Articolo metodologico

Identificazione della microglia e dei macrofagi infiltranti periferici nel midollo spinale danneggiato mediante citometria a flusso

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DOI:

10.3791/67967

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24 giugno 2025

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1Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Laboratory Medicine, Bengbu Medical University, 3Anhui Province Key Laboratory of Immunology in Chronic Diseases, Bengbu Medical University, 4The Second Affiliated Hospital of South China University, 5Anhui Province Key Laboratory of Basic and Translational Research of Inflammation-related Diseases, Bengbu Medical University

In questo articolo

Sommario

L'identificazione delle microglia (MG) e dei macrofagi infiltranti periferici (Mø) nel midollo spinale danneggiato è difficile. In questo protocollo, la citometria a flusso (FCM) è stata utilizzata per identificare rispettivamente M1-like MG, M2-like MG, M1-like Mø e M2-like Mø. Questa tecnologia può essere applicata anche ad altre malattie del sistema nervoso centrale per comprendere il ruolo di MG e Mø.

Abstract

In un midollo spinale sano, i macrofagi infiltranti periferici sono quasi non rilevabili e le microglia (MG) partecipano al mantenimento della stabilità del microambiente del midollo spinale attraverso la fagocitosi, l'eliminazione dei detriti cellulari e la produzione di fattori neurotrofici. Dopo la lesione del midollo spinale (SCI), le MG vengono attivate e le cellule immunitarie periferiche si infiltrano nel midollo spinale danneggiato. Tra queste cellule immunitarie, la MG attivata e i macrofagi infiltranti periferici (Mø) svolgono un ruolo cruciale nel processo patologico della lesione midollare. Queste cellule possono essere distinte in fenotipi pro-infiammatori (M1-like) e antinfiammatori (M2-like); Tuttavia, distinguerli è difficile a causa della loro somiglianza nella morfologia e dei molti marcatori cellulari. La citometria a flusso (FCM), una tecnica ampiamente utilizzata in campo biomedico, può rilevare contemporaneamente più parametri cellulari come la dimensione delle cellule, la dimensione delle particelle, la superficie cellulare e i marcatori intracellulari in un singolo esperimento. Nel corso di anni di ricerca, la MCA è stata tentata di identificare MG e Mø nel midollo spinale ed è stata continuamente ottimizzata per sviluppare un metodo di rilevamento stabile. Questo metodo consente l'identificazione di MG M1/M2-like e M1/M2-like Mø dopo LM rilevando i profili di espressione di CD45, CD11b, CD68, CCR7 e altri marcatori. In questo protocollo, le cellule CD11b+CD45−/CD68+CCR7+ basso, CD11b+CD45−/CD68+CCR7-, CD11b+CD45 CD68+CCR7+ eCD11b+CD45CD68+CCR7- possono essere identificate rispettivamente come MG M1-like, MG M2-like, M1-like Mø e M2-like Mø.

Introduzione

La lesione del midollo spinale (SCI) è il risultato di un danno al midollo spinale causato da vari motivi. La lesione midollare ha un alto tasso di disabilità e attualmente non ci sono opzioni di trattamento efficaci, il che la rende uno dei problemi di salute pubblica più gravi al mondo 1,2. Il processo fisiopatologico della lesione midollare è complesso, diviso in due fasi. Inizialmente, il trauma meccanico della lesione provoca immediatamente una disfunzione cellulare acuta e la morte cellulare. Quindi, il danno secondario porta a un'ulteriore disfunzione cellulare e alla morte cellulare per giorni, settimane o addirittura mesi. Nell'ambito dei meccanismi di lesione secondaria, è stato dimostrato che l'infiammazione è un fattore determinante della gravità del danno secondario, determinando in ultima analisi la morte cellulare e la funzionalità cellulare3. Le caratteristiche delle risposte infiammatorie sono l'infiltrazione e l'attivazione delle cellule infiammatorie all'interno del midollo spinale danneggiato, che portano ad un aumento delle cellule infiammatorie e dei fattori infiammatori, creando un microambiente infiammatorio e causando infine disfunzione del midollo spinale4.

Le microglia nel sistema nervoso centrale (SNC) e i macrofagi infiltranti periferici svolgono un ruolo critico nella risposta infiammatoria a seguito di lesione del midollo spinale (SCI)5,6. Come macrofagi residenti del SNC, le microglia costituiscono il 5%-10% delle cellule del SNC e sono essenziali per il recupero della lesione midollare 7,8. La microglia può inghiottire e rimuovere i detriti cellulari dopo la lesione midollare, mediando la formazione di cicatrici cicatrizzanti 9,10. Tuttavia, un'eccessiva attivazione della microglia può portare a una risposta infiammatoria sostenuta e promuovere la formazione di cicatrici gliali, che impediscono la rigenerazione assonale11. Dopo la lesione midollare, le microglia attivate presentano principalmente due fenotipi: M1-like e M2-like12,13. Il fenotipo M1-like è pro-infiammatorio, promuovendo la sintesi di fattori infiammatori che contribuiscono all'apoptosi cellulare e al danno secondario. Le microglia M1-like hanno anche effetti neurotossici, esacerbando le lesioni e l'apoptosi neuronale14,15. Al contrario, il fenotipo M2-like ha proprietà antinfiammatorie e promuove l'angiogenesi, la rimielinizzazione, la crescita assonale e la riparazione dei tessuti16,17. Le microglia M2-like svolgono un ruolo cruciale nella modulazione dell'infiammazione e dei processi di riparazione.

I macrofagi periferici si infiltrano nel sito della lesione dopo una lesione midollare attraverso le barriere emato-spinali danneggiate e la vascolarizzazione17,18, regolando ulteriormente la risposta infiammatoria, la fagocitosi, la formazione di cicatrici e la rigenerazione del tessuto neurale 19,20. I macrofagi infiltranti periferici possono ridurre la risposta infiammatoria dopo una lesione midollare, fagocitare i detriti tissutali21, promuovere la rigenerazione neurale e il rimodellamento della matrice. Tuttavia, una risposta infiammatoria sostenuta mediata da macrofagi infiltranti periferici può portare a lesioni secondarie, che sono dannose per il recupero a lungo termine22,23. I macrofagi infiltranti periferici M1-like hanno forti capacità fagocitiche e di presentazione dell'antigene, in grado di eliminare le cellule necrotiche24. Tuttavia, la loro eccessiva secrezione di citochine pro-infiammatorie, specie reattive dell'ossigeno (ROS) e specie reattive dell'azoto (RNS) può danneggiare i neuroni e le cellule gliali, portando a un'apoptosi neuronale più grave25. Al contrario, i macrofagi infiltranti periferici M2-like possono inibire l'apoptosi neuronale e mitigare la risposta infiammatoria dopo SCI, promuovendo così la riparazione del tessuto neurale26.

Le microglia attivate e i macrofagi infiltranti perifericamente dopo lesione midollare mostrano somiglianze morfologiche e molecolari di espressione che li rendono difficili da differenziare. La citometria a flusso (FCM), una tecnica ampiamente adottata, viene impiegata per analizzare l'espressione della superficie cellulare e delle molecole intracellulari, identificare diverse sottopopolazioni cellulari e valutare contemporaneamente più parametri delle singole cellule. È stato condotto un test stabile di FCM per distinguere le microglia attivate dai macrofagi infiltranti perifericamente, facilitando lo studio del loro ruolo nella lesione midollare. Questo articolo descrive il metodo di rilevamento stabile che è stato sviluppato.

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Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato etico per la cura degli animali dell'Università di medicina di Bengbu (n. 2020-050). La cura degli animali è stata conforme alle normative fornite dal Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina. Un totale di 18 topi femmina C57/BL6 di otto settimane sono stati ottenuti e utilizzati commercialmente. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Sperimentazione e preparazione animale

  1. Ospita i topi in gabbie ventilate prima dell'intervento chirurgico. Mantenere un ciclo luce/buio di 12 ore e fornire libero accesso a cibo e acqua. Mantenere la temperatura ambientale ambiente a 20-22 °C e l'umidità al 30%-70% per una settimana di acclimatazione.
  2. Sterilizzare gli strumenti chirurgici per i topi in autoclave e asciugarli prima dell'uso. Sottoporre gli strumenti e la sala operatoria animale a sterilizzazione a raggi ultravioletti mezz'ora prima dell'intervento. Raggruppa ed etichetta i topi secondo il principio del raggruppamento casuale. Registrare e registrare i loro pesi per un uso successivo.
  3. Anestetizzare i topi con un cocktail di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Radere i peli sulla schiena dalle vertebre T8 a T10.

2. Preparazione del modello murino di SCI

  1. Disinfettare l'area chirurgica utilizzando un tampone di iodio dalla testa alla coda, centrato sul T9, seguito da disinfezione con un tampone alcolico al 75%. Praticare un'incisione di 1 cm nella pelle centrata in T9. Sezionare la fascia, il muscolo e i legamenti che circondano il T9 per 1 cm.
    1. Staccare il muscolo adiacente al processo spinoso T9 per esporre T9. Usa le forbici oftalmiche per scoprire e rimuovere la lamina tra T9 e T10, esponendo completamente il midollo spinale situato a T9, che ha un diametro di circa 2 mm.
      NOTA: Quando si solleva la lamina T9, assicurarsi che le forbici non tocchino il midollo spinale.
  2. Stabilizzare la colonna vertebrale bloccando i processi spinosi di T7 e T11. Create un modello di lesione spinale moderata utilizzando un'asta con un diametro di 1,3 mm e una forza di 0,5 N. Osservate la coda che si arriccia verso l'alto e l'arto posteriore che si contrae dopo la lesione midollare. Per i topi operati con sham, eseguire solo la laminectomia senza contusione.
  3. Raggiungere l'emostasi nel sito di incisione. Eseguire la chiusura a strati utilizzando suture chirurgiche sterili 5-0. Per l'approssimazione muscolare, afferrare la fascia profonda con una pinza Adson con i denti e suturare lo strato di pannicolo carnoso utilizzando un monofilamento assorbibile 5-0, inserendo l'ago perpendicolarmente a 2 mm dal bordo della ferita per ottenere morsi simmetrici a tutto spessore (2-3 mm di profondità) distanziati di 3 mm l'uno dall'altro.
    1. Fare nodi quadrati con tensione controllata per allineare anatomicamente i piani fasciali. Riposizionare i bordi della pelle utilizzando le micro forbici per iride per creare un'eversione epidermica di 1 mm. Allinea il derma con precisione con la pinza da orologiaio e fissalo con semplici suture interrotte 5-0 non assorbibili distanziate di 2 mm l'una dall'altra, garantendo una coaptazione uniforme senza spazi morti sottocutanei.
    2. Disinfettare la linea di sutura con tamponi di iodio utilizzando movimenti unidirezionali dal centro della ferita verso l'esterno. Tamponare delicatamente il sangue residuo con una garza inumidita con soluzione salina e applicare uno strato sottile di unguento antibiotico triplo lungo l'incisione.
  4. Dopo l'intervento, posizionare i topi in una gabbia mantenuta a temperatura e umidità adeguate. Fornire cure per la minzione due volte al giorno (mattina e sera) per assistere i topi fino a quando non riacquistano la minzione indipendente.
  5. Iniettare ogni topo per via sottocutanea 0,5 ml di soluzione fisiologica e antibiotici (gentamicina, 2000-2500 U/topo) al giorno per prevenire l'infezione.

3. Isolamento del tessuto del midollo spinale da topi C57/BL6

  1. Anestetizzare i topi prima dell'intervento chirurgico (passaggio 1.3). Una volta completamente anestetizzati, fissarli sul tavolo operatorio in posizione supina. I topi operati con Sham sono trattati in modo simile.
  2. Praticare un'incisione trasversale nella cavità toracica, sotto lo sterno e lungo il diaframma per esporre il cuore. Stabilizzare delicatamente il cuore con gli emostatici e inserire la cannula di perfusione nel ventricolo sinistro apicale, facendola avanzare nell'aorta.
    1. Tagliare immediatamente il padiglione auricolare destro e iniziare la perfusione a una velocità di 250 mL/h con 10 mL di soluzione di PBS. La perfusione è considerata di successo quando il liquido che drena dal padiglione auricolare destro passa da rosso sangue a chiaro e incolore, o quando il fegato passa dal rosso al bianco27.
  3. Sezionare la colonna vertebrale all'estremità della coda del topo per esporre il forame vertebrale. Utilizzando le forbici oftalmiche, sezionare con cura il tessuto del midollo spinale 0,5 cm sopra e sotto il sito della lesione. Posizionare il tessuto isolato del midollo spinale in un piatto di coltura sterile e privo di enzimi contenente il 5% di tampone di colorazione e conservarlo su ghiaccio a 4 °C per un successivo utilizzo nella centrifugazione in gradiente di densità di polivinilpirrolidone (PVP) rivestita di silice colloidale.
    NOTA: Quando si seziona il midollo spinale vicino al centro della lesione, assicurarsi dell'integrità del tessuto per evitare di strappare o danneggiare il midollo spinale nel sito della lesione. Il tampone di colorazione al 5% (SB) è costituito da 2,5 mL di siero fetale bovino (FBS) e 47,5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).

4. Centrifugazione in gradiente di densità mediante silice colloidale rivestita con polivinilpirrolidone

  1. Posizionare il tessuto del midollo spinale in un colino cellulare da 300 maglie e macinarlo utilizzando lo stantuffo di una siringa monouso da 5 mL/10 mL. Dopo la macinazione, filtrare la sospensione cellulare attraverso il colino da 300 mesh in una provetta da centrifuga da 15 mL per centrifugazione (5 min, 110 x g, temperatura ambiente).
    1. Dopo la centrifugazione, aggiungere 1 mL di soluzione per la digestione cellulare della tripsina al sedimento cellulare e incubarla in un incubatore per colture cellulari a 37 °C per 15 minuti. Fermare la digestione aggiungendo 1,5 ml di siero fetale bovino, quindi centrifugare nuovamente (110 x g, 5 min, temperatura ambiente). Risospendere il sedimento cellulare in 1 mL di tampone di colorazione (SB) al 5%.
  2. Aggiungere in sequenza 4 mL di soluzione di polivinilpirrolidone rivestita di silice colloidale al 70%, 4 mL di soluzione di polivinilpirrolidone rivestita di silice colloidale al 30% e 1 mL di soluzione di cella risospesa SB al 5% a una provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare la miscela (300 x g, 30 min, 20 °C).
    NOTA: Preparare il reagente di separazione del polivinilpirrolidone rivestito di silice colloidale come miscela 9:1 di polivinilpirrolidone rivestito di silice colloidale e PBS 10×. Diluire la soluzione di polivinilpirrolidone rivestita di silice colloidale al 70% con PBS all'1× e la soluzione di polivinilpirrolidone rivestita di silice colloidale al 30% con terreno di coltura cellulare DMEM o RPMI 1640.
  3. Dopo la centrifugazione, le cellule formeranno strati nella provetta da centrifuga (Figura 1). Eliminare i detriti cellulari e gli strati piastrinici al di sopra del segno di calibrazione di 8 mL. Aspirare con cautela la soluzione rimanente (fino al segno di calibrazione di 1,5 mL) ed eliminare il sedimento al di sotto del segno.
    1. Trasferire la soluzione rimanente in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL e aggiungere 1× PBS per portare il volume totale a 15 mL per la centrifugazione (400 x g, 5 min, 4 °C).
  4. Scartare il surnatante e risospendere il sedimento cellulare in SB al 5%. Trasferire la soluzione in una provetta per citometria a flusso (FCM) per il lavaggio e la centrifugazione (110 x g, 5 min, 4 °C). Risospendere il sedimento cellulare nella provetta FCM con 200 μl di SB al 5%.

5. Colorazione FCM

  1. Dividere equamente 200 μl della sospensione cellulare in due nuove provette per citometria a flusso. Etichettare una provetta come "Controllo isotipo" e l'altra come "Colorazione specifica".
  2. Procedura di colorazione
    1. Alla provetta "Controllo isotipico", aggiungere i seguenti anticorpi isotipo-corrispondenti: Kappa IgG2b di Rat marcata con PE, Kappa IgG2b di Rat marcata con FITC, Kappa IgG2b di Rat marcata con APC e Kappa IgG2b di Rat marcata con APC-eFluor 780.
    2. Alla provetta "Colorazione specifica", aggiungere il seguente pannello di anticorpi marcati con fluorescenza secondo i rapporti di diluizione raccomandati: Rat anti-mouse CD45 APC, Rat anti-mouse CD11b PE, Rat anti-mouse CD68 FITC e Rat anti-mouse CCR7 APC-eFluor 780.
    3. Incubare le provette a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, per 30 minuti.
  3. Lavare le cellule colorate due volte aggiungendo 1 mL di SB ogni volta. Centrifugare le celle (110 x g, 5 min, 4 °C). Infine, fissare le cellule con paraformaldeide (PFA) al 2% per l'analisi della citometria a flusso.

6. Rilevamento FCM

NOTA: Per i dettagli della procedura, fare riferimento ai precedenti rapporti27,28.

  1. Analizzare i campioni utilizzando il citometro a flusso con il software compatibile (vedere la tabella dei materiali).
    1. Innanzitutto, analizza il tubo di controllo dell'isotipo per stabilire il grafo primario (FSC sull'asse x e SSC sull'asse y). Regolare le tensioni di diffusione diretta (FSC) e di dispersione laterale (SSC) per posizionare la popolazione cellulare all'interno di un intervallo appropriato.
    2. Imposta due grafici aggiuntivi: uno con IgG-APC sull'asse x e IgG-PE sull'asse y. Un altro con IgG-FITC sull'asse x e IgG APC-Cy7 (nota: APC-eFluor 780 è stato rilevato in questo canale) sull'asse y.
    3. Regolare le tensioni dei canali di fluorescenza per IgG-APC, IgG-PE, IgG-FITC e IgG APC-Cy7 per posizionare la popolazione cellulare entro il 103 della regione doppio negativo.
  2. Una volta che le tensioni FSC e SSC, così come le tensioni del canale di fluorescenza, sono state regolate e ottimizzate utilizzando il tubo di controllo dell'isotipo, queste impostazioni dovrebbero rimanere invariate. Procedere con l'analisi delle provette sperimentali colorate con anticorpi.
    1. Stabilire un grafo primario con CD11b-PE sull'asse x e SSC sull'asse y. Imposta un altro grafico con CD68-FITC sull'asse x e CCR7 APC-Cy7 sull'asse y. Utilizzando la provetta di controllo dell'isotipo come riferimento, impostare i valori di base e delineare la "regione" per le cellule CD11b+ . Sul grafico primario, gate la regione cellulare CD11b+ e definitela come "porta P1 ".
    2. Quindi, selezionare il grafico con CD68-FITC sull'asse x e CCR7 APC-Cy7 sull'asse y. Fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Mostra popolazione, quindi selezionare P1. Questo mostrerà le popolazioni cellulari all'interno del gruppo CD11b+ che esprimono CD68+/CCR7+ o CD68+/CCR7-. Raccogli 50.000 eventi per campione.
    3. Dopo aver acquisito i dati, regolare la compensazione della fluorescenza secondo necessità. Analizza e determina la percentuale di cellule CD11b+ , CD68+ , CCR7+ (M1-like) e CD11b+ , CD68+ , cellule CCR7- (M2-like). La percentuale media di cellule marcate positivamente è espressa come percentuale della popolazione totale del campione.
  3. Utilizzando i parametri di tensione ben regolati dal tubo di controllo dell'isotipo, procedere con l'analisi dei tubi sperimentali.
    1. Innanzitutto, stabilisci un grafico con CD45-APC e CD11b-PE, seguito da due grafici con CD68-FITC e CCR7 APC-Cy7. Raccogli 50.000 eventi per campione e, dopo aver acquisito i dati, regola la compensazione della fluorescenza.
    2. Nei grafici a pseudocolori CD45/CD11b, analizzare le "regioni" per le cellule CD11b+, CD45-/basso e CD11b+ , CD45alto per ciascun campione. Quindi, analizza le cellule CD68+ CCR7+ e le cellule CD68+ CCR7- all'interno di queste due regioni.
    3. Integrare le analisi per determinare le percentuali delle seguenti popolazioni cellulari: CD11b+, CD45−/CD68+ basso, CCR7+ (microglia simile a M1), CD11b+, CD45−/CD68+ basso, CCR7- (microglia simile a M2), CD11b+, CD45, CD68+ alto, CCR7+ (macrofagi simili a M1), CD11b+, CD45, CD68+ alto, CCR7- (macrofagi simili a M2).
      NOTA: La percentuale media di celle contrassegnate positivamente è espressa come percentuale della popolazione campione totale.

7. Analisi dei dati FCM

  1. Avvia il software di analisi della citometria a flusso e trascina i file dell'esperimento di citometria a flusso nella sezione "Tutti i campioni" dell'interfaccia. Gli esperimenti di citometria a flusso verranno visualizzati sotto "Tutti i campioni" sull'interfaccia. Iniziare analizzando la provetta di controllo dell'isotipo per determinare la soglia tra i segnali di fluorescenza positivi e negativi.
    1. Fare doppio clic sul campione del tubo di controllo dell'isotipo per visualizzare una finestra grafica che mostra un diagramma a punti bidimensionale. Selezionare FSC-A per l'asse x e SSC-A per l'asse y. Fare clic sul pulsante Cancello rettangolare nella parte superiore dell'interfaccia e utilizzare il rettangolo per selezionare l'area dopo aver rimosso i detriti cellulari (Figura 2A).
    2. Fare doppio clic sull'area selezionata per generare una nuova finestra grafica. Scegliere FITC per l'asse x e Istogramma per l'asse y. Fare clic sul pulsante Region Gate nella parte superiore dell'interfaccia per impostare un gate nell'istogramma a parametro singolo per determinare la soglia tra i segnali di fluorescenza negativi e positivi. Il gate della regione definirà l'area positiva (Figura 2A).
      NOTA: L'area con valori FSC più piccoli rappresenta i detriti cellulari.
    3. Per ciascuno dei quattro anticorpi fluorescenti utilizzati nell'esperimento, determinare la soglia tra segnali negativi e positivi utilizzando il campione della provetta di controllo dell'isotipo. Sull'asse x, modificare in sequenza i fluorocromi in PE, APC e APC-Cy7, mantenendo l'asse y come istogramma.
    4. Utilizzare lo strumento region gate nell'istogramma a parametro singolo per impostare i gate e determinare la soglia tra segnali negativi e positivi per ciascuno dei quattro anticorpi fluorescenti (Figura 2A).
  2. Per analizzare le proporzioni delle cellule M1-like e M2-like:
    1. Fare doppio clic sul campione sperimentale della provetta per visualizzare un grafico a punti bidimensionale. Selezionare FSC-A per l'asse x e SSC-A per l'asse y. Fare clic sul pulsante Cancello rettangolare nella parte superiore dell'interfaccia e utilizzare il rettangolo per selezionare l'area dopo aver rimosso i detriti cellulari (Figura 2B).
    2. Fare doppio clic sull'area selezionata per generare una nuova finestra grafica. Scegliere CD11b-PE per l'asse x e SSC-A per l'asse y. Fare clic sul pulsante Rectangular Gate nella parte superiore dell'interfaccia e, utilizzando come riferimento la soglia PE positiva/negativa impostata dal controllo dell'isotipo, definire il gate CD11b+ (Figura 2B).
    3. Fare doppio clic sull'area del gate CD11b+ per generare una nuova finestra grafica. Selezionare CD68-FITC per l'asse x e CCR7 APC-Cy7 per l'asse y. Fare clic sul pulsante Cross Gate . Utilizzando come riferimenti le soglie positive/negative FITC e APC-Cy7 impostate dal controllo isotipico, utilizzare il cross gate per classificare le cellule, determinando le proporzioni delle cellule CD11b+, CD68+, CCR7+ (M1-like) e delle cellule CD11b+ , CD68+ , CCR7- (M2-like) (Figura 2B).
      NOTA: I principi di gating per l'analisi delle proporzioni dei macrofagi M1-like (M1-like Mø), dei macrofagi M2-like (M2-like Mø), delle microglia M1-like (M1-like MG) e delle microglia M2-like (M2-like MG) sono coerenti con quelli utilizzati per l'analisi delle cellule M1-like e M2-like. Le soglie per distinguere i segnali di fluorescenza positivi e negativi si basano sul tubo di controllo dell'isotipo, che funge da riferimento per l'impostazione dei gate. Il processo di funzionamento del software è illustrato nella Figura 2B e i profili di espressione dei marcatori utilizzati per determinare le proporzioni cellulari sono descritti in dettaglio nella sezione dei risultati rappresentativi.

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Risultati

Le cellule immunitarie del tessuto del midollo spinale vengono separate utilizzando silice colloidale rivestita con centrifugazione a gradiente di densità di polivinilpirrolidone. Durante il processo di centrifugazione, le cellule vengono distribuite in diversi strati in base alla loro densità di galleggiamento, ottenendo così la separazione cellulare (Figura 1). Dall'alto verso il basso, la distribuzione è la seguente: detriti cellulari, strato ricco di cellule mononucleate, strato ricco di...

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Discussione

La creazione di successo di un modello animale di lesione midollare è essenziale. Il modello SCI è stato stabilito esponendo il midollo spinale al segmento T9 a una forza di 0,5 N. Il successo del modello animale è stato dimostrato dalla coda del topo che si è arricciata, da entrambi gli arti posteriori che hanno avuto spasmi e dagli arti posteriori paralizzati, rendendo impossibile per il topo camminare dopo la lesione midollare (vedi passaggio 2.3). L'assistenza postoperatoria è fondam...

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Dichiarazioni

Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82072416); e il fondo per il team di innovazione scientifica e tecnologica di alto livello del Primo Ospedale Affiliato del Bengbu Medical College (BYYFY2022TD001).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1&volte; PBS  Distretto di SolarbioP1020
10&volte; PBS  Distretto di SolarbioP1022
18 topi femmina C57/BL6 di otto settimaneCavens Laboratory Animal Ltd, Chang Zhou, Cina
CCR7 anti-topo per ratto marcato con APC-eFluor 780 (IgG2b kappa)Invitrogen47-1971-820,25μ g/prova
APC-eFluor 780 marcato Rat IgG2b kappa  Controllo degli isotipiInvitrogen47-4321-820,25μ g/prova
Anti-topo di ratto marcato con APC CD45 (IgG2b kappa)Invitrogen17-0451-820,125μ g/prova
IgG2b di ratto marcato APC kappa  Controllo degli isotipiInvitrogen17-4031-820,125μ g/prova
DMEMGibco11965092
Siero fetale bovinoLonseraS711-001
Anti-topo di ratto marcato con FITC CD68 (IgG2b kappa)Invitrogen  MA5-166760,25μ g/prova
IgG2b di ratto marcato FITC kappa  Controllo degli isotipiInvitrogen11-4031-820,25μ g/prova
ParaformaldeideBiosharp23319084
Anti-topo di ratto marcato PE CD11b (IgG2b kappa)Invitrogen12-0112-810,25μ g/prova
IgG2b di ratto marcato PE kappa  Controllo degli isotipiInvitrogen12-4031-820,25μ g/prova
Percoll  Distretto di SolarbioP8370
Soluzione di tripsinaBiosharpBL526A

Riferimenti

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