Articolo metodologico

Un saggio TCID50, senza etichetta, senza etichetta, a dose infettiva in coltura tissutale al 50% e senza marcature che utilizza impedenza per la quantificazione automatica dei titoli virali

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DOI:

10.3791/67956

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9 gennaio 2026

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1Agilent Technologies, Inc.

In questo articolo

Sommario

Il test TCID50 qui riportato sfrutta misurazioni di impedenza in tempo reale senza etichetta e il modulo di Virologia del sistema per monitorare oggettivamente gli effetti citopatici (CPE) indotti dal virus in tempo reale. Questo saggio semplificato riduce significativamente il tempo di utilizzo pratico, supportando al contempo misurazioni CPE cinetiche quantitative ad alta produttività e permettendo calcoli TCID50 automatizzati in tempo reale.

Abstract

Misurare il titolo virale, ovvero la concentrazione di un virus in un campione, è una procedura fondamentale nella ricerca virologica. Sebbene essenziali, metodi tradizionali come il test della placca e il test TCID50 possono richiedere tempo, richiedere colorazione o marcatura dei reagenti e spesso richiedono interpretazioni soggettive, soprattutto quando gli effetti citopatici (CPE) sono sottili o difficili da quantificare tramite l'imaging. Ad esempio, i saggi TCID50 possono impiegare coloranti di vitalità come MTT o MTS, mentre i saggi sulle placche si basano su immagini e colorazione per visualizzare le placche virali, entrambe possono introdurre variabilità. Inoltre, questi metodi tradizionali offrono solo un'istantanea statica dell'infettività virale, limitando la capacità di catturare le interazioni dinamiche tra virus e cellule permissive. Per superare le attuali limitazioni nella misurazione del titolo virale, è stato sviluppato un test TCID50 semplificato utilizzando tecnologia basata sull'impedenza per misurare la CPE in modo oggettivo, non invasivo e in tempo reale, eliminando la necessità di etichette. In questo studio, sono stati utilizzati due modelli cellulari permissivi per il virus per validare il saggio impedance-TCID50: l'adenovirus marcato con GFP (Adv-GFP) nelle cellule HEK293A e il virus influenzale A (IAV) nelle cellule MDCK. Il flusso di lavoro è semplice, comprendendo la semina cellulare, l'inoculazione virale, il monitoraggio in tempo reale e l'analisi automatica di TCID50 da parte del software. Durante l'infezione, i valori TCID50 venivano calcolati automaticamente dal software del sistema utilizzando la formula Reed-Muench in tutti i momenti temporali registrati. I valori TCID50 dell'IAV ottenuti tramite letture di impedenza erano comparabili a quelli generati dal saggio convenzionale TCID50 basato su colorazione viola cristallina. Questi risultati dimostrano che la quantificazione del virus può essere realizzata in modo preciso ed efficiente utilizzando la misurazione dell'impedenza in combinazione con il Modulo di Virologia del software del sistema. Il nuovo saggio semplifica i metodi tradizionali offrendo una maggiore comprensione delle dinamiche virali, supportando così la ricerca virologica avanzata e ampliando le potenziali applicazioni cliniche.

Introduzione

Con l'evoluzione rapida della ricerca in virologia, la quantificazione accurata dell'infettività virale rimane fondamentale per comprendere i meccanismi virali, sviluppare terapie antivirali e valutare l'efficacia dei vaccini. Una delle procedure più importanti è la misurazione del titolo virale, ovvero la concentrazione di particelle virali in un campione. Il saggio TCID50, che quantifica il numero di particelle virali infettive necessarie a produrre CPE nel 50% delle cellule inoculate, è uno dei metodi più comunemente utilizzati per determinare il titolo virale funzionale. Questo saggio endpoint ampiamente utilizzato è particolarmente prezioso per i virus che non formano placche e può fungere da alternativa al testdelle placche 1.

In generale, il test TCID50 richiede da 2 a 14 giorni, a seconda del virus e delle cellule permissive. La CPE, inclusi i cambiamenti nella proliferazione cellulare, morfologia e vitalità, viene valutata tramite (1) misurazione colorimetrica dopo l'aggiunta di reagenti, come il test MTT (3-(4,5-dimetiltiazolo-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) e MTS (3-(4,5-dimetiltiazolo-2-il)-5-(3-carbossimetossifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio), utilizzando un lettoredi placche 2, oppure (2) valutazione visiva di cambiamenti morfologici o legati alla coltura utilizzando piattaforme di imaging ottico — ad esempio, valutare la CPE misurando la percentuale diconfluenza 3, oppure (3) la rilevazione visiva della CPE tramite colorazione viola cristallina dopo la fissazione di pozzi trattati con virus con formalina o paraformaldeide (PFA). Il tasso positivo di infezione virale derivato dal numero di repliche CPE-positive a ciascuna diluizione virale è la base per il calcolo TCID50. La diluizione a cui il 50% delle colture presenta CPE viene calcolata statisticamente utilizzando formuleconsolidate 4, come Reed-Muench, Spearman-Karber e Improved-Karber, e il risultato è riportato come TCID50 per millilitro (TCID50/mL).

I tradizionali test TCID50 e quelli sulle placche sono ampiamente riconosciuti come il punto di riferimento per la quantificazione virale funzionale e possono fornire preziose informazioni. Tuttavia, questi saghi sono spesso tediosi, richiedono tempo e richiedono una colorazione manuale per visualizzare la CPE, con conseguente bassa capacità di produzione, maggiori rischi di errore umano e soggettività elevata. Per i virus altamente infettivi o letali, minimizzare il tempo di esposizione ai virus e ridurre i rifiuti contenenti virus tramite ulteriori fasi come la colorazione sono considerazioni importanti per migliorare la biosicurezza. Ad eccezione del test TCID50 basato su immagini senza etichetta, la maggior parte dei test TCID50 e delle placche sono anch'essi test endpoint, il che può portare a tempi subottimali per la valutazione del titolo e limitare la capacità di osservare le interazioni dinamiche tra virus e cellule ospiti. Per superare queste limitazioni, è stato sviluppato e stabilito un test TCID50 semplificato, senza etichette e in tempo reale. Pur essendo concettualmente simile al saggio convenzionale TCID50, il nuovo metodo sfrutta le letture di impedenza cellulare, catturate e analizzate dal sistema MP RTCA, per monitorare l'infezione in modo oggettivo e continuo nel tempo.

È stato dimostrato e verificato che il biosensing basato su impedenza fornisce una lettura composita qualitativa e quantitativa del numero cellulare, della morfologia e della resistenza di attacco cellula-substrato in modo privo di marcature e noninvasivo 5,6. Studi precedenti hanno dimostrato che la CPE indotta da virus può essere quantificata accuratamente in tempo reale utilizzando le misurazioni di impedenza RTCA 7,8,9. Invece di riportare valori grezzi di impedenza, i sistemi utilizzano un parametro senza unità chiamato Indice Cellulare (CI) per riflettere le variazioni di impedenza dovute a eventi cellulari. Ad esempio, man mano che le cellule aderiscono, si diffondono e crescono sul fondo del pozzo, l'IC aumenta. Al contrario, quando le cellule muoiono o si ristringono, o si staccano, come durante un'infezione virale, l'IC diminuisce.

Considerando i promettenti rapporti sull'utilizzo dell'impedenza per misurare la CPE, questo studio ha mirato a dimostrare che il test TCID50 basato sull'impedenza è un'alternativa affidabile e accurata alla quantificazione virale convenzionale. Il modulo di Virologia del software del sistema consente il calcolo automatizzato del TCID50 durante tutta la misurazione CPE in tempo reale, semplificando e accorciando il processo di analisi fornendo preziose informazioni sulla cinetica della replicazione virale e sulla loro interazione con le cellule permissive.

Protocollo

I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Saggio TCID50 basato sull'impedenza

NOTA: Come illustra la Figura 1 , un test TCID50 basato sull'impedenza consiste in quattro fasi, tra cui la semina permissiva delle cellule su una piastra biosensore, la preparazione e inoculazione della diluizione del virus, la misurazione CPE sul sistema e, infine, l'analisi dei dati e il calcolo TCID50 utilizzando il modulo Virologia del software del sistema.

  1. Preparazione del saggio: rianimazione e subcultura delle cellule permissive
    NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito una settimana prima del saggio. Per minimizzare la variazione tra gli esperimenti, è fortemente raccomandato preparare un banco di celle permissive allo stesso numero di passaggio per l'uso nel saggio. Non utilizzare cellule più vecchie di 15 passaggi dopo l'acquisto dal fornitore di cellulare.
    1. Lo scongelamento criopreservato le cellule permissive
      1. Inserire un mezzo di crescita cellulare caldo in un bagno d'acqua a 37 °C per almeno 30 minuti. Ad esempio, il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina, è stato utilizzato per la coltura HEK293A.
      2. Scongelare una fiala di cellule dalla banca di celle criopreservata per i saggi TCID50 ruotando delicatamente in un bagno d'acqua a 37 °C per 1-2 minuti finché non si presentano alcuni cristalli di ghiaccio; Non immergere il cappuccio. Strofina la fiala con etanolo al 70% e inseriscila in un cappuccio laminare.
      3. Trasferire delicatamente le cellule in un nuovo tubo conico da 50 mL e aggiungere 9 mL di mezzo di crescita riscaldato alle cellule.
      4. Centrifuga la sospensione a celle a 300 x g per 4 minuti a temperatura ambiente.
      5. Scartare il sovrantato e risospendere le cellule in 15 mL di mezzo riscaldato. Trasferiscili su una nuova fiaschetta T75.
      6. Far crescere le cellule fino all'80%-90% di confluenza in un incubatore a 37 °C con 5% di CO2.
    2. Subcultura di cellule permissive.
      1. Monitorare le cellule finché non raggiungono una confluenza dell'80%-90%.
      2. Rimuovere il substrato contenente siero dalla fiaschetta e risciacquare delicatamente il monostrato cellulare una volta con la soluzione salina fosfatata (DPBS) di Dulbecco senza Mg e Ca.
      3. Tripsinizzare le cellule distribuendo uniformemente 2 mL di soluzione di tripsina/EDTA allo 0,05% per fiaschetta T75 e lasciando la fiaschetta in un incubatore a 37 °C per 1-3 minuti.
        NOTA: Non sovra-tripsinizzare le cellule, poiché ciò può essere dannoso per le cellule.
      4. Fermare la tripsinizzazione aggiungendo 8 mL di substrati contenenti siero per diluire il volume originale di tripsina almeno cinque volte. Trasferire 2,5 mL della sospensione a celle in una nuova fiaschetta T75, poi aggiungere 8 mL di mezzo di coltura.
        NOTA: Evita di usare celle permissive appena scongelate per il saggio TCID50. Invece, usa cellule coltivate con confluenza dell'80%-90%. Per ridurre la variabilità inter-sperimentale, le cellule rianimate dovrebbero essere mantenute per un massimo di due settimane dopo lo scongelamento. Per garantire un'elevata vitalità e proliferazione cellulare durante la coltura di due settimane: (1) cambiare il mezzo di crescita almeno due volte a settimana; (2) cellule di sottocoltura quando raggiungono l'80%-90% di confluenza. Per una manutenzione prolungata oltre le due settimane, è richiesta la validazione.
  2. Titolo virale
    NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito il giorno 1.
    1. Misurazione dello sfondo della piastra biosensore
      1. Trasferire con attenzione 50 μL di mezzo preriscaldato in ciascun pozzo utilizzando una pipetta multicanale, utilizzando la tecnica di pipettura inversa per minimizzare la formazione di bolle e garantire una distribuzione costante del volume.
      2. Posiziona la targa nella stazione della placca; apri il software del sistema e seleziona il modulo Virologia prima di iniziare l'esperimento. Inserisci tutte le note rilevanti nella scheda Note Exp e inserisci le informazioni delle celle, inclusi nome e numero della cella, nella sottoscheda Celle della scheda Layout dopo aver selezionato i pozzi corrispondenti. In alternativa, le informazioni sulla cellula possono essere inserite dopo la semina.
        NOTA: La misurazione del fondo della lastra deve essere effettuata prima di aggiungere celle nei pozzi della placca. Le letture di base per tutti i pozzi dovrebbero essere comprese tra -0,063 e 0,063.
      3. Nella scheda Programma, clicca sul pulsante Aggiungi un Passo per aggiungere il Passo 1, che è destinato alla misurazione dello sfondo della placca. Poi, avvia la registrazione cliccando sul pulsante Start.
      4. Rimuovi la piastra dalla Stazione e rimettila nella cappa per la semina delle celle.
    2. Semina permissiva delle cellule sulla piastra biosensore a 96 pozzi
      1. Tripsinizzare le cellule permissive dalla fiaschetta T75.
      2. Conta le cellule e regola la sospensione cellulare alla concentrazione desiderata. In questo studio, la concentrazione di HEK293A era di 60.000 cellule/mL.
      3. Aggiungi 100 μL di sospensione a celle in ciascun pozzo della piastra di ripiego.
        NOTA: La densità cellulare corretta è essenziale. Una densità di semina subottimale potrebbe portare a un artefatto sperimentale. Pertanto, la densità di semina deve essere ottimizzata prima di eseguire un saggio TCID50.
      4. Lascia la piastra nella cappa a temperatura ambiente per 30 minuti dopo l'aggiunta della cella, permettendo alle celle di distribuirsi uniformemente sul fondo del pozzo.
        NOTA: Il mancato esecuzione di questo passaggio potrebbe comportare grandi variazioni da pozzo a pozzo.
      5. Inserire il piatto nella stazione all'interno di un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
      6. Accedi alla scheda Programma del software e aggiungi il Passo 2 usando le impostazioni di registrazione predefinite: 100 Sweep e un intervallo di 15 minuti. Questo avvierà il monitoraggio dell'impedenza/CI ogni 15 minuti, permettendo una valutazione in tempo reale dell'attacco e della proliferazione cellulare come passaggio di controllo qualità cellulare (QC) prima dell'inoculazione virale.
        NOTA: Giorno 2 - Per massimizzare la riproducibilità e la coerenza del saggio tra gli esperimenti, è fondamentale valutare le prestazioni delle cellule nel sistema prima di passare alla fase successiva. Poiché l'IC riflette l'attacco e la crescita cellulare, i valori di CI durante il periodo di 20-28 ore dopo la semina rappresentano un parametro chiave di controllo qualità. Sia il valore che la cinetica del CI sono specifici per cellula. In questo studio, per HEK293A cellule seminate a 6.000 cellule per pozzo e coltivate per 20-28 ore, l'IC dovrebbe superare 2. Se l'IC non raggiunge 2 entro 20-28 ore dopo la semina, la coltura cellulare HEK293A è considerata non aver superato il controllo qualità (QC) e il successivo test TCID50 non verrà eseguito. Questo criterio garantisce un'elevata riproducibilità degli esiti sperimentali.
    3. Preparazione delle diluizioni seriali virali
      1. Calcola il volume totale del mezzo (DMEM + 2% FBS + 1% penicillina / streptomicina) necessario per preparare le diluizioni e riscaldalo in un bagno d'acqua a 37 °C per 30 minuti. Il mezzo sarà utilizzato per il resto dell'esperimento.
      2. Scongelare rapidamente una fiala di stock virale alquotato in un bagno d'acqua a 37 °C per 1-2 minuti finché tutti i cristalli di ghiaccio non si sono sciolti.
      3. Preparare virus diluiti serialmente di 10 volte trasferindo 20 μL del materiale virale in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 180 μL di mezzo preriscaldato a ogni passaggio. Pipetta su e giù per assicurare una buona miscelazione tra mezzo e virus.
        NOTA: Non immergere troppo in profondità la punta della pipetta nella soluzione virale per evitare il trasporto di residui di particelle virali in eccesso all'esterno della punta, il che potrebbe causare diluizioni imprecise.
      4. Per prevenire fluttuazioni nelle letture di impedenza causate dall'aggiunta di campioni del virus del raffreddore, si bilanciano le diluizioni virali incubandole nell'incubatrice a 37 °C con il 5% diCO2 per 20 minuti prima dell'inoculazione.
    4. Inserisci le informazioni sul trattamento del virus nella scheda Layout
      1. Nella scheda Layout della targa del software; selezionare i pozzi per il trattamento del titolo virale; clicca sulla sottoscheda Trattamento e inserisci diluizione iniziale, ad esempio 0.001 (10-3) in questo esperimento; entra 10 come "Fattore di Diluizione"; seleziona la direzione di diluizione, da sinistra a destra in questo caso. La diluizione virale verrà calcolata automaticamente in base all'input della disposizione delle lastre e visualizzata in ciascun pozzo corrispondente.
      2. Successivamente, inserisci il Volume di Inoculazione del virus e clicca sul pulsante Applica per salvare tutte le informazioni sul trattamento. Questo passaggio è essenziale per calcolare con precisione il TCID50/mL durante l'analisi dei dati.
      3. Assegna i pozzi che non saranno trattati con virus come controlli negativi selezionando i pozzi appropriati e poi selezionando Ctrl negativo sotto Tipo di pozzo nella scheda Trattamento .
        NOTA: I pozzi di controllo negativo devono essere designati e aggiunti alla pagina del Layout; L'omissione impedirà il calcolo TCID50.
    5. Inoculazione virale
      1. Quando sei pronto, premi il pulsante Pausa nel software per fermare l'acquisizione dei dati. Rimuovi la piastra dalla stazione e mettila nella cappa laminare.
      2. Rimuovere con cura il materiale di coltura dai pozzi della piastra utilizzando una pipetta multicanale.
      3. Aggiungere delicatamente 50 μL di diluizione virale utilizzando una pipetta multicanale sulla parte superiore del monostrato cellulare, evitando la rottura della coltura cellulare.
      4. Riposiziona la piastra nella Stazione e aggiungi il Passo 3 usando le impostazioni di registrazione predefinite (100 Sweep e un intervallo di 15 minuti) nella scheda Programma per riprendere l'impedenza di registrazione ogni 15 minuti per 2 ore, permettendo al virus di legarsi alle celle.
      5. Dopo 2 ore di inoculazione virale, mettere in pausa la registrazione e rimuovere la piastra dalla Stazione al cappuccio laminare.
      6. Aggiungere lentamente 150 μL di mezzo preriscaldato nei pozzi usando una pipetta multicanale, evitando la rottura del monostrato della cella; riporta la targa alla stazione.
      7. Riprendi il Passo 3 cliccando su Start nella scheda Programma. I segnali di impedenza vengono misurati continuamente ogni 15 minuti durante il periodo di inoculazione.
    6. Calcolo del TCID50 durante o dopo il completamento del saggio TCID50
      1. Nella scheda Analisi dei dati , seleziona e aggiungi tutti i pozzi utilizzati nel test al grafico grafico. L'asse y del grafico è determinato dall'opzione selezionata dal menu a tendina dell'asse Y .
      2. Naviga alla sezione Parametri . Seleziona TCID50 dalla lista a tendina dei parametri per avviare il calcolo di TCID50.
      3. Scegli Diagramma a barre per il calcolo del TCID50 in un momento specifico oppure seleziona il Time Dependent TCID50 per generare il percorso temporale del TCID50 in un periodo desiderato durante l'inoculazione. Il TCID50/mL verrà calcolato e visualizzato dopo aver cliccato sul pulsante di esecuzione.

2. Saggio Crystal Violet-TCID50

  1. Seminare cellule permissive in una micropiastra a 96 pozzi alla densità ottimale di semina descritta nel saggio TCID50 basato sull'impedenza (passaggi 1-2).
  2. Eseguire la preparazione e l'inoculazione per diluizione seriale del virus come specificato nel test TCID50 basato sull'impedenza.
  3. Fissazione e colorazione
    1. Dopo il completamento del saggio, si elimina delicatamente il surnatante da ogni pozzo e si aggiungono 100 μL di formaldeide al 4% per fissare le cellule.
    2. Incubare a 4 °C per 1 ora, poi rimuovere il fissativo.
    3. Tingi le celle fisse con Crystal Violet allo 0,5% preparata in PBS. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
    4. Lava il piatto con acqua del rubinetto finché il fondo non si libera. Lascia asciugare completamente il piatto all'aria prima di segnare.
      NOTA: I rifiuti viola cristallino sono considerati pericolosi sia dalla RCRA che dal California Code of Regulations (CCR 66261.24). Raccogli tutte le soluzioni cristalline viola usate, i materiali contaminati (ad esempio, carta assorbente, guanti) e risciacqua i rifiuti in un contenitore designato per rifiuti pericolosi. Smaltire i rifiuti tramite l'azienda autorizzata per la salute e sicurezza ambientale (EH&S) della tua istituzione o tramite l'appaltatore autorizzato per lo smaltimento di rifiuti pericolosi.
  4. Punteggio e calcolo TCID50
    1. Ispeziona visivamente ogni pozzo per la CPE. Un pozzo positivo mostra distruzione parziale o totale di monostrato e colorazioni più chiare. Un pozzo negativo conserva un monostrato intatto con macchie viola scuro.
    2. Contare il numero di pozzi positivi e negativi per ogni diluizione.
    3. Calcola manualmente il TCID50/mL usando il metodo Reed-Muench, basandosi su un volume di inoculazione di 150 μL.

Risultati

Monitoraggio dinamico, senza etichettatura e in tempo reale del CPE mediato da virus utilizzando impedenza
Per confermare che la CPE indotta dal virus possa essere misurata in modo affidabile e quantitativo tramite impedenza, abbiamo prima registrato i cambiamenti cellulari nelle cellule HEK293A dopo l'infezione da Adv-GFP utilizzando un sistema RTCA eSight che misura simultaneamente l'impedenza e cattura immagini di cellule vive dalla stessa popolazione cellulare, fornendo informazioni approfondite sul comportamento cellulare. HEK293A cellule sono state seminate su una piastra biosensore di 96 pozzi a una densità di semina di 6.000 cellule/pozzo per 24 ore e poi infettate da Adv-GFP a 104 IFU/mL. Impedenza e imaging cellulare vive sono stati registrati per 250 ore dopo l'inoculazione (Figura 2A). Per minimizzare la variabilità dovuta alle differenze nella semina cellulare e rivelare cambiamenti relativi dopo il trattamento, è stato utilizzato l'Indice Cellulare Normalizzato (NCI) per rappresentare i cambiamenti collettivi nella crescita, nell'attacco e nella vitalità cellulare nel tempo. L'NCI viene calcolato dividendo l'IC in un dato momento per il suo IC nel momento di normalizzazione (il tempo prima dell'inoculazione). La traccia cinetica NCI del controllo non infetto (Figura 2A, traccia nera) mostra un aumento graduale nelle prime 48 ore, indicando una proliferazione cellulare continua. Segue un altopiano alla fine del test, che indica che le cellule sono diventate confluenti e coprono l'intera superficie dei biosensori d'oro. Al contrario, la cinetica delle NCI provenienti dai pozzi infetti dal virus è scesa sotto il controllo 50 ore dopo l'inoculazione e è progressivamente diminuita fino a raggiungere zero a 100 ore.

L'imaging delle cellule vive acquisito dalla stessa popolazione cellulare ha confermato visivamente che il segnale di impedenza rispecchia in modo affidabile la condizione fisica delle cellule permissive mentre avanzano lungo l'intero continuum CPE. Come mostrato nella Figura 2A, esiste una correlazione inversa tra il NCI e l'espressione della GFP virale nelle cellule HEK293A infette osservata nelle prime 100 ore prima della lisi completa delle cellule permissive. Inoltre, le immagini di cellule vive (Figura 2B) registrate nei momenti specificati dimostrano ulteriormente uno stato cellulare permissivo durante un'infezione virale. La crescita cellulare è persistita durante le prime 48 ore dopo l'infezione, mentre le particelle virali sono rimaste a bassi livelli all'interno delle cellule. Tuttavia, con il progredire della replicazione e dell'infezione virale, iniziò la morte cellulare, come dimostrato da una confluenza ridotta e dall'aumento del segnale di GFP nelle cellule ospiti. Circa 100 ore dopo l'inoculazione, l'espressione virale di GFP ha iniziato a diminuire a causa della significativa perdita di cellule permissive vitali. Questo approccio integrato rafforza l'affidabilità nel rilevamento della CPE indotta da virus tramite impedenza, stabilendo una solida base per il saggio TCID50 basato sull'impedenza.

Calcolo automatico del TCID50 derivato dalla lettura dell'impedenza
Identificare accuratamente i pozzi CPE positivi è fondamentale per un calcolo affidabile del TCID50. Per valutare se il saggio TCID50 basato sull'impedenza possa differenziare in modo preciso e oggettivo tra CPE positiva e negativa con il supporto del modulo Virology del software del sistema, le cellule HEK293A sono state seminate a 6.000 cellule/pozzo per 24 ore prima dell'inoculazione e trattate con una serie di diluizioni dieci volte di Adv-GFP, utilizzando otto repliche (pozzi) per ciascuna diluizione. Il CPE indotto dall'Adv è stato registrato in tempo reale sul sistema RTCA. Nella Figura 3A, le tracce cinetiche di impedenza, presentate come NCI, sono state registrate e tracciate automaticamente durante l'esperimento. La diminuzione del NCI dopo l'inoculazione rivela una chiara CPE dipendente dalla dose, dimostrata dalla forte correlazione tra la quantità di virus aggiunta e la velocità con cui il segnale di impedenza diminuisce. Le cellule esposte ad elevati carichi virali, tra 10-3 e 10-7 diluizioni, hanno mostrato cali brusco e costanti del NCI, riflettendo una CPE robusta e uniforme tra i pozzi replicati. Al contrario, a una diluizione del virus 10-8 , la traccia cinetica ha mostrato una grande variabilità fin dall'inizio, risultando in deviazioni standard NCI significativamente maggiori, in particolare oltre le 100 ore dopo l'inoculazione. Quando il carico virale è stato ulteriormente ridotto sotto la soglia necessaria per causare infezione, in questo caso una diluizione 10-10 , l'NCI è diventato indistinguibile dai controlli negativi. Questi dati suggeriscono che a una diluizione 10-8 , 1) il virus non poteva indurre CPE in tutti i pozzi ripetuti a cinetiche simili; 2) questa diluizione sarebbe una linea di demarcazione tra le concentrazioni che causano CPE in tutte le ripetizioni e quelle che inducono CPE solo in alcune o nessuna delle repliche; Questo risultato binario, infetto (indicato da cambiamenti di CI indotti dalla CPE) o non infetto (nessun cambiamento di CI), costituisce la base per calcolare TCID50 utilizzando metodi statistici nel software di sistema. Pertanto, la profonda variazione del NCI osservata a determinate concentrazioni virali è un indicatore cruciale dell'ovenire di infezione parziale e potrebbe essere cruciale per l'estrapolazione necessaria al calcolo del TCID50.

Come nel classico saggio TCID50, la soglia per CPE positiva deve essere definita prima che il software integrato possa identificare automaticamente i pozzi CPE-positivi. Poiché diversi virus e modelli cellulari permissivi possono richiedere soglie distinte, il software consente agli utenti di configurare e perfezionare questi criteri all'interno del modulo Virologia. Sulla base dei dati empirici, è stata applicata la soglia predefinita del software per CPE positiva, definita come il valore NCI del bene trattato con virus che è più di tre deviazioni standard inferiore alla media NCI dei controlli negativi (non inoculati), cioè ctrl negativo trattato con virus NCI <(NCI-3 X SD). I singoli pozzi venivano quindi valutati come positivi (+) o negativi (-) (Figura 3B). In questo caso, il TCID50/mL di Adv-GFP è stato successivamente calcolato utilizzando la formula Reed-Muench, una delle formule incluse nel software. A parte selezionare o definire criteri per la CPE positiva, non erano necessarie azioni manuali per il calcolo del TCID50, poiché il software automatizzava completamente il processo.

Tracciamento dinamico di TCID50 durante l'infezione virale
Per determinare la durata appropriata del test TCID50, i valori di Adv-GFP TCID50 sono stati estratti nei momenti desiderati dopo l'infezione, a partire da 30 ore e proseguendo in incrementi di 30 ore fino a 240 ore. È stato scelto deliberatamente un incremento di 30 ore, poiché la replicazione dell'adenovirus richiede circa 30 oree 10. I valori Adv-GFP TCID50 sono stati rappresentati in funzione del tempo (Figura 4). Un'osservazione notevole è l'aumento graduale dei valori di TCID50, che prosegue fino a circa 150 ore dopo l'inoculazione. Oltre questo punto, emerge un plateau, indicando un equilibrio in cui gli effetti citopatici probabilmente hanno raggiunto la saturazione. L'aumento dipendente dal tempo, seguito dalla stabilizzazione, suggerisce una tipica curva di replicazione virale. La fase iniziale è caratterizzata da una propagazione virale attiva, culminante in un picco che riflette il massimo impatto citopatico nelle condizioni sperimentali date. La fase di plateau della TCID50 potrebbe riflettere un tetto biologico in cui il processo di infezione virale ha coinvolto la maggior parte delle cellule permissive, causando una morte cellulare significativa e fermando ulteriore replicazione virale. Il corso cinetico TCID50 suggerisce che il test può essere interrotto sei-sette giorni dopo l'inoculazione per il modello adenovirus-HEK293A, poiché un valore stabili di TCID50 di 8,9 ×10,9 TCID50/mL è stato osservato già dopo 150 ore.

Quantificazione del titolo del virus influenzale A utilizzando il saggio TCID50 basato su impedenza
Per indagare se il saggio TCID50 basato su impedenza possa essere esteso ad altri modelli virus-ospite, è stato eseguito un saggio TCID50 in cellule MDCK infettate da IAV. Pur tenendo conto di variazioni minori nel mezzo infettivo specifico per IAV, la procedura di test principale è rimasta coerente con quella stabilita per l'adenovirus. La Figura 5A mostra l'NCI delle cellule MDCK nel tempo dopo l'inoculazione con diluizioni IAV che vanno da 1 x 10-2 a 5 x 10-9. Similmente ai risultati osservati nelle cellule HEK293 A infettate da Adv, i pozzi di controllo non infetti/negativi hanno mostrato NCI costanti e costanti tra le repliche. Tuttavia, i pozzi infetti dal virus hanno rivelato un cambiamento NCI dipendente dalla dose. Alle dosi basse, 6,4 e 1,3 x 10-7 , si è osservata una grande deviazione standard. Ciò suggerisce che a queste diluizioni la concentrazione del virus si avvicinava a TCID50.

I pozzi CPE-positivi sono stati identificati utilizzando gli stessi criteri e soglia applicati nel modello Adv-HEK293A, in particolare una deviazione standard triplicata sotto la media dei pozzi di controllo negativi. I valori TCID50 basati sull'impedenza per l'IAV sono stati anch'essi determinati in vari momenti dopo l'inoculazione. La Figura 5B mostra i valori medi di TCID50 da due esperimenti indipendenti. Ad eccezione del primo momento a 60 ore, i valori TCID50 da 90 a 150 ore dopo l'infezione hanno dimostrato buona stabilità e coerenza, indicando che il test TCID50 basato sull'impedenza per IAV può essere completato in modo affidabile in quattro giorni invece che in cinque. Questa coerenza rafforza la robustezza del metodo basato sull'impedenza, confermandone l'adattabilità e l'affidabilità tra diversi patogeni virali.

Validazione del saggio TCID50 basato sull'impedenza utilizzando il metodo convenzionale TCID50
Per verificare il TCID50 derivato dall'impedenza per la misurazione della concentrazione IAV, sono stati eseguiti in parallelo saghi TCID50 utilizzando due approcci alternativi: imaging senza etichettatura e colorazione viola cristallina. In breve, le cellule MDCK sono state preparate e seminate in piastre microtitolate a 96 pozzi. Il giorno seguente, le cellule sono state inoculate con una serie di diluizioni IAV per 5 giorni. Per il test TCID50 basato sull'imaging, l'imaging delle cellule vive è stato acquisito ogni 4 ore. Le concentrazioni di dieci campioni IAV sono state valutate nello studio di validazione. La confluenza cellulare dei pozzi trattati con virus è stata confrontata con quella dei pozzi negativi non infetti utilizzando il software del sistema. Tuttavia, l'analisi di imaging per le cellule MDCK è stata particolarmente impegnativa, come illustrato nella Figura 6A. La differenziazione accurata tra celle e spazi vuoti è stata difficile a causa della morfologia piatta e dei bordi poco definiti delle celle MDCK, compromettendo l'identificazione affidabile dei pozzi CPE-positivi tramite analisi basate su imaging. L'utilizzo di software di analisi di immagini più avanzati e sofisticati può migliorare l'accuratezza dei calcoli TCID50 in talicasi 11. In questo caso, la valutazione TCID50 basata su immagini senza etichetta non è stata efficace utilizzando il software di sistema attuale. Per il saggio di colorazione viola cristallo-TCID50, le cellule sono state fissate e colorate al quinto giorno dopo l'inoculazione come descritto nella sezione protocollo. La Figura 6B mostra una forte correlazione lineare tra i valori TCID50 basati sull'impedenza e quelli basati sulla colorazione viola cristallina, con un'equazione di regressione di y = 0,9582x e un R² = 0,9979. Questa analisi comparativa sottolinea l'affidabilità del metodo basato sull'impedenza per la misurazione del titolo virale e la sua idoneità per i saghi TCID50.

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Figura 1: Flusso di lavoro di analisi TCID50 basato su impedenza. Passo 1: Semina permissiva delle cellule sulla piastra biosensore. Semina le cellule permissive su una piastra a una densità ottimale di semina. La crescita cellulare viene quindi monitorata nel sistema come parte della procedura di controllo qualità cellulare (QC). Passo 2: preparazione e inoculazione del virus. Prepara scorte di virus diluiti in serie utilizzando un fattore di diluizione definito dall'utente. Rimuovi la piastra dal sistema e aggiungi i virus ai pozzi della piastra in una cappa laminare. Passo 3: Misurazione e punteggio CPE dei pozzi CPE-positivi utilizzando il software del modulo Virology. Restituire la targa al sistema e riprendere la registrazione in tempo reale della CPE indotta dal virus. Il software identifica automaticamente i pozzi CPE-positivi basandosi sulla soglia definita dall'utente per il rilevamento CPE. Passo 4: calcolo TCID50. Con la valutazione in tempo reale dei pozzi CPE-positivi rispetto all'inoculazione virale, il software del modulo Virology può calcolare i valori TCID50 in qualsiasi momento durante il saggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: L'EPC indotta da adenovirus è stata valutata utilizzando metodi sia basati su impedenza che su imaging (A) profilazione dinamica dell'impedenza (asse y sinistro) e fluorescenza verde (asse y destro) nelle cellule HEK293A nel tempo dopo l'infezione da Adv-GFP. L'Indice Cellulare Normalizzato per le cellule infettate da adenovirus (infettate da NCI Adv, linea rossa), le cellule di controllo negative (NCI NC, linea nera) e l'intensità totale integrata della GFP (infetto da GFP Adv, linea verde) sono rappresentati in funzione del tempo. L'intensità totale integrata della GFP riflette l'espressione della GFP nelle cellule permissive e funge da indicatore dell'infezione virale. I numeri (1-6) lungo l'Indice Cellulare Normalizzato corrispondono a specifici momenti temporali durante il processo di infezione. I dati sono presentati come media ± SD (N = 8). (B) Immagini sequenziali delle cellule HEK293A prima e dopo l'infezione con Adenovirus-GFP. (1) L'immagine di base (0 h) è seguita da istantanee a 48 h (2), 72 h (3), 96 h (4), 120 h (5) e 200 h (6) post-infezione, illustrando il cambiamento nella crescita cellulare, nella vitalità e nella fluorescenza adenovirus-GFP nel tempo. Barre di scala = 160 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: CPE dose-dipendente dell'adenovirus-GFP in HEK293A cellule misurate in termini di impedenza. (A) HEK293A cellule sono state seminate in una piastra biosensore a una densità di 6.000 cellule/pozzo, e 24 ore dopo, sono state infettate da una serie di adenovirus-GFP diluito 10 volte. I dati sono presentati come media ± SD (N = 8). Inset: Indice cellulare normalizzato dei pozzi infettati da adenovirus-GFP a diluizione 10-8 . I dati delle diluizioni 10-9, 10-11 e 10-12 sono stati ommessi per chiarezza. (B) I singoli pozzi/repliche a ogni diluizione del virus sono stati valutati come CPE-positivo (+) o CPE-negativo (-). Ogni colonna della lastra è stata trattata con una diversa diluizione virale, con un gradiente di diluizione che va dal più basso nella colonna 1 al più alto nella colonna 10. Le colonne 11 e 12 erano pozzi di controllo negativi, senza trattamento virale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Il corso temporale dei valori TCID50 derivati dalle misurazioni di impedenza della CPE nelle celle HEK293 dopo essere state infettate da adenovirus-GFP. Il TCID50/mL di adenovirus-GFP è stato calcolato nei momenti specifici utilizzando il modulo di Virologia da cinque esperimenti. Sebbene il modulo di Virologia fornisca tre formule di calcolo TCID50, la formula Reed-Muench è stata selezionata per il calcolo TCID50. I dati sono presentati come media ± SD (N = 5). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Valutazione del titolo del virus influenza A utilizzando il saggio TCID50 basato sull'impedenza. (A) CPE doso-dipendente dell'IAV nelle cellule MDCK misurata tramite impedenza. Le cellule MDCK sono state seminate in una piastra biosensore a 8.000 cellule/pozzo e infettate 24 ore dopo con una diluizione seriale cinque volte del virus influenzale. I dati sono mostrati come media ± SD (N = 8). I dati della diluizione 2,6 × 10⁻⁸ sono omessi, per maggiore chiarezza. (B) Corso temporale dei valori TCID50 derivati da misurazioni di impedenza nelle cellule MDCK infettate da IAV. Il metodo Reed-Muench fu utilizzato per il calcolo del TCID50. I dati sono presentati come media ± SD (N = 2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Correlazione tra saghi TCID50 basati su impedenza e basati su colorazione viola cristallina. (A) Immagine delle cellule MDCK inoculate con IAV. Barra di scala = 160 μm. (B) Un confronto tra i valori TCID50/mL ottenuti con metodi basati su impedenza e colorazione basati su viola cristallina è stato effettuato utilizzando dieci campioni IAV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Le interfacce rappresentative del software del modulo di virologia del sistema. Il software semplifica il processo di prova TCID50 basato su impedenza. (1) Disposizione delle placche per registrare il progetto dell'esperimento; (2) L'Indice Cellulare o Indice Cellulare Normalizzato veniva automaticamente tracciato e visualizzato dal software durante l'inoculazione virale; (3) il software offre flessibilità nel determinare i criteri e le scelte di CPE positive per la formula di calcolo TCID50; (4) TCID50/mL può essere determinato in qualsiasi momento durante il saggio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

In questo studio, è stata dimostrata l'applicabilità dell'impedenza per la determinazione del titolo virale utilizzando modelli adenovirus-HEK293A e virus influenza A-MDCK. Altri hanno anche convalidato la rilevazione robusta e affidabile della CPE indotta da virus utilizzando sistemi RTCA su un'ampia gamma di virus, tra cui ortopoxvirus12, West Nile Virus (WNV) e virus dell'encefalite di St. Louis (SLEV)13, virus chikungunya14, virus borsoinfettivo 8, dengue febbre giallachimerica 15, virus dell'epatiteA 16, SARS-CoV-217 e il virus della dengue9.

La registrazione CPE in tempo reale tramite impedenza consente la scoperta di cali temporali specifici del virus nel valore CI in alcuni modelli cellulari permissivi per virus. Fang et al. hanno dimostrato per primi che un parametro cinetico che caratterizza la CPE indotta da flavivirus, CIT50—definito come il tempo fino a una diminuzione del 50% dell'impedenza cellulare—è inversamente proporzionale alla dose infettiva virale all'interno di un intervallo specifico. Hanno inoltre dimostrato che CIT50 è proporzionale al reciproco del titolo neutraledell'anticorpo 13. Da allora, Charretier et al. di Sanofi Pasteur hanno studiato questo metodo di analisi cellulare in tempo reale basato sull'impedenza (RTCA) per determinare i titoli infettivi virali durante lo sviluppo del prodotto e del processo vaccinale chimera febbre gialla-dengue (CYD). Charretier et al.15 hanno ulteriormente validato questa dose infettiva di coltura cellulare basata sull'impedenza del 50% (CCID50) con un saggio CCID50 basato su immunocolorazione. Hanno dimostrato che il metodo RTCA basato sull'impedenza è circa 5 volte meno laborioso e 3,5 volte più conveniente rispetto al test standard CCID50 in un contesto industriale. Nel nostro studio, è stata dimostrata la validazione del TCID50 basato sull'impedenza rispetto al tradizionale saggio Crystal Violet TCID50 per la CPE indotta da IAV. Inoltre, è stato utilizzato il modulo software di Virologia nel software RTCA. I pozzi CPE-positivi venivano identificati automaticamente in base a criteri definiti dall'utente per i pozzi CPE-positivi nel software; nel nostro caso, il grado di IC diminuisce rispetto ai controlli negativi. Il TCID50 è stato poi calcolato dal software di conseguenza, consentendo una determinazione accurata del titolo senza dipendere dal CIT50 o rischiare che il campione di prova esca dall'intervallo ottimale. Stabilire una soglia appropriata per i pozzi CPE-positivi è fondamentale, poiché influisce direttamente sulla sensibilità e specificità del saggio. Si raccomanda agli utenti di determinare criteri specifici per virus confrontando le variazioni dell'Indice Cellulare con i risultati del loro metodo convenzionale convalidato. Queste soglie empiricamente derivate possono poi essere configurate e raffinate all'interno del modulo di Virologia del software.

Come altri saggi basati su celle, la condizione delle celle permissive utilizzate negli saggi TCID50 basati sull'impedenza è fondamentale per determinare il successo del test e la qualità dei risultati. Per garantire un'elevata proliferazione cellulare e vitalità, si raccomandano cellule fresche a basso passaggio. Inoltre, creare una banca di cellule permissive nello stesso passaggio può migliorare la riproducibilità tra esperimenti. Come indicato nella Figura 3A, quando le cellule permissive erano in condizioni ottimali, generavano segnali di impedenza stabili e costanti nei controlli non infetti per tutta la durata del saggio. Forniva un riferimento di riferimento affidabile per stabilire una soglia per i pozzi CPE-positivi, con conseguente determinazione precisa del titolo virale. Inoltre, il test TCID50 basato su impedenza è particolarmente capace di effettuare il controllo qualità sulle cellule permissive prima della valutazione del titolo virale. Il profilo CI cinetico caratteristico delle cellule permissive sane funge da metrica affidabile di controllo qualità, garantendo che vengano utilizzate solo popolazioni cellulari vitali e coerenti per la quantificazione virale, migliorando così la riproducibilità e l'accuratezza del saggio.

Per ogni nuovo virus, dovrebbe essere effettuata anche l'ottimizzazione e la validazione del test impedanza-TCID50 prima dell'implementazione. Fattori chiave, come le condizioni della coltura cellulare, inclusa la base del mezzo e la concentrazione di FBS, sono fondamentali per ottenere dati di impedenza cellulare riproducibile e per aumentare la sensibilità del rilevamento della CPE, come evidenziato da studiprecedenti 6,16. A questo proposito, la tecnologia basata su impedenza in tempo reale e senza etichettatura si è dimostrata uno strumento semplice, efficiente e prezioso per ottimizzare le condizioni di coltura cellulare durante lo sviluppo delsaggio 16.

Una limitazione del saggio impedanza-TCID50 si presenta nei virus che non causano CPE, poiché il saggio si basa sulla CPE per generare variazioni nella lettura dell'impedenza, che costituisce la base per il calcolo TCID50. In tali casi, può essere necessario identificare un modello cellulare permissivo alternativo che possa mostrare CPE indotta dal virus o adottare un approccio di immunocolorazione, a condizione che sia disponibile un anticorpo adatto contro l'antigene virale specifico. Tuttavia, questo studio ha dimostrato la capacità del sistema RTCA MP di catturare la CPE dipendente dalla dose e distinguere efficacemente tra popolazioni cellulari infette e non infette tramite una lettura oggettiva e sensibile dell'impedenza.

L'introduzione dell'analisi dipendente dal tempo TCID50 rappresenta un significativo progresso rispetto alle tradizionali misurazioni degli endpoint. Semplifica il processo di ottimizzazione del saggio TCID50, poiché il momento ottimale per calcolare e segnalare il titolo virale può essere facilmente ottenuto da un singolo saggio in tempo reale. Sebbene i test TCID50 senza etichette basati su imaging possano fornire valori TCID50 risolti nel tempo, la loro applicabilità è limitata ai modelli virus-cell che mostrano CPE riconoscibile dagli algoritmi software di imaging, come dimostrato nel modello IAV-MDCK (Figura 6A). Inoltre, l'uso di impedenza senza etichettatura per il rilevamento CPE elimina le complicazioni dell'uso di vari reagenti e flussi di lavoro a più fasi che potenzialmente aumentano i rischi associati agli errori umani. Oltre a semplificare il flusso di lavoro, il modulo di Virologia del software del sistema semplifica anche l'analisi. Innanzitutto, inizia con una semplice configurazione di calendario sperimentale per la registrazione automatica controllata dal sistema. Segue una valutazione CPE-positiva spontanea in tempo reale dopo ogni misurazione e si conclude con un calcolo automatico TCID50 per una quantificazione semplice delle particelle virus infettive (Figura 7). Questa automazione riduce significativamente il tempo di interazione manuale, un miglioramento cruciale, soprattutto quando si gestiscono virus altamente infettivi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,05% Tripsina 0,53 mM EDTA  (1x)Corning25-052-CI
12 Serbatoi di reagenti del canaleTecnologie VistaLab3054-1011
Adenovirus-GFPVector Biolabs 1060
Mezzo DMEMATCC30-2002
E-Plate VIEW 96Agilent300601020
Siero bovino fetaleAvantor97068-085
Cella Hek293AThermo Fisher Scientific   R70507
Soluzione di penicillina-streptomicinaHyCloneSV30010
Soluzione salina tampone fosfatica (1x)HyCloneSH30256.01
Agaroso di SeaplaqueLonza50101
sistema eSight xCELLigence RTCAAgilentS2833AA
xCELLigence RTCA sistema MPAgilent380601040

Riferimenti

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