Questo articolo presenta metodi per la manipolazione optogenetica in Drosophila melanogaster, utilizzando CsChrimson e GtACR2 per attivare e silenziare neuroni specifici. Vengono descritti quattro esperimenti che utilizzano l'optogenetica per esplorare i comportamenti termotattici e gustativi, fornendo informazioni sui meccanismi neurali sottostanti che governano questi processi.
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Articolo metodologico
Saggi comportamentali per la manipolazione optogenetica dei circuiti neurali in Drosophila melanogaster
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'optogenetica è diventata una tecnica fondamentale nelle neuroscienze, consentendo un controllo preciso dell'attività neuronale attraverso la stimolazione della luce. Questo studio introduce configurazioni facili da implementare per l'applicazione di metodi optogenetici in Drosophila melanogaster. Due strumenti optogenetici, CsChrimson, un canale cationico attivato dalla luce rossa, e GtACR2, un canale anionico attivato dalla luce blu, sono stati impiegati in quattro approcci sperimentali. Tre di questi approcci prevedono esperimenti a mosca singola: (1) un saggio optogenetico di preferenza posizionale termotattica optogenetica a luce blu mirato a celle riscaldanti sensibili alla temperatura, (2) un saggio di preferenza posizionale optogenetica a luce rossa che attiva i neuroni sensibili all'amaro e (3) un saggio di risposta all'estensione della proboscide che attiva i neuroni sensibili al dolce. Il quarto approccio (4) è una configurazione di labirinto di mosche per valutare i comportamenti di evitamento utilizzando più mosche. La capacità di manipolare l'attività neurale temporalmente e spazialmente offre potenti intuizioni sull'elaborazione sensoriale e sul processo decisionale, sottolineando il potenziale dell'optogenetica per far progredire la nostra conoscenza della funzione neurale. Questi metodi forniscono un quadro accessibile e robusto per la ricerca futura nelle neuroscienze per migliorare la comprensione di specifici percorsi neurali e dei loro esiti comportamentali.
Introduzione
L'optogenetica è emersa come una potente tecnica che combina l'ottica e la genetica nelle neuroscienze, fornendo un controllo preciso e non invasivo sull'attività neurale attraverso la stimolazione dellaluce. In Drosophila melanogaster, un organismo modello ampiamente utilizzato, gli strumenti optogenetici consentono l'attivazione e l'inibizione di neuroni specifici, consentendo ai ricercatori di modulare i circuiti neurali. Tra gli strumenti utilizzati, CsChrimson e GtACR (Rodopsine canale anionico Guillardia theta) forniscono approcci complementari per il targeting neuronale. CsChrimson chan....
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Protocollo
1. Ceppi, allevamento di mosche e aspiratore di mosche
- Stiramenti e manutenzione
- I ceppi utilizzati negli esperimenti includono HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136). La parte posteriore vola a 25 °C su un mezzo di farina di mais standard con un ciclo di luce di 12 ore:12 ore di buio.
NOTA: 1 L di terreno di farina di mais contiene 1 L dH2
- I ceppi utilizzati negli esperimenti includono HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136). La parte posteriore vola a 25 °C su un mezzo di farina di mais standard con un ciclo di luce di 12 ore:12 ore di buio.
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Risultati
Saggio di preferenza posizionale termotattica termotattica optogenetica a luce blu a mosca singola
Sono state testate quattro condizioni: luce della stanza senza integrazione di ATR (luce della stanza, ATR -), luce della stanza con integrazione di ATR (luce della stanza, ATR+), luce blu senza integrazione di ATR (blu, ATR -) e luce blu con integrazione di ATR (blu, ATR+). Le prime tre condizioni servivano da controlli. Negli esperimenti di controllo, le mosche hanno evitato il lato a 31 °C. Nella luce.......
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Discussione
La manipolazione optogenetica ha trasformato il campo delle neuroscienze consentendo un controllo preciso dei circuiti neurali con accuratezza spazio-temporale27. Un circuito neurale comprende popolazioni di neuroni interconnessi da sinapsi, che svolgono funzioni specifiche dopo l'attivazione. Il connettoma dell'intero cervello di Drosophila è stato completato, offrendo una visione completa delle vie sinaptiche all'interno del cervello di Drosophila
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse in merito alla pubblicazione di questo articolo. Tutti gli autori hanno rivelato eventuali conflitti potenziali e affermano di non avere relazioni finanziarie o personali che potrebbero influenzare il lavoro presentato in questo studio.
Ringraziamenti
I diagrammi schematici per tutte le figure sono stati creati con Biorender.com. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) a L.N. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Driver LED da 1000 mA | Luxeon Star | 3021-D-E-1000 | |
| Provette per coltura VWR da 5 mL, plastica, con tappi a doppia posizione VWR | 60818-664 | ||
| 780 Filtro passa-lungo / IR 780 nm 100 mm x 100 mm | Filtri Lee | BH #LE8744 | Tagliato a circa 47 x 100 si adatta alla copertura in plastica |
| Agfabric 6,5 piedi x 15 piedi Rete per insetti Rete da giardino per proteggere piante Verdure Fiori Frutta | The Home Depot | EIBNW6515 | |
| tutta la piastra in alluminio trans retinica | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | |
| (30,5 cm x 30,5 cm x 0,6 cm) | Amazon | acquistata da Amazon | |
| Scatola di plastica nera | LI-COR | 929-97101 | |
| CLORURO DI CALCIO ANHYDRO 25GR | Thermo Fisher Scientific | ||
| CX405 Handycam con sensore CMOS Exmor R | SONY | HDR-CX405 | |
| Elmer' s “ Colla scolastica" | Elmer | ||
| , puro (200 Proof) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Fisherbrand Agitatore con piastra riscaldante | Isotemp Fisher Scientific | SP88850200 | |
| Fly: Gr5a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 57592 | |
| Flyline: Gr66a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 57670 | |
| Flyline: HC-Gal4 (II) | Dr. Marco Gallio Lab | Un regalo gentile | |
| Linea di mosca: UAS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55136 | |
| Linea di mosca: UAS-GtACR2/TM6B | Dr. Quentin Gaudry Lab | Un regalo gentile | |
| Flystuff 62-101 Farina di mais gialla (11,3 Kg), Giallo, 11,3 Kg/unità | Genesee Scientific | 62-101 | |
| Flystuff 62-107 Lievito secco inattivo, 10 kg, fiocco nutrizionale, 10 kg/unità | Genesee Scientific | 62-107 | |
| Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 mesh, 5 kg (11,02 libbre)/unità | Genesee Scientific | 66-103 | |
| FreeMascot OD 8+ 190 nm– 420 nm / 600 nm– Occhiali di sicurezza laser viola/rosso/infrarossi con lunghezza d'onda di 1100 nm | FreeMascot | B08LGMQ65S | acquistato da Amazon |
| GoPro Hero8 Black | GoPro | 6365359 | |
| filtri LEE 100 volte Filtro in poliestere a infrarossi #87 da 100 mm | B& H Photo | LE8744 | |
| Filtro passa-lungo, vetro colorato, 50,8 x 50,8 mm, 830 nm Cut-on, RG830 | Newport | FSQ-RG830 | |
| Metil 4-idrossibenzoato, 99%, Thermo Scientific Chemicals | Thermo Fisher Scientific | ||
| Mini vassoio MicroWell 60 pozzetti, basso profilo NS PS | Thermal Scientific | NUNC 439225 | I coperchi sono utilizzati come "copertura in plastica" |
| Olympus Plastics 24-160RS, 1000 µ L Punte ergonomiche per pipette Olympus a bassa legatura, rack, sterili, 8 rack da 96 punte/unità | Eppendorf | 24-160RS | |
| Parafilm M Pellicola sigillante | Heathrow Scientific | HS234526B | 4 pollici x 125 piedi |
| Cloruro di potassio, ACS, 99,0-100,5%, | Thermo Fisher Scientific | Software di | |
| analisi dati | Prism | GraphPad | versione 9 |
| Pipette a trasferimento graduato Samco | Thermo Fisher Scientific | 225 | da 3 mL |
| Fisher Scientific | 12-544-2 | Stereomicroscopio 5 mm x 75 mm x 1,0 mm | |
| OLYMPUS | CZ61 | ||
| Scatola di polistirolo (27 cm di altezza e 22 cm di larghezza e 16 cm di lunghezza) | |||
| Saccarosio | Fisher Scientific | 225911 | |
| Sonda di temperatura superficiale | Fluke | 80PK-3A | |
| Siringa | BD Integra | 305270 | |
| Tate & Lyle 457 Destrosio, Tate & Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Destrosio, Tate & Lyle, polvere, 50 libbre/unità | Genesee Scientific | 62-113 | |
| Termometro a termocoppia a grandi cifre calibrato tracciabile | Tracciabile da cple-parmer | UX-91210-07 | Fisherbrand Termometro tracciabile BigDigit tipo K Triplo |
| LED blu di dritta | LEDSupply | 07007-PB000-D | 470 nm |
| Triplo LED rosso di drittaSuppply | 07007-PD000-F | 627 nm | |
| Tygon PVC Tubo trasparente 1/4" ID, 3/8" OD, 5 piedi. | Azienda di forniture McMaster Carr | 6516T21 | |
| Univivi IR Illuminator, 850nm 12 LED Illuminatore IR grandangolare per visione notturna | Univivi | 4331910725 | |
| Wakefield Thermal 25.4 mm Rotondo Dissipatore di calore Star LED Board - 882-100AB | Wakefield-Vette | 882-100AB | |
| Wireless Presenter | DinoFire Store | B01410YNAM | acquistato da Amazon |
Riferimenti
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Mauss, A. S., Busch, C., Borst....
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Ristampe e permessi
