Articolo metodologico

Un modello in vitro della vescica di infezione del tratto urinario associata al catetere

DOI:

10.3791/67966

⸱

24 giugno 2025

 ,  , 
1The Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, The University of Liverpool, 2Department of Life Sciences, The University of Bath

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive in dettaglio un modello in vitro del tratto urinario cateterizzato, che può essere utilizzato per studiare le popolazioni di cellule batteriche planctoniche e associate al biofilm nelle infezioni simulate del tratto urinario associate al catetere. Questo modello può essere ulteriormente utilizzato per studiare l'efficacia di prodotti antimicrobici volti a controllare le infezioni del tratto urinario.

Abstract

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Le infezioni del tratto urinario associate al catetere (CAUTI) sono tra le infezioni più comuni associate all'assistenza sanitaria. La formazione di biofilm sui cateteri urinari è un aspetto chiave nella patogenesi di queste infezioni e spesso porta al blocco dei cateteri e a gravi complicanze come pielonefrite e setticemia. Gli approcci per modellare e studiare la formazione del biofilm in questo contesto sono essenziali sia per una comprensione fondamentale dei meccanismi alla base della patogenesi della CAUTI, sia per lo sviluppo e la solida valutazione preclinica di strategie terapeutiche efficaci per controllare la CAUTI e il blocco del catetere. Questo protocollo descrive un modello in vitro del tratto urinario cateterizzato, che replica il sistema di drenaggio chiuso del catetere utilizzato nella pratica clinica, facilitando lo studio della CAUTI e la formazione del biofilm del catetere in condizioni rappresentative. Inoltre, questo protocollo descrive in dettaglio l'applicazione del modello vescicale in vitro per valutare l'efficacia dei prodotti antimicrobici per la manutenzione dei cateteri, compresi i prodotti attualmente disponibili sulla catena di fornitura del NHS.

Introduzione

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I cateteri urinari sono tra i dispositivi medici più comunemente impiegati, con una prevalenza stimata del 19% nelle strutture di terapia intensiva 1,2,3. I cateteri vengono utilizzati principalmente per aiutare nella gestione della produzione di urina in caso di disfunzione della vescica e vengono inseriti direttamente nella vescica, consentendo all'urina di uscire dalla vescica attraverso un lume centrale 2,3. I cateteri urinari possono essere utilizzati in modo intermittente, dove vengono inseriti periodicamente nella vescica per drenare l'urina, oppure possono essere utilizzati cateteri a permanenza, in cui i cateteri vengono lasciati in situ nella vescica per drenare continuamente l'urina 3,4. Nonostante il loro uso diffuso, i cateteri urinari sono il principale fattore di rischio per lo sviluppo delle infezioni del tratto urinario (UTI), che rappresentano circa un quinto delle infezioni associate all'assistenza sanitaria 5,6. Infatti, il catetere stesso funge spesso da sito iniziale di colonizzazione microbica, fornendo una superficie per l'adesione degli uropatogeni e l'ulteriore colonizzazione del tratto urinario 1,6,7,8. Praticamente tutti i pazienti sottoposti a cateterismo continuo a lungo termine (in cui il catetere viene lasciato in posizione per ≥28 giorni) sperimenteranno batteriuria, con un rischio che aumenta di ~5% per ogni giorno in cui il catetere è in situ 2,9,10,11. Commisuratamente, circa l'80% delle infezioni delle vie urinarie è associato all'uso di un catetere urinario6.

Le infezioni del tratto urinario associate al catetere (CAUTI) rappresentano un onere significativo per i servizi sanitari e sono spesso associate a sintomi più gravi delle infezioni delle vie urinarie superiori (come ureterite e pielonefrite) rispetto alle infezioni delle vie urinarie non complicate, nonché a un aumento del rischio di infezioni secondarie del flusso sanguigno 1,7,12,13,14 . I trattamenti standard per le CAUTI includono la terapia antibiotica, tuttavia, queste infezioni sono spesso recalcitranti al trattamento antimicrobico a causa dello sviluppo di complesse comunità di biofilm sulla superficie del catetere 15,16,17,18,19,20. Infatti, si stima che ~80% delle CAUTI derivi da patogeni del tratto urinario che formano biofilm19. La formazione di biofilm è caratterizzata dall'adesione di cellule batteriche alle superfici dei cateteri e dallo sviluppo di comunità incorporate in un'estesa matrice di sostanze polimeriche extracellulari (EPS)21,22,23,24. La produzione di EPS è una caratteristica distintiva delle comunità di biofilm ed è responsabile di molte delle proprietà emergenti mostrate dalle cellule associate al biofilm, come l'elevata resistenza agli agenti antimicrobici e la clearance immunitaria 21,22,24. L'EPS può svolgere un ruolo diretto in questi fenotipi schermando fisicamente le cellule e proteggendole dagli antimicrobici o dagli effettori immunitari, nonché indirettamente facilitando lo sviluppo di aspetti più ampi delle comunità di biofilm come il microambiente fisico-chimico del biofilm e la formazione di cellule persistenti 23,24,25,26. Inoltre, alcuni uropatogeni, tra cui Proteus spp., che rappresentano ~11% dei CAUTI, possiedono potenti enzimi ureasi, che consentono loro di idrolizzare l'urea presente nelle urine e determinano un aumento complessivo del pH urinario 2,27,28,29,30. Questo aumento del pH è accompagnato dalla precipitazione di cristalli di fosfato di calcio e magnesio, che possono essere incorporati nel biofilm in crescita, con conseguente biomineralizzazione e formazione di dense strutture di biofilm cristallino che possono bloccare i cateteri. Questi biofilm cristallini non solo rendono problematico il trattamento, ma possono anche avviare gravi complicazioni come pielonefrite e setticemia 2,28,31,32,33,34.

La complessa nicchia ambientale nel tratto urinario cateterizzato e l'importante ruolo della formazione di biofilm in queste infezioni, pongono sfide particolari nello studio della patogenesi CAUTI. Modelli di laboratorio semplici e ampiamente utilizzati per studiare e quantificare la formazione di biofilm, come i saggi basati su piastre a 96 pozzetti, sono inadeguati per lo studio della formazione di biofilm in CATUI, in particolare i biofilm cristallini. Ad esempio, tali modelli non tengono conto degli aspetti chiave della nicchia CAUTI, come il complesso ambiente nutritivo fornito dall'urina, il modo in cui la superficie del catetere influisce sull'adesione e la successiva produzione di biofilm e il flusso continuo di terreni urinari 35,36,37,38,39,40. Inoltre, i test standard utilizzati per determinare la suscettibilità antimicrobica degli uropatogeni spesso non riflettono la suscettibilità clinica del mondo reale. I saggi di concentrazione inibitoria minima e i test di sospensione microbica sono spesso utilizzati per dedurre la suscettibilità antimicrobica dei patogeni CAUTI, ma in genere non simulano variabili importanti dell'ambiente CAUTI, come l'effetto che la presenza di un catetere urinario e qualsiasi successiva formazione di biofilm possono avere sulla suscettibilità antimicrobica 41,42,43.

Questo studio descrive in dettaglio l'impostazione e l'esecuzione di un modello di vescica in vitro che simula l'ambiente del tratto urinario cateterizzato e replica un sistema di drenaggio chiuso con catetere standard utilizzato nella pratica clinica, descritto per la prima volta da Stickler et al.44 nel 1999 (Figura 1). Questo modello utilizza cateteri di Foley di dimensioni standard (attualmente disponibili sulla catena di fornitura del NHS) e mezzi di urina artificiali (AUM) come precedentemente descritto da Nzakizwanayo et al.45per simulare CAUTI e la formazione di biofilm. Il modello di vescica in vitro è costituito da una camera di vetro a doppia parete che funge da "vescica" e dispone di un'uscita attraverso la quale è possibile inserire un catetere di Foley nella camera di vetro centrale. Nella parte superiore della camera centrale in vetro, c'è un ingresso attraverso il quale l'AUM può essere fornita alla "vescica" a una portata biologicamente rilevante utilizzando una pompa peristaltica, che scorrerà attraverso il catetere attraverso i fori per gli occhielli di drenaggio in un sacchetto per i rifiuti. Inoltre, la camera esterna è collegata a un circuito a bagno d'acqua, che consente di mantenere i modelli a una temperatura costante. Il modello vescicale in vitro può essere inoculato attraverso la camera centrale, consentendo lo studio dei patogeni CAUTI in una nicchia biologicamente rappresentativa. Inoltre, poiché i modelli sono cateterizzati e costantemente alimentati con AUM fresca, è possibile studiare la crescita e la dinamica della popolazione sia delle cellule planctoniche che di quelle associate al biofilm.

Studi precedenti hanno utilizzato modelli di vescica in vitro per diverse applicazioni, tra cui lo studio fondamentale della formazione di biofilm in importanti patogeni CAUTI, tra cui Proteus mirabilis ed Escherichia coli 43,45,46,47,48,49. Inoltre, il modello in vitro è stato utilizzato per valutare l'efficacia di prodotti destinati a controllare la CAUTI o a prevenire il blocco 50,51,52. Più recentemente, i modelli sono stati utilizzati per determinare se gli adattamenti e le mutazioni legate all'AMR influiscano sulla formazione del biofilm e sulla patogenesi di CAUTI in P. mirabilis43,46. Il modello vescicale in vitro è stato utilizzato anche per studiare nuovi trattamenti antimicrobici volti al trattamento della CAUTI, tra cui rivestimenti di cateteri teranostici di nuova formulazione e trattamenti di terapia fagica47,48. Questo protocollo comprende l'impostazione e l'esecuzione di modelli vescicali in vitro, l'enumerazione di cellule planctoniche vitali e associate al biofilm rispettivamente dal modello e dalla superficie del catetere urinario e la misurazione del pH urinario per monitorare la produzione di ureasi. Vengono inoltre dettagliati i protocolli per la valutazione dei prodotti antimicrobici volti al trattamento o alla prevenzione della CAUTI, comprese le soluzioni per l'irrigazione della vescica e i gel lubrificanti antimicrobici, attualmente disponibili sulla catena di fornitura del NHS.

Protocollo

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Una rappresentazione schematica della configurazione del modello di vescica in vitro è mostrata nella Figura 1. I modelli di vescica in vitro sono progettati per essere compatibili con i cateteri di Foley standard (le dimensioni mostrate nella Figura 1 sono compatibili con i cateteri francesi di dimensioni standard 14). Sterilizzare tutte le apparecchiature del modello di vescica in vitro e bloccare i tubi in silicone utilizzati nel circuito del supporto prima dell'uso. È richiesta una stretta aderenza alla tecnica asettica durante l'impostazione dei modelli in vitro e si raccomanda che il modello sia assemblato in condizioni sterili (ad esempio, in una cabina di sicurezza microbica di categoria II o in una cappa a flusso laminare). Si raccomanda un minimo di n = 5 repliche per determinare la significatività statistica per gli esperimenti in vitro su modelli di vescica. I dettagli sui reagenti e sulle attrezzature utilizzate sono riportati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione di terreni urinari artificiali

NOTA: Si raccomanda l'uso di terreni di urina artificiali (AUM) in modelli vescicali in vitro a causa degli elevati volumi di terreni necessari per la sperimentazione e della variabilità associata ai campioni di urina umana. Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione dell'AUM come descritto in precedenza e ottimizzato per l'uso nel modello vescicale in vitro da Nzakizwanayo et al. (5 L volume finale) 43,45,46,48,53,54.

  1. Preparare la soluzione AUM 1
    1. Pesare i seguenti composti e aggiungere a un flacone di borosilicato da 1 litro riempito con 850 ml di acqua deionizzata: 3,25 g di cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2,6H 2O), 23 g di cloruro di sodio (NaCl), 11,5 g di solfato di sodio anidro (Na2SO4), 3,25 g di citrato trisodico (Na3C6H5O7), 0,1 g di ossalato di sodio (Na2C2O4), 14 g di fosfato monopotassico (KH2PO4), 8 g di cloruro di potassio (KCl), 5 g di cloruro di ammonio (NH4Cl), 25 g di gelatina e 5 g di brodo di soia triptone.
  2. Mentre si agita la soluzione AUM, misurare il pH utilizzando un pHmetro e regolare a 5,75 (± 0,02) aggiungendo 3 M di NaOH o HCl a seconda dei casi.
    NOTA: NaOH/HCl per la regolazione del pH deve essere aggiunto all'AUM goccia per goccia per evitare la precipitazione del sale dalla soluzione.
  3. Una volta che l'AUM è stato regolato il pH, rabboccare la soluzione fino a un volume finale di 1 L con acqua deionizzata e sterilizzare in autoclave.
    NOTA: Una volta sterile, la soluzione può essere conservata per un massimo di tre mesi a temperatura ambiente (la soluzione AUM 1 deve essere scartata se si osservano precipitazioni o torbidità).
  4. Separatamente, preparare la soluzione AUM 2, aggiungendo 125 g di urea (CH4N2O) e 2,45 g di cloruro di calcio (CaCl2) a 400 mL di acqua sterile deionizzata in un becher sterile da 500 mL.
    NOTA: La preparazione della soluzione di calcio urea 2 provoca una reazione endotermica, pertanto si consiglia di agitare e riscaldare la soluzione AUM 2 a ~ 50 °C su una piastra calda/agitatore magnetico mentre i composti si dissolvono per evitare il congelamento.
  5. Una volta che l'urea e il cloruro di calcio si sono disciolti, filtrare la soluzione sterilizzante 2 utilizzando una pompa a vuoto e unità filtranti in nitrocellulosa da 0,45 μM, in un flacone di vetro sterile da 500 ml. Una volta sterilizzata, la soluzione 2 è stabile per tre mesi a 4 °C o un mese a temperatura ambiente
    NOTA: La soluzione AUM 2 deve essere scartata se si osservano precipitazioni o nuvolosità.
  6. In una cappa a flusso laminare o in una cappa di sicurezza microbiologica di categoria II, combinare asetticamente le soluzioni AUM 1 e 2 con 3,6 L di acqua deionizzata sterile in un flacone di aspirazione sterile in vetro da 5 L. L'AUM deve essere di colore giallo pallido e trasparente.
  7. Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere 50 mL dal volume totale di AUM e aliquotare in una provetta da centrifuga da 50 mL e conservare per un uso successivo.
  8. Sigillare il flacone dell'aspiratore utilizzando un tappo di gomma o un foglio di alluminio e lasciarlo a temperatura ambiente fino all'assemblaggio dei modelli in vitro .
  9. Rimuovere asetticamente 10 mL di AUM dall'aliquota da 50 mL e riservare il resto della soluzione per la preparazione dell'inoculo. Utilizzando un pHmetro, misurare il pH dell'aliquota AUM da 10 mL, che dovrebbe essere ~pH 6,1 (±0,2). L'AUM preparato è stabile a temperatura ambiente per circa un mese e deve essere scartato in caso di precipitazioni o nuvolosità.

2. Impostazione del modello di vescica in vitro

  1. Inserire un catetere di Foley nella camera di vetro centrale del modello vescicale in vitro (schema dettagliato nella Figura 1). Fissare il catetere in posizione gonfiando il palloncino con la siringa di acqua sterile in dotazione e fissare la sacca dei rifiuti alla porta del catetere.
  2. Collegare il dispositivo modello di vescica in vitro 45 al serbatoio AUM tramite un tubo di collegamento. Collegare il tubo del circuito multimediale alla pompa peristaltica secondo le istruzioni del produttore, assicurandosi che il tubo abbia una tensione adeguata senza essere allungato.
  3. Fissare i modelli di vescica in vitro ai supporti di bloccaggio e fissare i sacchetti dei rifiuti nei supporti sotto i modelli per garantire il flusso attraverso i modelli per gravità.
  4. Collegare la camera esterna del modello a vescica a un bagno d'acqua circolante tramite un tubo in silicone (Figura 1B). Portare il bagnomaria a 37 °C e accendere i circolatori del serbatoio.
    1. Far funzionare i bagni d'acqua per 30 minuti prima di inoculare i modelli di vescica in vitro per garantire che la temperatura sia stabile a 37 °C e assicurarsi che il bagno d'acqua rimanga rabboccato fino al livello dell'acqua appropriato per tutta la durata della sperimentazione.
  5. Rimuovere eventuali morsetti dal tubo del terreno e impostare le pompe peristaltiche in modo che funzionino a circa 0,75 ml/min per replicare la produzione di urina umana (~1080 mL/giorno). Le portate effettive saranno calcolate durante la sperimentazione.
  6. Eseguire l'AUM attraverso i modelli vescicali in vitro tramite la pompa peristaltica per 30 minuti prima dell'inoculazione per confermare che il flusso del terreno sia a una velocità costante e che il sistema di drenaggio sterile sia intatto.
  7. Scolare il materiale accumulato dal sacchetto dei rifiuti prima della sperimentazione. Il volume del fluido può essere misurato per calcolare le portate esatte (dettagliate nel passaggio 4).

3. Inoculazione di modelli vescicali in vitro

  1. Preparare colture notturne per modelli di vescica in vitro sospendendo un anello di colonie batteriche coltivate su agar solido in 10 ml di brodo LB. Incubare per una notte a 37 °C con agitazione.
    NOTA: Il modello vescicale in vitro può essere utilizzato per studiare una varietà di agenti patogeni CAUTI, compresi i ceppi positivi all'ureasi come il Proteus mirabilis, e i terreni di crescita utilizzati possono essere modificati di conseguenza.
  2. Centrifugare l'intero volume di coltura notturna a 4.500 x g per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 10 mL di AUM e misurare l'assorbanza a OD595 nm utilizzando uno spettrometro.
  3. Normalizzare le colture risospese a un OD595 nm di 1,0 e un volume finale di 10 mL in AUM utilizzando la seguente equazione:
    figure-protocol-1
    dove, A1 è l'assorbanza a OD600 nm della coltura notturna, A2 è l'assorbanza desiderata aOD 600 nm dell'inoculo (1,0), V2 è il volume desiderato dell'inoculo (10 mL) e V1 è il volume richiesto di coltura notturna per la normalizzazione.
    NOTA: 10 mL di una sospensione OD595 nm 1.0 garantiranno l'inoculazione dei modelli con circa10-10 CFU della maggior parte dei ceppi batterici (convalidati per Proteus mirabilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus), replicando un'infezione consolidata. L'inoculo iniziale può essere modificato a seconda della specie utilizzata o dello stadio di infezione da modellare (ad esempio, una densità di inoculo inferiore può essere utilizzata per simulare l'infezione in fase iniziale)47.
  4. Sterilizzare i modelli di vescica in vitro utilizzando etanolo al 70% e rimuovere il tappo (ingresso del terreno) in modo che la camera interna sia accessibile. Rimuovere 10 mL di AUM dal volume all'interno del modello di vescica utilizzando una pipetta sierologica.
    NOTA: Durante l'inoculazione e il campionamento di modelli in vitro dalla camera centrale, assicurarsi che il lavoro sia rapido e asettico, indossare sempre DPI adeguati e decontaminare regolarmente guanti e superfici con etanolo al 70%.
  5. Inoculare i modelli vescicali in vitro attraverso la camera centrale utilizzando l'intera sospensione normalizzata da 10 mL e mescolare accuratamente con una pipetta sierologica. Rimuovere 10 mL dalla camera centrale dei modelli di vescica in vitro utilizzando una pipetta sierologica e aliquotare in una universale da 15 mL per i successivi calcoli di CFU/mL e la misurazione del pH.
  6. Decontaminare accuratamente le superfici esterne del modello di vescica e del tappo con etanolo al 70% e sostituire il tappo. Riprendere brevemente il flusso del fluido per assicurarsi che il livello di AUM nella camera centrale raggiunga il foro dell'occhio, prima di interrompere il flusso.
  7. Lasciare che le colture si stabiliscano nel modello vescicale per 1 ora prima di attivare il flusso del terreno tramite la pompa peristaltica a ~0,75 mL/min.
  8. Mentre l'inoculo si stabilisce, preparare le diluizioni dal campione prelevato dalla camera centrale.
    1. Diluire in serie 100 μl di campione in 900 μl di PBS sterile fino a quando il campione non viene diluito a 10-7. Prelevare 10 μL di spot delle diluizioni in triplicato su un terreno solido appropriato e incubare a 37 °C per una notte.
    2. Dopo l'incubazione, contare le colonie su ciascuna piastra di diluizione e calcolare l'esatta CFU/mL dell'inoculo iniziale.
      NOTA: Se si utilizzano specie che sciamano, ad esempio Proteus mirabilis, utilizzare l'agar MacConkey senza sale (peptone 20,0 g/L, lattosio 10,0 g/L, sali biliari 5,0 g/L, rosso neutro 0,075 g/L e agar 12,0 g/L) per garantire che le singole colonie siano ancora visibili per facilitare il conteggio.
  9. Dopo 1 ora di incubazione, attivare il flusso del terreno tramite la pompa peristaltica per iniziare a far funzionare i modelli di vescica in vitro , annotando l'ora in cui i modelli vengono accesi.

4. Calcolo della portata del modello di vescica in vitro

  1. Una volta che i modelli in vitro sono stati inoculati e il flusso di terreno è iniziato, lasciare che i modelli funzionino per 4 ore. Mettere brevemente in pausa il flusso del fluido e raccogliere l'intero volume di AUM residuo dal sacco dei rifiuti in un matraccio tarato attraverso la porta di drenaggio. Prendere nota del volume raccolto.
    NOTA: La portata può essere calcolata dal volume di fluido raccolto nel passaggio 2.7., tuttavia è possibile ottenere portate più accurate eseguendo i modelli per un periodo più lungo (ad esempio, consigliato 4 ore) in quanto ciò riduce la probabilità che l'aria residua nel tubo del circuito del fluido influisca sulla portata calcolata.
  2. Riprendere il flusso del fluido attraverso la pompa peristaltica, assicurandosi che la porta di drenaggio del sacco dei rifiuti sia chiusa, per mantenere un sistema di drenaggio sterile.
  3. Per calcolare la portata effettiva dei modelli in vitro , utilizzare la seguente equazione:
    figure-protocol-2
    NOTA: Si consigliano portate nell'intervallo 0,55-1,0 mL/min per replicare la produzione di urina umana.
  4. Se la portata del fluido viene calcolata al di fuori dell'intervallo accettabile, eliminare la replica e regolare il numero di giri sulla pompa peristaltica in modo che rientri nell'intervallo accettabile.

5. Campionamento di cellule planctoniche dal modello vescicale in vitro

NOTA: I modelli di vescica in vitro dovrebbero essere campionati di routine durante la sperimentazione per monitorare la dinamica della popolazione. Tutti i modelli devono essere campionati immediatamente dopo l'inoculazione, nel punto di attivazione del flusso AUM, 4 ore dopo l'inoculazione (quando viene calcolata la velocità di flusso) e nel punto in cui i modelli vengono terminati (blocco o un punto finale predeterminato). Se si eseguono modelli per >24 ore, si consiglia di prelevare campioni ogni 24 ore per monitorare CFU/mL e di prelevare ulteriori campioni se richiesto dagli utenti.

  1. Decontaminare il tappo del modello a vescica con etanolo al 70% e rimuoverlo per accedere alla camera centrale.
  2. Evitando la punta del catetere e il palloncino, mescolare delicatamente il contenuto della camera centrale utilizzando una pipetta sierologica.
  3. Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere un campione da 10 ml dalla camera e trasferirlo in una provetta sterile. Decontaminare immediatamente il tappo con etanolo al 70% e sostituirlo, completando il circuito di drenaggio sterile e chiuso.
  4. Rimuovere 1 mL dal campione utilizzando una pipetta e aliquotare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per diluizioni seriali.
  5. Misurare il pH del campione rimanente utilizzando un pHmetro, assicurandosi che il campione sia accuratamente miscelato e che il pHmetro sia calibrato prima dell'uso.
  6. Diluire in serie l'aliquota di 1 mL riservata dal campione e piastrare su un terreno solido appropriato come descritto in precedenza al punto 3.8., distribuendo tutte le diluizioni.
    NOTA: I campioni planctonici prelevati dal modello vescicale sono appropriati per altre analisi, comprese le applicazioni genomiche o di biologia molecolare (opzionali).

6. Campionamento di cellule associate al biofilm dal modello vescicale in vitro

  1. Rimozione e preparazione del catetere
    NOTA: Il campionamento su biofilm di modelli vescicali in vitro è un'analisi degli endpoint che richiede la disattivazione dei modelli e la rimozione dei cateteri per l'elaborazione.
    1. Scollegare la sacca dei rifiuti dal cateto e drenare l'urina residua dal modello sgonfiando il palloncino. Rimuovere il catetere dalla parte inferiore del modello utilizzando una pinza sterile.
    2. Posizionare il catetere rimosso su una tavola sterile e, utilizzando un bisturi sterile, tagliare il catetere nei punti necessari per il sezionamento (descritti nella Figura 2).
    3. Assicurarsi che le sezioni del catetere siano tagliate longitudinalmente per esporre il lume; quindi, utilizzando una pinza sterile, immergere la sezione del catetere 3 volte in PBS sterile per rimuovere le cellule non aderenti.
      NOTA: Se si esegue l'imaging di sezioni di catetere a valle, ad esempio utilizzando il SEM, lasciare intatte le sezioni di 1 cm (non tagliare longitudinalmente) e rimuovere invece l'umidità in eccesso dal lume con un tovagliolo di carta sterile prima del fissaggio.
  2. Disgregazione del biofilm per l'enumerazione di CFU/mL
    NOTA: I protocolli che descrivono in dettaglio la distruzione delle cellule associate al biofilm possono richiedere un'ulteriore ottimizzazione se i biofilm sono ampiamente cristallini o mucoidi.
    1. Incubare la sezione del catetere preparata in tripsina allo 0,25% a 37 °C per 30 minuti. Il volume di tripsina utilizzato deve essere il minimo richiesto per coprire il catetere; ad esempio, per una sezione di catetere di 1 cm tagliata perpendicolarmente, è sufficiente 1 mL di tripsina allo 0,25%.
    2. Dopo l'incubazione, sonicare la soluzione contenente il catetere per 10 minuti. La sezione del catetere può quindi essere rimossa e scartata. Per disattivare la tripsina, la soluzione cellulare deve essere immediatamente diluita in PBS sterile e impiattata per la conta delle CFU su un terreno solido appropriato, come descritto in precedenza al punto 3.8.
  3. Quantificazione del biofilm del catetere tramite colorazione cristallovioletta
    1. Aggiungere le sezioni del catetere preparate ai pozzetti in una piastra a pozzetti a fondo piatto di dimensioni adeguate. Utilizzare un volume appropriato di soluzione di cristallovioletto allo 0,1% per immergere completamente la sezione del catetere e incubare staticamente a temperatura ambiente per 15 minuti. Assicurarsi che sia inclusa anche una sezione sterile del catetere come controllo dello sfondo.
    2. Rimuovere le sezioni del catetere dalla placca e trasferirle su una nuova placca. Lavare due volte ogni sezione del catetere in acqua distillata.
    3. Dopo il risciacquo, trasferire le sezioni del catetere su una nuova piastra e coprire con acido acetico al 33%. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere la sezione del catetere dalla placca e quindi, utilizzando un lettore di piastre, misurare OD595 nm per ciascuna replica, utilizzando i pozzetti che contenevano le sezioni sterili del catetere come controlli di fondo.

7. Test di sensibilità antimicrobica nel modello vescicale in vitro

NOTA: La maggior parte delle terapie volte a controllare l'infezione del tratto urinario associata al catetere sono compatibili con i cateteri di Foley standard, verificare la compatibilità prima di iniziare gli esperimenti su modelli di vescica in vitro .

  1. Gel lubrificanti antimicrobici
    NOTA: Per simulare l'uso di agenti lubrificanti durante l'inserimento del catetere, questo passaggio deve essere eseguito durante il passaggio 2.1, immediatamente prima dell'inserimento del catetere di Foley. Dopo aver inserito il catetere, il modello deve essere immediatamente collegato e il passaggio 2.6. deve essere omesso in modo che il gel non venga diluito e drenato prima dell'inoculazione. L'inoculazione deve avvenire lo stesso giorno dell'inserimento del catetere. Gli agenti lubrificanti progettati per l'uso con i cateteri sono confezionati come siringhe singole, sterili e monouso da 6 mL o 11 mL di volume. Circa 5 ml di lubrificante sono sufficienti per riempire sia il collo del modello a vescica che rivestire la base del modello.
    1. Utilizzando la tecnica asettica, inserire l'estremità della siringa contenente l'agente lubrificante nel collo del modello di vescica e inserire 5 ml di gel per riempire il collo ed entrare nella base della camera.
    2. Ruotare il modello in modo che la base sia rivestita uniformemente di gel, quindi inserire un catetere di Foley nel modello spingendo la punta del catetere attraverso il gel e fissarlo riempiendo il palloncino normalmente.
    3. Collega il modello al resto della configurazione, quindi riempi il lume del modello con l'urina fino a quando non inizia a drenare. Non appena l'urina inizia a defluire attraverso il foro dell'occhio del catetere, arrestare la pompa per evitare la perdita di gel prima dell'inoculazione.
      1. Incubare i modelli per 30 minuti per consentire all'urina di raggiungere i 37 °C, quindi inoculare i modelli come descritto in precedenza per garantire l'uniformità del tempo di diffusione dei componenti del gel nel volume delle urine.
    4. Inoculare il modello come descritto al punto 3.5 e lasciarlo incubare per 1 ora prima di accendere le pompe peristaltiche. Al momento dell'accensione della pompa, prelevare un campione planctonico da 1 mL ed estrarre le diluizioni per la conta delle UFC, come descritto al punto 3.8.
  2. Soluzioni per l'irrigazione
    NOTA: Le soluzioni di irrigazione sono spesso disponibili all'ingrosso o come "buste" individuali, sterili e monouso. Se si utilizzano soluzioni individuali, assicurarsi che siano compatibili con le porte di drenaggio dei cateteri da utilizzare prima della sperimentazione. Se si utilizzano soluzioni di irrigazione di massa, assicurarsi che vengano utilizzati cateteri a triplo lume e che vengano seguite le istruzioni del produttore per determinare il volume/i tempi di somministrazione del prodotto.
    1. Prima del trattamento, eseguire modelli in vitro per almeno 4 ore per garantire che le comunità associate al biofilm abbiano avuto il tempo sufficiente per stabilirsi. Una volta che i modelli sono stati eseguiti per 4 ore, mettere in pausa il flusso del terreno e prelevare un campione di pretrattamento dalla camera interna dei modelli in vitro , come descritto nella fase 5.
      NOTA: Se si utilizzano soluzioni di irrigazione di massa, procedere al passaggio 7.2.5.
    2. Se si utilizza una "sacca" di irrigazione individuale, scollegare la sacca di scarto dal catetere e utilizzare il tappo fornito con la sacca per sigillare la sacca di scarto. Collegare immediatamente la sacca della soluzione di irrigazione al catetere e, esercitando una leggera pressione, spremere il prodotto nel lume centrale. Applicare come indicato dalle istruzioni del produttore (ad esempio, 15 minuti di applicazione).
    3. Una volta completato il trattamento consigliato, lasciare che la soluzione residua defluisca dalla camera interna attraverso il foro dell'occhiello del catetere nella sacca di irrigazione, quindi scollegare la sacca. Il contenuto rimanente della busta può essere scartato o utilizzato per ulteriori applicazioni a valle.
    4. Sterilizzare la porta di drenaggio del catetere e la porta di collegamento della sacca di scarto con etanolo al 70% e ricollegarle, completando un sistema di drenaggio sterile e chiuso.
      NOTA: Continuare con il passaggio 7.2.7 se si utilizzano sacchetti per l'irrigazione.
    5. Se si utilizza un catetere a triplo lume, disinfettare la porta del lume di irrigazione con etanolo al 70% e iniziare immediatamente a irrigare utilizzando una siringa sterile secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: Misurare il volume di urina residua nel sacchetto dei rifiuti prima di irrigare in modo che possa essere preso in considerazione in qualsiasi calcolo del tempo di blocco a valle o della portata.
    6. Una volta completata l'irrigazione, gettare la siringa e l'eventuale soluzione di irrigazione residua rimasta nel sacchetto dei rifiuti.
    7. Prelevare un campione post-trattamento dalla camera centrale del modello di vescica in vitro , come descritto nella fase 5, e riprendere il flusso di AUM tramite la pompa peristaltica per continuare la sperimentazione.

8. Terminare la sperimentazione in vitro del modello vescicale

NOTA: Gli organismi positivi all'ureasi come P. mirabilis possono causare l'ostruzione dei cateteri urinari attraverso la formazione di biofilm cristallino. L'ostruzione può quindi essere utilizzata come endpoint biologicamente rilevante per i modelli vescicali in vitro ed è identificata visibilmente dall'occlusione completa dei fori oculari del catetere con biofilm cristallini e da un aumento del volume di AUM nella camera centrale della "vescica" di vetro (Figura 3).

  1. Una volta che i modelli vescicali in vitro sono stati eseguiti fino all'endpoint predeterminato, che può essere un blocco o un tempo di esecuzione definito, spegnere il flusso AUM tramite la pompa peristaltica e prelevare un campione finale dalla camera centrale come descritto nella fase 5.
  2. Chiudere il flusso del bagno d'acqua e scollegare il circuito del fluido e il tubo del circuito del bagno d'acqua dai modelli a vescica in vitro .
  3. Rimuovere i tappi dai modelli di vescica in vitro e rimuovere l'intero volume di urina residua utilizzando una pipetta sierologica. Eliminare in modo appropriato qualsiasi mezzo contaminato (ad esempio, sterilizzare in autoclave).
  4. Svuotare i sacchetti dei rifiuti ed eliminare eventuali residui di materiale. Scollegare le sacche per i rifiuti del catetere dalla porta del catetere e gettarle.
  5. Utilizzando una siringa, sgonfiare lentamente i palloncini del catetere prima di rimuovere i cateteri dai modelli.
    NOTA: Se si utilizzano specie batteriche ureasi-positive, i cateteri possono rimanere "bloccati" alle pareti di vetro dei modelli in vitro . Evitare di applicare grandi quantità di forza ai cateteri, quindi procedere al passaggio 8.6.
  6. Immergere i modelli in vitro in una soluzione detergente antimicrobica al 5% (vedere la tabella dei materiali) per una notte, quindi lavare accuratamente con acqua per assicurarsi che eventuali residui di disinfettante vengano rimossi. Autoclave per sterilizzare.
    NOTA: Se si utilizzano specie ureasi-positive, aggiungere il 5% p/v di acido citrico alla soluzione disinfettante per aiutare a sciogliere la biomineralizzazione nella camera centrale. Questa soluzione acida aiuterà anche a rilasciare eventuali cateteri che si sono attaccati ai modelli rompendo i depositi di biofilm cristallino.
  7. Scollegare il tubo del circuito del fluido dal serbatoio AUM ed eliminare eventuali residui di fluido. Sciacquare il tubo con acqua per rimuovere eventuali residui di AUM e autoclave.
  8. Per calcolare il tempo esatto di intasamento, annotare il volume finale nel sacco dei rifiuti e utilizzare l'equazione al passaggio 4.4 e la portata precedentemente calcolata per determinare il tempo di intasamento.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il successo del funzionamento del modello vescicale in vitro dipende dalla pratica di una buona tecnica asettica e da un'attenta osservazione della torbidità dei mezzi durante la sperimentazione (Figura 3). Prima dell'inoculazione, l'AUM sterile era di colore giallo pallido e trasparente nella camera centrale del modello vescicale in vitro (Figura 3A). L'AUM nel serbatoio del terreno deve rimanere chiara durante la sperimentazione, poiché qualsiasi variazione di torbidità che si verifica può indicare la precipitazione di sali dalla soluzione o la contaminazione del terreno. Se l'AUM nel serbatoio del fluido o nel tubo del circuito del fluido diventa torbido o mostra un drastico cambiamento di colore, le repliche devono essere scartate e ripetute. Dopo l'inoculazione, è chiaramente visibile un aumento della torbidità dell'AUM nella camera centrale del modello vescicale in vitro (Figura 3B). I cambiamenti nella torbidità sono spesso più pronunciati negli organismi ureasi-positivi come P. mirabilis, ma dovrebbero comunque essere visibili dopo l'inoculazione negli organismi ureasi-negativi. Dopo l'avvio del flusso di AUM, si osserva spesso una riduzione della torbidità dell'AUM quando le cellule planctoniche vengono lavate via e non indica una mancanza di cellule vitali nel modello. L'osservazione del livello del fluido nella camera centrale può essere utilizzata anche per determinare il tempo di blocco se si utilizzano organismi ureasi-positivi (Figura 3C). Mentre i modelli sono in funzione, l'occhiello e la punta del catetere devono essere completamente visibili per indicare il corretto drenaggio nei sacchetti dei rifiuti. In caso di blocco, il livello di AUM nella camera centrale salirà al di sopra dei fori per gli occhi e la punta del catetere, indicando che l'esperimento è pronto per qualsiasi lettura e terminazione del punto finale. Durante la sperimentazione, gli effetti della pressione nel circuito multimediale del modello di vescica in vitro possono far apparire i modelli bloccati. Se si sospetta un'ostruzione, verificare che il circuito AUM, il catetere e il tubo del sacchetto dei rifiuti siano tesi prima di terminare il test, poiché eventuali bolle d'aria o attorcigliamenti nel tubo possono causare "sacche d'aria" e impedire il drenaggio del catetere.

Durante gli esperimenti in vitro su modelli di vescica, il campionamento planctonico può fornire preziose informazioni sulle dinamiche di crescita all'interno del modello e sulla progressione di CAUTI. La crescita cellulare, il pH e la formazione di biofilm possono essere monitorati durante la sperimentazione senza richiedere la terminazione dei modelli (Figura 4). Se si utilizzano organismi urasi-positivi, i calcoli del tempo di blocco possono essere utilizzati come misura del tasso di formazione del biofilm e utilizzati per confrontare le proprietà di diversi ceppi batterici (Figura 4). Il confronto tra un ceppo wild-type di P. mirabilis e un mutante LPS (mini-tn5 insertion in waaC) ha dimostrato un'estensione del tempo di blocco e quindi una ridotta formazione di biofilm nel mutante (Figura 4). Gli organismi ureasi-negativi in genere non bloccano i modelli vescicali in vitro e si raccomanda quindi di determinare un endpoint prestabilito prima della sperimentazione. In alcuni casi, i microrganismi ureasi-negativi possono provocare il blocco del catetere. Ad esempio, i ceppi di Klebsiella pneumoniae negativi all'ureasi possono produrre ampi biofilm mucoidi, tuttavia, questi in genere impiegano molto più tempo dei biofilm positivi all'ureasi per bloccare il drenaggio, quindi si raccomanda ancora un endpoint prestabilito.

La misurazione del pH durante la sperimentazione di modelli di vescica può anche fornire informazioni sulle differenze tra ceppi e ceppi, nonché sui progressi di CAUTI. Se vengono utilizzati organismi ureasi-negativi, il pH nella camera centrale del modello di vescica in vitro dovrebbe rimanere in gran parte stabile durante la sperimentazione, anche se sono previste piccole fluttuazioni del pH man mano che la dinamica della popolazione cambia nel corso dell'esperimento. L'inoculazione di modelli in vitro con organismi positivi all'ureasi determina un aumento significativo del pH nel tempo, con il pH più alto che di solito si osserva al momento del blocco, dove si possono osservare letture di pH fino a ~8-9 (Figura 4B).

L'enumerazione delle CFU/mL planctoniche è una componente importante della modellazione vescicale in vitro , che consente agli operatori di valutare se l'inoculazione ha avuto successo e di monitorare l'andamento della sperimentazione. La misurazione di CFU/mL al termine della sperimentazione può evidenziare eventuali differenze nella colonizzazione vescicale tra diversi ceppi batterici. Confrontando il ceppo mutante mini-Tn5 di P. mirabilis con il wild-type, è stata osservata una significativa riduzione di CFU/mL al momento del blocco (Figura 4C). Inoltre, l'enumerazione delle CFU dai biofilm sulla superficie del catetere e la quantificazione della biomassa del biofilm possono fornire informazioni sulla capacità di diversi patogeni di colonizzare il tratto urinario cateterizzato. I coloranti cristallovioletto sono stati utilizzati per determinare le differenze nella formazione del biofilm tra un ceppo di P. mirabilis HI4320 wild-type e gli isolati passati in clorexidina (Figura 5). Le misure di densità ottica a 595 nm hanno dimostrato che gli isolati passati in clorexidina hanno mostrato una riduzione della formazione di biofilm rispetto al wild-type e ai controlli passati in assenza di clorexidina.

Poiché l'obiettivo del modello vescicale in vitro è quello di replicare accuratamente la nicchia CAUTI, i modelli possono essere utilizzati anche per studiare gli effetti delle terapie antimicrobiche volte a trattare CAUTI in un ambiente clinicamente rilevante. Per gli organismi ureasi-positivi, il confronto dei tempi di blocco dei modelli trattati con i modelli non trattati può fornire informazioni utili sull'efficacia del trattamento. Il trattamento di modelli vescicali in vitro inoculati con P. mirabilis con una soluzione di irrigazione vescicale di clorexidina allo 0,02% ha prolungato significativamente il tempo di blocco rispetto ai modelli che non sono stati trattati o trattati con soluzione fisiologica allo 0,9% (Figura 6A). Inoltre, il modello vescicale in vitro può essere utilizzato per studiare l'attività battericida delle terapie antimicrobiche. Il monitoraggio delle variazioni di CFU/mL delle cellule planctoniche e associate al biofilm dopo il trattamento antimicrobico può indicare se i trattamenti sono efficaci. Il trattamento di modelli vescicali in vitro inoculati con P. mirabilis ha dimostrato una riduzione di >7 log di CFU/mL planctonica immediatamente dopo il trattamento, rispetto ai modelli non trattati e irrigati con soluzione salina allo 0,9% quando applicato secondo le istruzioni del produttore (Figura 6B).

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Figura 1: Schema dei principali componenti del modello vescicale in vitro . (A) Il modello a vescica (sistema di drenaggio chiuso): (1) camera di vetro a doppia parete che simula l'ingresso del fluido a vescica (2), l'AU viene fornita tramite pompa peristaltica alla camera interna del modello a vescica (3) ingresso dell'acqua fornito tramite bagno d'acqua circolante alla camera esterna (4) uscita dell'acqua (5) catetere di Foley, inserito nella camera interna (6) punto di connessione del lume di drenaggio; Punto di collegamento per sacco per rifiuti/sacche per irrigazione (7) Sacca di drenaggio per la raccolta del deflusso dell'urina. (B) Schema che descrive l'impostazione del modello di vescica in vitro e la direzione del flusso di mezzi e acqua attraverso il modello. L'urina artificiale viene conservata in un serbatoio di terreno (1) a temperatura ambiente e fornita al modello tramite una pompa peristaltica (2) a una velocità di flusso costante di ~ 0,75 mL min-1 per la durata dell'esperimento. Il terreno fluisce nella camera centrale del recipiente di vetro a doppia parete che rappresenta la vescica (3) e defluisce attraverso l'occhiello di un catetere di Foley (4) in una sacca di drenaggio (5), completando il sistema di drenaggio sterile chiuso. Il modello di vescica in vitro viene mantenuto a una temperatura costante di 37 °C tramite un bagno d'acqua circolante (6), che scorre attraverso la camera esterna del recipiente di vetro a doppia parete. Le linee tratteggiate rappresentano i tubi in silicone e le frecce rappresentano la direzione del flusso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Sezionamento di cateteri urinari per elaborare le cellule associate al biofilm. Punti di esempio su un catetere urinario per la dissezione per la quantificazione del biofilm a valle. (A) I cateteri vengono prima sezionati latitudinalmente nella regione di 8 cm prossimale alla punta/fori per gli occhi (dove si osserva la maggior parte della formazione di biofilm). Le sezioni di 1 cm vengono rimosse con un bisturi, generalmente evitando la regione contenente il palloncino del catetere sgonfio a causa delle difficoltà di riproducibilità della lavorazione (1-3). (B) Una volta che i cateteri sono stati inizialmente sezionati in pezzi di 1 cm, viene eseguito un altro taglio longitudinale lungo il lume centrale per esporre l'eventuale biofilm presente per un'ulteriore quantificazione del biofilm, ad esempio l'enumerazione CFU/mL della colorazione con cristallovioletto. Le linee tratteggiate rappresentano i punti di dissezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Fasi di un esperimento in vitro su modello di vescica. Immagini del modello vescicale in vitro della camera centrale, attraverso le diverse fasi della sperimentazione. (A) AUM nella camera centrale del modello vescicale in vitro prima dell'inoculazione. Il terreno nella camera centrale è completamente trasparente, indicando l'esito positivo della sterilizzazione, mentre la punta del catetere e i fori per gli occhielli sono visibili sopra la linea del terreno, indicando che il catetere sta drenando correttamente. (B) Terreni nella camera centrale del modello vescicale in vitro dopo l'inoculazione con P. mirabilis (4 ore dopo l'inoculazione). Il successo dell'inoculazione è indicato dall'aumento della torbidità del terreno. La visibilità della punta del catetere e dei fori per gli occhi indica che l'AUM sta drenando correttamente attraverso il catetere e che non si è verificato alcun blocco. (C) Un esempio di modello di vescica bloccata in vitro . L'inoculazione con P. mirabilis e la successiva formazione e mineralizzazione del biofilm hanno provocato l'ostruzione dei fori oculari del catetere, impedendo il drenaggio e causando l'innalzamento del livello del terreno nella camera centrale al di sopra della punta del catetere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Le misurazioni del punto finale per un modello di vescica in vitro vengono eseguite fino al blocco. Esempi di misurazioni dell'endpoint al momento del blocco da un modello vescicale in vitro inoculato con un ceppo clinico di P. mirabilis, RS47 (WT), e un ceppo mutante con formazione di biofilm attenuata, RS47-2 (mutante). (A) Tempo di blocco (h) di WT e ceppi mutanti di P. mirabilis. (B) pH di modelli vescicali in vitro al momento del blocco. (C) CFU/mL di cellule planctoniche in camera modello vescicale in vitro al momento del blocco. Tutti i dati rappresentano la media di cinque repliche biologiche. Le barre di errore mostrano l'errore standard della media (SEM). *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Questa cifra è stata modificata da Clarke et al.46. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Misurazioni delle cellule associate al biofilm dal modello vescicale in vitro . Quantificazione della formazione di biofilm di P. mirabilis , confronto del ceppo wild-type HI4320 con popolazioni adattate passate con o senza clorexidina (CHD) tramite colorazione cristallovioletto e misurazione della densità ottica (OD) a 595 nm. WT: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: controlli di passaggio senza esposizione CHD; 2, 4, 6: HI4320 è passato in 4 μg/mL di CHD. Tutti i dati rappresentano la media di cinque repliche biologiche. Le barre di errore mostrano SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Misurazioni da modelli di vescica in vitro dopo il trattamento antimicrobico. I campioni planctonici sono stati prelevati da un modello di vescica in vitro inoculato con P. mirabilis, dopo l'irrigazione con una soluzione antimicrobica di clorexidina allo 0,02% (100 mL) o un controllo salino allo 0,9%. (A) Tempo di blocco di modelli vescicali in vitro dopo l'irrigazione. (B) CFU/mL planctonico immediatamente dopo il trattamento di irrigazione. Tutti i dati rappresentano la media di cinque repliche biologiche. Le barre di errore mostrano SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; *p ≤ 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Il tratto urinario cateterizzato rappresenta una nicchia biologica complessa che può essere difficile da replicare in un ambiente di laboratorio. Il modello vescicale in vitro è stato progettato allo scopo di simulare CAUTI e utilizza cateteri urinari standard per replicare il sistema di drenaggio sterile e chiuso utilizzato nella pratica clinica. Il tratto urinario cateterizzato è altamente suscettibile alle infezioni, come evidenziato dai cateteri urinari che sono il principale fattore di rischio per lo sviluppo di CAUTI 6,55. In proporzione, un'attenta tecnica asettica è fondamentale per il successo dell'esecuzione di modelli vescicali in vitro. La torbidità dell'AUM è un chiaro indicatore di sterilità, poiché i terreni contaminati o scaduti diventeranno torbidi nel tempo, richiedendo l'eliminazione di tutte le repliche. Un'attenta tecnica asettica dovrebbe essere utilizzata anche durante l'inoculazione e il campionamento del modello vescicale in vitro, poiché l'apertura della camera centrale per aggiungere l'inoculo preparato rompe il sistema di drenaggio sterile e chiuso, rendendo il modello vescicale in vitro suscettibile di contaminazione. Per evitare la contaminazione della camera centrale, è possibile utilizzare cateteri a triplo lume per campionare la popolazione di cellule planctoniche (bloccando il lume di scarto e drenando attraverso il lume aggiuntivo). È previsto un certo washout al punto temporale di 4 ore, ma potrebbe essere necessaria la risoluzione dei problemi se a questo punto non vengono enumerate cellule planctoniche vitali. Se dopo 4 ore non vengono enumerate cellule vitali, potrebbe essere necessario ottimizzare la densità dell'inoculo o la formulazione AUM utilizzata per supportare meglio la colonizzazione batterica. Inoltre, il dilavamento dell'inoculo può indicare un problema con il circuito dei media; Le pieghe all'interno del tubo potrebbero impedire un drenaggio adeguato, con conseguente accumulo di metaboliti tossici che possono ostacolare la crescita batterica, mentre qualsiasi disinfettante residuo utilizzato per fluire attraverso il tubo del terreno potrebbe avere un effetto battericida.

Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione dell'AUM come precedentemente descritto da Nzakizwanayo et al., poiché è stato precedentemente convalidato per l'uso nel modello vescicale in vitro con importanti patogeni CAUTI, tra cui Proteus mirabilis ed Escherichia coli 43,45,46,48 . Tuttavia, c'è spazio per modificare la formulazione AUM utilizzata nel protocollo per selezionare la crescita di altri patogeni. Sono state pubblicate numerose e diverse formulazioni di AUM che potrebbero invece essere utilizzate nel circuito dei media 28,56,57,58,59,60. Inoltre, l'AUM nel serbatoio del terreno può essere integrata con nutrienti o antibiotici per selezionare la crescita di agenti patogeni specifici. Storicamente, i modelli vescicali in vitro sono stati forniti anche con urina umana aggregata, tuttavia, i grandi volumi di terreno necessari per eseguire una replica di un modello vescicale in vitro possono rendere impraticabile la raccolta di campioni umani53,54. Inoltre, la composizione dell'urina umana può variare notevolmente tra i campioni dei pazienti, influenzando la riproducibilità dell'esperimento, poiché è stato dimostrato che le differenze nella concentrazione di ormoni, sali e proteine, nonché lo stato di idratazione, influenzano la crescita batterica e la formazione di biofilm 38,39,61,62.

Il protocollo di cui sopra descrive in dettaglio l'inoculazione del modello vescicale in vitro con ~1010 CFU/mL di CAUTI replicante in stadio avanzato. Tuttavia, il sito di inoculazione del modello vescicale in vitro potrebbe essere modificato nei test futuri per replicare meglio le fasi precedenti della CAUTI, ovvero la colonizzazione iniziale del catetere urinario e l'ascensione nella vescica. La contaminazione manuale dei cateteri di Foley con un inoculo batterico noto prima della messa a punto di modelli in vitro potrebbe fornire informazioni sulle prime fasi della CAUTI. In effetti, la densità dell'inoculo è stata modificata in lavori precedenti per replicare l'infezione in fase iniziale; ad esempio, Nzakizwanayo et al. modelli vescicali inoculati in vitro con un CFU/mL iniziale inferiore (ca. 103 CFU/mL) per replicare l'infezione in stadio precedente47. Vale la pena, tuttavia, notare che l'alterazione della densità dell'inoculo può comportare un tempo prolungato per il blocco e richiede un'ulteriore convalida prima della sperimentazione.

Inoltre, mentre il protocollo descrive in dettaglio l'inoculazione del modello in vitro con monocoltura batterica, c'è la possibilità di inoculare i modelli con patogeni fungini. Lavori precedenti hanno suggerito che fino all'8% delle CAUTI deriva da infezione da Candida spp., che è in grado di produrre biofilm che sono spesso recalcitranti al trattamento antimicotico27,63. Inoltre, il modello vescicale in vitro può essere modificato per ospitare lo studio della CAUTI polimicrobica. In effetti, è stato suggerito che fino all'86% delle CAUTI sono polimicrobiche e queste infezioni sono spesso associate a sintomi più gravi e a un tasso di mortalità più elevato rispetto all'infezione da monospecie 27,64,65,69. I modelli in vitro possono essere inoculati con più specie per studiare la formazione di biofilm polimicrobici e la progressione di CAUTI, ma prima dell'inoculazione è necessario eseguire un'attenta convalida delle comunità polimicrobiche e la modifica della densità dell'inoculo. Studi precedenti hanno utilizzato il modello vescicale in vitro per monitorare le differenze nella formazione di biofilm in una singola specie di P. mirabilis CAUTI rispetto a due specie di CAUTI con E. faecalis, evidenziando l'interazione metabolica tra i ceppi, che ha portato a una maggiore formazione di biofilm rispetto all'infezione di una singola specie70.

Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo del modello vescicale in vitro per lo studio delle CAUTI è la capacità di osservare la formazione di biofilm sulla superficie di un catetere urinario standard. La formazione di biofilm nella CAUTI è spesso avviata dalla formazione di film di condizionamento sul lume del catetere, costituiti da componenti organici dell'urina a cui gli uropatogeni possono aderire, prima di proliferare e formare biofilm maturi 2,18,71,72,73. I saggi standard utilizzati per studiare la formazione del biofilm spesso utilizzano terreni di crescita batterica standard piuttosto che AUM e sono spesso basati sull'aderenza a micropiastre o pioli di polistirene, ad esempio il dispositivo di Calgary; tuttavia, lavori precedenti hanno suggerito che l'ambiente nutritivo, il pH e i livelli di ossigeno del sistema, nonché proprietà fisiche come il flusso e la differenza nella struttura superficiale (silicone vs plastica), possono influenzare la formazione del biofilm 36,37,74,75,76,77,78. Inoltre, la coltura di batteri con un'estesa attività ureasica, come P. mirabilis in un sistema chiuso in AUM, può provocare l'accumulo di metaboliti tossici, che possono provocare la morte cellulare78,79. Questo è mitigato nel modello vescicale in vitro poiché l'AUM nella camera centrale viene costantemente sostituita con terreni freschi attraverso il circuito dei terreni, consentendo lo studio dei biofilm CAUTI in condizioni clinicamente più rilevanti45. L'andamento quotidiano del modello vescicale in vitro e l'endpoint selezionato per i modelli dipendono in gran parte dal fatto che i modelli siano inoculati con organismi urasi positivi o negativi. In teoria, i modelli in vitro potrebbero funzionare all'infinito se forniti con un volume adeguato di AUM e se la sterilità del modello viene mantenuta; Tuttavia, si consiglia di selezionare un endpoint prima della sperimentazione, sia che si tratti di un blocco o di un numero arbitrario di giorni. In genere si raccomanda che i modelli in vitro inoculati con organismi uriasi-negativi vengano eseguiti per ≤7 giorni per simulare l'ambiente clinico, poiché ciò è in genere sufficiente per osservare la formazione di biofilm nella maggior parte degli organismi, pur mantenendosi in linea con gli interventi clinici, poiché le migliori pratiche standard indicano che i cateteri devono essere sostituiti una volta visibilmente infettati 1,2, 3,47,48. Sebbene sia probabile che gli organismi ureasi-positivi producano biofilm cristallini, c'è una grande quantità di variazioni all'interno dei ceppi ureasi-positivi nel tempo per il blocco del modello vescicale in vitro, con alcuni ceppi di Proteus mirabilis che causano il blocco del catetere in meno di 10 ore e altri che impiegano oltre 30 ore per bloccare39,46. Un test standard dell'ureasi potrebbe essere utilizzato prima della sperimentazione in vitro su un modello di vescica per determinare se eseguire modelli per il blocco o un endpoint predefinito80.

Forse il principale limite dell'utilizzo del modello vescicale in vitro per studiare la formazione del biofilm è che le misurazioni del biofilm sono una lettura del punto finale, in quanto richiedono la rimozione e la dissezione del catetere urinario. Al contrario, i campioni planctonici possono essere prelevati dal modello vescicale in vitro in qualsiasi momento durante la sperimentazione. Inoltre, una volta prelevati i campioni di biofilm dai modelli di vescica in vitro, è possibile utilizzare numerose tecniche aggiuntive a valle per quantificare meglio la produzione di biofilm. Studi precedenti hanno utilizzato la fotometria a fiamma per quantificare la quantità di calcio e magnesio presenti nei biofilm cristallini e colorazioni più complesse possono essere utilizzate per identificare con precisione i componenti della matrice EPS dei biofilm urasi-negativi 45,73,81,82,83,84.

Questo lavoro descrive anche l'applicazione del modello vescicale in vitro per studiare gli effetti di terapie volte al trattamento della CAUTI. Il modello vescicale in vitro simula aspetti importanti della nicchia CAUTI, come l'uso dell'AUM, nonché la formazione di biofilm clinicamente rilevante e l'aumento del carico organico osservato in CAUTI. Terapie come gli antibiotici possono essere aggiunte direttamente al serbatoio AUM per simulare la biodisponibilità dei farmaci clinicamente rilevante e studi precedenti hanno utilizzato farmaci riproposti come la tioridazina e la fluoxetina per dimostrare un effetto antibiofilm81. Inoltre, i saggi di concentrazione inibitoria minima e i test di sospensione batterica sono spesso utilizzati per dedurre l'attività antimicrobica dei biocidi, sebbene ci siano poche prove che suggeriscano che i saggi siano correlati alla suscettibilità ai biocidi nel mondo reale 41,85,86,87,88. Il modello vescicale in vitro è vantaggioso per la sperimentazione di biocidi volti al trattamento o alla prevenzione della CAUTI, in quanto la presenza del catetere urinario e la simulazione più rappresentativa della nicchia CAUTI consentono di testare prodotti come i gel lubrificanti antimicrobici e le soluzioni di irrigazione secondo le istruzioni del produttore. Studi precedenti hanno anche utilizzato il modello vescicale in vitro per determinare l'efficacia della terapia fagica e hanno dimostrato che il trattamento fagico potrebbe prolungare il tempo di P. mirabilis per bloccare il modello vescicale in vitro di oltre 100 ore47. L'uso di un catetere di Foley di dimensioni standard nel modello vescicale in vitro significa anche che i nuovi cateteri rivestiti possono essere analizzati per l'attività antimicrobica. Lavori passati di Slate et al. ha dimostrato che i cateteri rivestiti con un rivestimento teranostico di ciprofloxacina potrebbero prolungare il tempo di blocco di P. mirabilis di ~60 ore in un modello di vescica in vitro 48. Ciò evidenzia la potenziale applicazione del modello vescicale in vitro nello studio di nuove terapie volte al trattamento della CAUTI, consentendo una valutazione più accurata degli antimicrobici in una nicchia di CAUTI simulata biologicamente rilevante.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Dr. Jonathan Nzakizwanayo e il Dr. Anthony J. Slate per la loro esperienza condivisa nello sviluppo di questo protocollo. Il lavoro presso l'Università di Bath è stato finanziato dal Medical Research Council GW4 Biomed DTP come borsa di studio per V.B. (MR/N0137941/1). B. V. J. è anche sostenuto da finanziamenti del Dunhill Medical Trust (RPGF1906\171). La ricerca dell'O.E.C. è stata finanziata da Kidney Research Northwest (RCN: 1144798). La Figura 1 viene creata con Biorender.com.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Prolunga della testa della pompa a carico rapido 313 PompaWatson-Marlow313- estensione extra della testa della pompa 
323S/D pompa a velocità variabile a comando manualeWatson-Marlow323S/DPompa peristaltica
3L Sacchi da letto, sterili con rubinetti a leva Sanità del Grande Orso GDW173
Tubo in silicone polimerizzato al platino con diametro interno di 3 mmTubo per circuito AXM piccolo Fisher10111801(collegare il tubo della pompa ai modelli)
Tubo in silicone polimerizzato al platino con diametro interno di 5 mm Tubocircuito AUM medio Fisher 10539201 (collegare il tubo della pompa al serbatoio AUM)
cloruro di ammonio (NH4Cl)Fisher11473713
solfato di sodio anidro (Na2SO4)Fisher11498717
Azlon Connettore conico Fisher10712807Utilizzato per collegare diverse lunghezze di tubi nel circuito AUM
Ganci per sacchi da letto Sanità del Grande Orso 10705P
Pinze per tubi con rubinetto a pizzico Bochem, diametro 25 mmFisher11805101
cloruro di calcio (CaCl2)Fisher10021681
Acido citrico monoidrato MerckC1909-500GUtilizzato per rimuovere il biofilm cristallino dai modelli post-sperimentazione 
Fisherbrand  Pipette graduate in vetro di classe B di tipo 1 Fisher11992168Utilizzato per fornire modelli di blader in vitro con AUM tramite gelatina per tappo forato
VWR24360.233
Graphpad prism 10GraphPadV10.0Software analitico utilizzato per la rappresentazione grafica dei risultati dei modelli di vescica in vitro e l'analisi statistica.
Hanna HI 2211-02 Misuratore di pH da bancoPhillip Harris PP00057414
Modello in vitro vescica"...--Attrezzature su misura come precedentemente descritto da Nzakizwanayo et al. (2019).
Gel lubrificante Instillagel 6 mLmydoctorshop.co.uk40-006Gel lubrificanti utilizzati nella sezione 7.1.; altri fornitori sono disponibili.
Kartell Plastilab Connettore conico irregolareFisher 11914289Utilizzato per collegare tubi di diverso diametro
MacConkey agar senza sale (disidratato)Fisher10472643Per il conteggio di singole colonie di batteri sciami, ad esempio Proteus mirabilis
cloruro di magnesio esaidrato (MgCl2.6H2O)Fisher10386743
fosfato monopotassico (KH2PO4)Fisher10573181
Nalgene Connettore a forma di YFisher10186070Utilizzato per eseguire più circuiti AUM da un serbatoio AUM (1-4 modelli per serbatoio) 
potassio (KCl)Flacone10375810
Pyrex con presa laterale in vetro smerigliato, capacità: 5000 mL11347884AUM
serbatoio Tappi in gomma con foro, diametro esterno: 37 mm, rosso, diametro: 37 mmFisher11517612Utilizzato nel serbatoio AUM e per fornire modelli in vitro con AUM
Taglia 14 francese 100 % silicone Catetere di Foley con siringa sterile di acqua per il gonfiaggio Sanità del Grande Orso 4833-0514
cloruro di sodio (NaCl)Fisher10735921
ossalato di sodio (Na2C2O4)Fisher10442211
Teknon Biocleanse detergente biocida concentrato 5L Fisher12447580Utilizzato per sterilizzare modelli post-sperimentazione
citrato trisodico (Na3C6H5O7)Fisher11434993
brodo di soia triptone
urea (CH4N2O)Fisher10404185
Uro-Tainer M NaCl 0,9%B.BraunFB99833Sacca per irrigazione della vescica salina utilizzata nella sezione 7.2.
Tubi in silicone polimerizzato platino Watson-Marlow Pumpsil con diametro interno di 1,6 mmAUM spesso Fisher12406280(per l'uso in pompe verticali)
peristaltica per cloruro di aspiratore Fisher Fisher Fisher 10198002 Tubo per circuito

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