa sufficiente 8,15. Qui è stato delineato un protocollo passo-passo per l'isolamento rapido ed efficiente delle vescicole extracellulari da HBM utilizzando un sistema di filtrazione approvato dalla FDA. L'utilità di questo metodo dimezza i metodi tradizionali di isolamento delle vescicole extracellulari senza sacrificare la resa. Pertanto, questo protocollo potrebbe consentire l'applicazione terapeutica pratica delle vescicole extracellulari derivate dal latte materno umano in un contesto clinico, se la terapia EV dovesse essere approvata nel prossimo futuro.

Gli attuali protocolli di isolamento delle vescicole extracellulari hanno dimostrato una resa costante ed efficace delle vescicole extracellulari dal loro fluido di origine. Tuttavia, i metodi tradizionali di isolamento, che si tratti del gold standard, dell'ultracentrifugazione differenziale o dell'uso di kit commerciali, non sono privi di limiti. L'isolamento delle vescicole extracellulari tramite ultracentrifugazione differenziale, sebbene efficace, richiede molto tempo con protocolli che prevedono tempi di centrifuga combinati di almeno ~3 ore 2,8,15. Il tempo di isolamento, combinato con i protocolli per quantificare correttamente il numero di EV, renderebbe difficile il loro utilizzo in tempi limitati in un contesto clinico. Inoltre, i kit commerciali, sebbene efficaci, sono costosi. Inoltre, il numero di campioni che possono essere processati per kit è basso, dati gli alti costi di questi kit 8,15.

Questo protocollo offre una soluzione a queste limitazioni che consente di risparmiare tempo e denaro senza sacrificare la resa o la purezza dei veicoli elettrici. Affinché questo protocollo sia efficace, ci sono passaggi chiave che devono essere seguiti durante l'esecuzione del protocollo. La diluizione e la centrifugazione iniziale del latte materno umano sono necessarie per la rimozione dei detriti extracellulari e del grasso del latte dal campione di latte. La rimozione di questi detriti è fondamentale per prevenire l'intasamento del sistema di estensione del filtro e quindi evitare di dover utilizzare più filtri per un campione. Inoltre, il lavaggio del sistema di estensione del filtro con PBS è fondamentale in quanto adesca il filtro in preparazione per il campione. L'adescamento aiuta a garantire che il campione non vada perso durante il processo di adescamento. Va notato che, a seconda del contenuto del campione di latte materno, potrebbe essere necessario più di un set di estensione del filtro, indipendentemente dalla diluizione e centrifugazione del campione prima della filtrazione. Nel caso in cui ciò si verifichi, è possibile utilizzare più di un filtro; Tuttavia, il nuovo set di estensione del filtro deve essere innescato prima della filtrazione del campione.

Questo protocollo è efficace e coerente nell'isolare le vescicole extracellulari dal latte materno umano, tuttavia, ci sono un paio di limitazioni da considerare. Sono necessarie le fasi della centrifuga (~20 minuti di tempo totale tra le due rotazioni) prima della filtrazione del campione. I tentativi di filtrare il campione diluito senza centrifugazione porteranno a ripetuti intasamento del sistema di estensione del filtro, alla perdita di campione e all'aggiunta di ulteriore tempo al protocollo di isolamento EV. Inoltre, il campione non era puro, come evidenziato dalle analisi NTA e TEM. I tentativi di utilizzare campioni che non sono stati centrifugati prima della filtrazione possono introdurre contaminanti indesiderati nel campione, che possono produrre effetti fuori bersaglio a seconda della futura applicazione a valle di vescicole extracellulari isolate. Inoltre, questo protocollo è stato implementato solo per quanto riguarda l'isolamento delle vescicole extracellulari dal latte materno umano. Pertanto, l'efficacia di questo protocollo nell'isolamento delle vescicole extracellulari da altri fluidi non è stata studiata. Data la natura acquosa di tutti i fluidi corporei, non si prevede che ci saranno differenze nella purezza e nella resa delle vescicole extracellulari se questo protocollo viene utilizzato per isolare le vescicole extracellulari da altre fonti.

Va inoltre notato che questo protocollo è efficiente nell'isolare piccole vescicole extracellulari (sEV). Secondo NTA, le vescicole extracellulari derivate da HBM avevano una dimensione di ~100 nm, suggerendo che le vescicole extracellulari più grandi non erano presenti nel campione. Il motivo è che i campioni sono stati filtrati utilizzando un filtro da 0,22 μm, che viene utilizzato principalmente per l'isolamento di esosomi e altre vescicole extracellulari più piccole, un obiettivo primario del laboratorio al momento di questo studio. In teoria, l'utilizzo di un filtro con pori di dimensioni maggiori può consentire l'isolamento di vescicole extracellulari più grandi. Tuttavia, queste domande vanno oltre lo scopo di questo studio.

Le vescicole extracellulari derivate dal latte materno umano rappresentano una fonte terapeutica naturale facilmente accessibile per uso clinico. Una limitazione all'introduzione del lavoro sulle vescicole extracellulari in ambito clinico è l'isolamento delle vescicole extracellulari in un metodo pratico che qualsiasi struttura potrebbe potenzialmente utilizzare. Questo protocollo è progettato per superare tale limitazione e può essere facilmente applicato in ambito ospedaliero e implementato utilizzando un sistema di filtrazione esistente di livello ospedaliero, approvato dalla FDA, disponibile in commercio, o può essere acquistato per molto meno rispetto all'ultracentrifuga standard. Questo metodo è economico e produce un campione puro e ricco di vescicole extracellulari da un sistema di filtrazione già utilizzato in ambito clinico.

Dichiarazioni

L'autore (o gli autori) ha dichiarato di non avere potenziali conflitti di interesse in relazione alla ricerca, alla paternità e/o alla pubblicazione di questo articolo.

Ringraziamenti

Le immagini e le figure sono state generate utilizzando biorender.com. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dalla UAB High Resolution Imaging Facility. Questo lavoro è stato supportato da NIH/NICHD 5R21HD104481.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(H+L) Anti-topo coniugato HRPBio-Rad1721011
(H+L) Anti-coniglio coniugato HRPBio-Rad1706515
Filtro a siringa 0,20Fisherbrand09-719C
Filtro a 0,70 di cellule umCorning431751
1,5M Tris HCLRealizzati internamente
Tubi da 15 mLFalcone352096
Set di estensione filtro da 16 polliciB-BRAUNFE2012F
1M Tris HCLTeknovaT1068
1x PBSGibco10010-031
Tubi da 50 mLFalcone353070
Buffer di campione riducente 5xThermo Scientific39000
AcilamideFisher Scientifc BP1410-1
Anfotericina BGibco15290-018
AMT NanoSprint43 Mark-IIAMT
Anti-AntiGibco15240-062
Anti-CD63NovusbioNBP2-32830
Anti-CD9Invitrogen10626D
APSThermo Scientific17874
Kit per il test proteico BCAPierce23227
Tubi BeckmanBeckman coulter 344059
BrightStar ECL ChemiluminescenteAlkali ScientificXR92
FBS esgotata da esosomiFisher ScientificNC0464480
Buffer di blocco rapidoPierce37575
Siero bovino fetaleLife Technologies10082147
Hsp70InvitrogenMA3-006
Insulina umanaSigma-AldrichI9278-5ML
Perossido di idrogenoFisher ScientificH325-500
IEC-6 ATCCCRL-1592
JEOL 1400 FLASH TEMJEOL USA Inc
Buffer di campione riducente a traccia di corsiaThermo Scientific39000
Latte in polvereBioworld30620074-1
Nanosight NS 300Malvern Instruments Ltd.
Membrana di nitrocellulosaTecnologie vitali88018
Apparecchio di scarica PELCO easiGlowTed Pella
Mini compresse inibitori della proteasiPierceA32955
Buffer RIPAPierce89901
RPMI 1640Fisher Scientifc 11875119
SDSFisher Scientifc BP2436-200
Fiaschetta T-25Thermo Scientific156367
TBSRealizzati internamente
TEMEDBio-Rad161-0801
Tripsina EDTAGibso25200-056
Preadolescenti 20Thermo ScientificJ20605-AP

Riferimenti

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  15. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).

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