Questo protocollo descrive un efficace modello volontario di corsa delle ruote che può essere implementato in vari contesti di ricerca. A differenza di altri modelli di corsa volontaria, questo metodo evita l'isolamento durante il monitoraggio delle metriche di corsa nei singoli topi.
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Articolo metodologico
Monitoraggio delle metriche di corsa individuali nei topi utilizzando un protocollo volontario di corsa su ruote che riduce al minimo l'isolamento sociale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La corsa volontaria sulle ruote (VWR) nei roditori viene utilizzata per valutare le prestazioni e la resistenza e per simulare l'esercizio. A differenza di altri paradigmi di esercizio che richiedono uno stimolo avversivo per indurre il movimento attivo, la corsa su ruote è volontaria. VWR consiste generalmente nel posizionare un volante da corsa all'interno della gabbia domestica del mouse. Tuttavia, l'analisi dei parametri dell'esercizio può in genere essere condotta solo quando i topi sono alloggiati individualmente, mentre gli effetti complessivi della gabbia possono essere riportati quando i topi sono alloggiati in gruppo. Pertanto, i modelli attuali costringono gli sperimentatori a scegliere tra la misurazione dei parametri di esercizio individuali nei topi alloggiati in un solo alloggio o la misurazione degli effetti di gruppo nei topi alloggiati in gruppo; A seconda della domanda di ricerca e del modello, questo potrebbe essere limitante.
Pertanto, l'obiettivo di questo metodo è dimostrare un protocollo che valuta VWR in un modello murino quantificando i parametri di corsa nei singoli topi, con un isolamento minimo. Riportiamo la progettazione del dispositivo, le preparazioni preoperatorie e l'impostazione dell'esperimento. I risultati di un protocollo di allenamento di 6 settimane che utilizza questo modello VWR suggeriscono che fornisce uno stimolo sufficiente per aumentare la memoria di riconoscimento degli oggetti spaziali, paragonabile all'effetto clinico dell'esercizio. Questo modello semplice ed economico facilita lo studio dell'effetto del VWR su più misurazioni dell'attività delle ruote, riducendo al minimo i fattori che potrebbero limitare o influenzare i risultati sperimentali.
Introduzione
L'esercizio fisico ha un impatto benefico sulla salute fisiologica e psicologica e può migliorare la fisiopatologia di numerose malattie1. L'attività fisica è fondamentale per la durata della salute e l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) ha riferito nel 2020 che l'aumento dell'attività fisica riduce il rischio di numerose malattie, inclusi i disturbi psicologici2. Oltre alla prevenzione delle malattie, l'esercizio fisico può migliorare la funzione cerebrale stimolando il flusso sanguigno3, inducendo la neurogenesi, in particolare nell'ippocampo4, una regione cerebrale chiave per l'apprendimento e la memoria, la regolazione ormonale5 e la plasticità sinaptica attraverso l'aumento dei livelli di fattori neurotrofici derivati dal cervello6. Attraverso questi meccanismi, l'esercizio fisico può migliorare la funzione cognitiva e la memoria7,8,9. Ulteriori meccanismi neurobiologici promossi dall'esercizio fisico supportano la salute mentale, tra cui il rilascio di endorfine10, la riduzione del cortisolo11, il miglioramento della qualità del sonno12 e l'inibizione della neuroinfiammazione13. In precedenza abbiamo
Dimostrato che l'esercizio volontario può promuovere la resilienza allo stress cronico e al comportamento ansioso nei topi maschi e femmine14. L'evidenza che l'attività fisica migliora gli esiti della malattia, combinata con la promozione della salute mentale, evidenzia la necessità di strategie per incoraggiare l'attività fisica, compreso l'aumento della nostra comprensione del potenziale preventivo e terapeutico dell'esercizio.
Un metodo per studiare gli effetti dell'esercizio sulla funzione biologica è utilizzare modelli di esercizio di roditori. Questi modelli sono efficaci nell'aumentare la gittata cardiaca e nell'indurre la produzione di lattato a vari livelli a seconda dell'intensità e della frequenza dell'esercizio. I modelli comuni utilizzati per studiare l'effetto terapeutico dell'esercizio includono il nuoto, l'allenamento su tapis roulant e l'allenamento a intervalli ad alta intensità15. Uno svantaggio di alcuni modelli, tuttavia, è l'esercizio involontario o forzato, che potrebbe essere un'esperienza stressante. Ad esempio, quando i topi sono sottoposti a corsa su tapis roulant in un modello di ischemia cerebrale, sono stati segnalati un comportamento elevato simile all'ansia nel test in campo aperto, un aumento dei livelli di corticosterone, danni neuronali o un aumento dei livelli di citochine16. In alternativa, i modelli di esercizio volontario, incluso il VWR, possono evitare l'esperienza potenzialmente stressante, consentendo ai roditori di correre liberamente, senza la necessità di condizionamento o rinforzo17. La VWR viene in genere eseguita fornendo l'accesso continuo a una ruota di corsa in una gabbia che ospita 4-5 topi o gabbie di topi alloggiati in un solo alloggiamento. Pertanto, il VWR fornisce condizioni non stressanti, in quanto non richiede uno stimolo negativo o un intervento diretto da parte dello sperimentatore e può fornire un meccanismo di coping o un'esperienza di arricchimento18,19,20.
L'obiettivo di questo metodo è proporre un protocollo VWR semplice ed economico che consenta il monitoraggio delle metriche di funzionamento individuali con un isolamento minimo. I topi sono alloggiati in gruppo per evitare un isolamento sociale prolungato e i parametri di corsa vengono registrati per i singoli topi isolando i topi in un'arena di corsa per sole 2 ore al giorno. Vengono forniti dettagli per un modello VWR di 6 settimane in cui 10 mouse C57BL/6 hanno avuto accesso alle ruote da corsa per 2 ore al giorno, mentre 10 mouse C57BL/6 hanno avuto accesso alle ruote bloccate. I risultati hanno confermato che questo protocollo VWR è stato in grado di tracciare con successo i parametri di corsa individuali con un isolamento minimo e di mediare gli effetti benefici dell'esercizio sulla memoria spaziale indotta dall'ippocampo nel test di riconoscimento degli oggetti spaziali (SORT).
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali della Rowan University. I topi maschi pesavano tra 20 g e 27 g ed avevano un'età compresa tra 8 e 10 settimane all'inizio dello studio. I topi sono stati allevati in gruppi di 4 in un ambiente controllato (ciclo luce/buio 12:12 h) con accesso ad libitum a cibo e acqua.
1. Configurazione delle ruote
- Sulla circonferenza esterna media di ogni ruota, incollare un magnete. Questo magnete verrà rilevato dal sensore del contachilometri per monitorare la VWR (Figura 1A).
- Sul lato opposto della ruota, incollare un oggetto di peso simile a quello del magnete (una moneta) per bilanciarlo e prevenire rotazioni indesiderate dovute al peso del magnete.
- Creare una base per il contachilometri e la ruota. Utilizzando un cartoncino bianco in polistirolo, ritagliare un pezzo della forma complementare alla base della ruota e fissarlo con del nastro adesivo (Figura 1B).
- Dopo aver inserito un set fresco di batterie nel contachilometri, impostare la dimensione della ruota durante la programmazione iniziale misurando la circonferenza esterna della ruota.
- Fissare il sensore del contachilometri alla piattaforma. Assicurarsi che il sensore del contachilometri sia posizionato parallelamente al magnete della ruota per consentire una corretta registrazione del movimento (Figura 1C). Ogni volta che il magnete passa davanti al sensore, verrà conteggiata una rivoluzione.
- Avvolgere il sensore e il cavo con nastro adesivo isolante per evitare che i topi rosicchino i fili (Figura 1D).
Figura 1: Configurazione dell'apparato con ruota rotante. (A) Un magnete e una moneta incollati (freccia rossa) su lati opposti del bordo esterno della ruota. (B) Una piattaforma realizzata in polionda (freccia rossa) utilizzata come supporto per il sensore del tachimetro. (C) Sensore del tachimetro posizionato sulla piattaforma (freccia rossa); (D) Sensore fissato con nastro adesivo (freccia rossa) e configurazione finale della ruota. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
2. Configurazione dell'apparato
- Utilizzare l'apparato comportamentale e dividere la scatola di dimensioni 40 cm x 40 cm x 35 cm (h) in quattro quadranti per testare singolarmente quattro topi contemporaneamente.
- Tagliare due pezzi di cartoncino bianco in schiuma in base alle seguenti dimensioni: L 30 cm, L 40 cm (Figura 2A).
- Al centro del lato largo 40 cm del cartoncino in schiuma, praticare un taglio di 20 cm per permettere l'incrocio dei due pezzi di schiuma.
- Rivestire il cartoncino in schiuma con carta adesiva impermeabile per consentire una facile pulizia tra un gruppo e l'altro.
- Dividere la scatola di dimensioni 40 cm x 40 cm x 35 cm (h) in quattro quadranti (20 cm x 20 cm x 30 cm (h)) utilizzando due cartoncini in schiuma incrociati (Figura 2B).
- Posizionare una ruota preparata (verificare l'allestimento della ruota riportato sopra) in ogni angolo dei quadranti e fissare i fili alla parete. Applicare i conta-chilometri sui lati dell'apparato trasparente in Perspex (Figura 2C).
Figura 2: Impostazione dell'apparato. (A) Tavola di polistirolo tagliata e fissata con nastro adesivo; (B) Apparato in plexiglas suddiviso in quattro quadranti; (C) una ruota posizionata nell'angolo di un quadrante con il filo del tachimetro fissato al muro. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
3. VWR
NOTA: Oltre alle metriche del tachimetro, abbiamo utilizzato un software di tracciamento comportamentale, il sistema di tracciamento comportamentale ANY-maze, per fornire ulteriori informazioni sul tracciamento comportamentale.
- Eseguire le sessioni di VWR ogni giorno, nella fase chiara, sempre alla stessa ora (dalle 9:00 alle 11:00). Posizionare i topi senza esercizio in arene identiche per 2 ore, ma con ruote bloccate. Bloccare le ruote utilizzando colla a caldo per immobilizzare il perno centrale della ruota e impedirne la rotazione.
- Posizionare i topi nella stanza del VWR per un periodo di abituazione di 30-60 minuti.
- Ripristinare tutti i contachilometri.
- Posizionare ogni topo nell'angolo del quadrante in cui può correre liberamente per 2 ore.
- Dopo 2 ore, riportare i topi nei loro contenitori di provenienza e registrare i dati dei contachilometri.
- Pulire le arene e le ruote con etanolo al 70% tra entrambi i gruppi.
4. SORT
NOTA: Al termine di 5 settimane di VWR, è stato eseguito il test SORT per verificare se l'esercizio fisico avesse migliorato la funzione ippocampale, secondo il protocollo pubblicato21.
- Eseguire le sessioni di abituazione e il SORT durante la fase chiara in una stanza con illuminazione ambiente. Condurre le sessioni di abituazione un giorno prima del SORT, durante le quali si trasferiscono i topi in gabbie individuali e li si porta nella stanza di prova per almeno 30 minuti di acclimatazione.
- Assegnare uno degli angoli dell'arena come "angolo di rilascio" e assicurarsi che ogni topo venga posizionato rivolto verso l'angolo di rilascio per esplorare liberamente l'arena per 6 minuti. Riportare i topi nelle loro gabbie individuali per pulire l'arena con etanolo al 70%.
- Ripetere il passaggio 4.1.1 due volte, in modo che ogni topo effettui tre sessioni di abituazione. Una volta completate le sessioni di abituazione, riportare tutti i topi nelle loro gabbie di provenienza.
- Dopo 24 ore, riportare i topi nella stanza di prova e lasciarli abituare in gabbie individuali per 30-60 minuti prima del test.
- Fissare due oggetti diversi in modo controbilanciato nell'arena, a 6 x 6 cm da due angoli non di rilascio.
- Posizionare ogni topo rivolto verso l'angolo di rilascio per esplorare liberamente gli oggetti per 10 minuti. Riportare i topi nelle loro gabbie individuali per 20 minuti e pulire gli oggetti e l'arena con etanolo al 70%.
- Spostare uno dei due oggetti e fissarlo a 6 x 6 cm da un nuovo angolo non di rilascio, senza modificare la posizione dell'altro oggetto.
- Posizionare ogni topo rivolto verso l'angolo di rilascio per esplorare liberamente gli oggetti per 10 minuti prima di farlo tornare nella sua gabbia di provenienza. Registrare questo test mediante software automatizzato per misurare il tempo di investigazione per oggetto e calcolare la percentuale di tempo di investigazione come segue:
% tempo di investigazione =
5. Analisi statistica
- Esprimere tutti i dati come media ± errore standard della media.
- Eseguire le analisi statistiche utilizzando un software di analisi statistica con significatività stabilita a p ≤ 0,05. Analizzare i risultati di SORT utilizzando il test t di Student T-test.
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Risultati
In questo studio, 20 topi maschi C57BL/6 sono stati assegnati casualmente a uno dei due gruppi: senza esercizio (NO-EX) o esercizio (VWR) per 6 settimane. I singoli parametri di corsa sono stati registrati giornalmente sui contachilometri e riportati di seguito come media ± SEM (Figura 3A-C). Durante le 6 settimane, i topi sono stati più attivi nella seconda settimana, durante la quale hanno trascorso in media 2.135,87 ± 351,14 s sulla ruota, percorrendo una distanza di 1,16...
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Discussione
Vari paradigmi di esercizio sono utilizzati dai ricercatori per valutare l'attività fisica e i suoi effetti nei roditori, compresi i paradigmi di corsa volontaria e forzata. Rispetto ai paradigmi dell'esercizio forzato, la VWR consente ai topi di correre liberamente a un'intensità inferiore, riducendo al minimo le condizioni di stress22. Attualmente, i ricercatori possono raccogliere i parametri di esercizio dei singoli topi alloggiandoli singolarmente 23,24,25,26,27,28,29,30,31 o registrare i par...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ANY-box 5-Behavior Test System | Stoelting | 65000 | https://stoeltingco.com/Neuroscience/ANY-box-Multi-Configuration-Behavior-Apparatus~9838 |
| ciclocomputer bicicletta cablato tachimetri e contachilometri | IPSXP | N/A | Qualsiasi tachimetro cablato che misura distsnce, tempo, velocità potrebbe funzionare |
| Fodera protettiva adesiva trasparente | Marca Con-Tact | N/A | https://con-tactbrand.com/products/clear-cover%E2%84%A2-clear-matte?_pos=1&_fid=be2dc000c&_ss=c |
| GraphPad Prism | |||
| Adesivo istantaneo 496 Super Bonder | Loctite | S-24546 | https://www.uline.com/Product/Detail/S-24546/Adhesives-Glue-Epoxy/Loctite-Instant-Adhesive-496-Super-Bonder?pricode=WB0948&gadtype=pla&id= S-24546& gad_source=1& gclid=Cjw KCAjw68K4BhAuEiwAylp3klS0FN Ur-l_xKkue1NUmruDDV48QO5b2tVH W9Bc08s9eZKmedj-yxBoCgIEQAvD_BwE |
| Magnete al neodimio Pro Mag | Magneti applicati | ND018-6 | Se scegli altri magneti, assicurati che siano abbastanza forti da essere rilevati dal censore |
| Silent Spinner Ruote per esercizi per piccoli animali (mini 11,4 cm) | Kaytee | SKU# 100079369 | https://www.kaytee.com/all-products/ ruota per piccoli animali/silenziosa |
| Pannelli in schiuma bianca | Pacon | 5553 | https://pacon.com/foam-board-350/pacon-foam-board-20-x-30-white-10pkg-2.html |
Riferimenti
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