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Articolo metodologico

Modello murino di lesione uterina chirurgica e successivi esiti della gravidanza

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DOI:

10.3791/67977

⸱

27 giugno 2025

 , 
1Department of Physiology and Membrane Biology, University of California, Davis, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of California, Davis

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive una procedura per indurre una lesione uterina in un modello murino, seguita da analisi a valle durante una gravidanza successiva.

Abstract

Le lesioni uterine da taglio cesareo (taglio cesareo) e altre procedure (dilatazione e raschiamento, miomectomie, ecc.) possono portare a diverse morbilità nelle gravidanze successive, tra cui la placenta previa, lo spettro della placenta accreta (PAS), la gravidanza con cicatrice cesarea e la rottura uterina. I tagli cesarei rappresentano circa il 30% dei parti negli Stati Uniti, con tassi destinati ad aumentare. Pertanto, è essenziale una comprensione più profonda dei meccanismi attraverso i quali insorgono i disturbi della gravidanza associati a lesioni e una piattaforma per testare possibili interventi. Per raggiungere questi obiettivi, c'è un bisogno critico di modelli animali di lesione uterina, in particolare quelli che affrontano l'impatto della lesione sui successivi esiti in utero. Questo protocollo descrive una nuova procedura chirurgica per un modello di lesione uterina indotta meccanicamente nel topo da laboratorio (Mus musculus). Vengono dimostrati i passi compiuti in preparazione all'intervento chirurgico, l'induzione della lesione uterina stessa e le procedure di recupero post-chirurgico. Vengono fornite ulteriori informazioni sulla dissezione a valle di topi non gravidi e gravidi. Nel complesso, descrivendo in dettaglio una serie di procedure per indurre lesioni uterine in un modello in vivo , questo protocollo presenta un metodo trattabile per chiarire gli eventi molecolari e cellulari della guarigione delle ferite uterine e i suoi effetti sulla gravidanza successiva.

Introduzione

Sebbene 1 parto su 3 negli Stati Uniti sia condotto tramite taglio cesareo (taglio cesareo), si sa poco su come l'utero guarisce e su come un utero danneggiato porti a complicazioni nelle gravidanze successive 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13. Queste complicanze includono la rottura uterina, la placenta previa, la PAS e la gravidanza con cicatrice cesarea, che insieme colpiscono ~2,5% delle pazienti che hanno avuto uno o più tagli cesarei 1,2,6,8,12,14,15,16,17. La placenta previa è caratterizzata dal posizionamento anomalo della placenta nella porzione inferiore dell'utero 4,16. Questo non solo causa l'ostruzione fisica della cervice e un elevato rischio di sanguinamento durante la gravidanza, ma è anche un fattore di rischio significativo per la condizione più grave e invasiva della PAS 8,12. La PAS è definita da un'eccessiva invasione della placenta troppo in profondità nei tessuti materni, anche fino alla vescica o al retto, e spesso richiede un'isterectomia con taglio cesareo per precludere un'emorragia materna pericolosa per la vita12,17. Le gravidanze con cicatrici cesaree, sebbene rare, comportano un alto tasso di morbilità correlate, tra cui aborto spontaneo, morte fetale e parto pretermine18,19. Oltre alle complicanze associate a una storia di precedenti tagli cesarei, anche altre procedure uterine come la miomectomia o la dilatazione e il raschiamento (D&C) portano a morbilità del paziente. Ad esempio, ~30% delle pazienti sottoposte a D&C dopo un aborto spontaneo tardivo e fino al 46% delle pazienti sottoposte a una seconda resezione isteroscopica per leiomioma sviluppano aderenze intrauterine caratteristiche della sindrome di Asherman (AS)20,21. L'AS colpisce ~2% delle femmine, causando amenorrea, dismenorrea, fallimento dell'impianto embrionale, aborti ripetitivi, travaglio pretermine e/o PAS21,22. Pertanto, date le sostanziali morbilità e mortalità associate a precedenti traumi uterini, un modello animale sperimentale è fondamentale non solo per chiarire i meccanismi attraverso i quali le ferite uterine guariscono e come le lesioni uterine influiscono sui successivi esiti della gravidanza, ma anche come piattaforma per lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici e terapeutici23,24.

Diversi studi hanno quindi sviluppato modelli murini di lesione uterina. Tuttavia, i primi studi non hanno esaminato le conseguenze del danno uterino sulle gravidanze successive25 o hanno limitato il danno alla superficie luminale uterina per studiare l'impianto dell'embrione al di fuori della finestra di ricettività endometriale nei topi ovariectomizzati26. Per colmare queste lacune di conoscenza, il modello descritto in questo protocollo, insieme ad altri studi recenti, presenta una nuova metodologia chirurgica per l'introduzione di lesioni uterine nei topi27,28. Questo protocollo utilizza il comune topo da laboratorio come organismo modello grazie alla sua ampia accessibilità, trattabilità genetica, breve gestazione, tempo rapido dalla nascita alla pubertà, grandi dimensioni della cucciolata e rapporto costo-efficacia. Inoltre, la caratteristica anatomica di due corna uterine nei topi consente un controllo interno con un corno illeso in ogni animale da esperimento, nonché la capacità di separare i difetti locali direttamente sulla cicatrice rispetto alla. difetti globali in tutto l'ambiente uterino. L'approccio descritto in questo Protocollo prevede una semplice laparotomia dorsale, seguita dall'uso di un ago sbavato per creare un'incisione attraverso gli strati endometriale e miometriale di un singolo corno uterino. Questa metodologia imita più da vicino le lesioni osservate durante i tagli cesarei e le miomectomie, sebbene possa essere facilmente modificata per indagare lesioni non incisionali come D&C, che precedono l'AS29,30. Dopo l'infortunio, gli animali vengono lasciati riprendersi e poi accoppiati con maschi per gravidanze programmate per esaminare le conseguenze dell'infortunio sui successivi esiti in utero27,28.

Sebbene la strategia generale sia simile ad altri studi recenti, ci sono aspetti di questo protocollo che offrono vantaggi distinti. Ad esempio, sia Li et al. che Burke et al. accedevano all'utero addominalmente anziché dorsalmente come descritto qui 31,32. Un approccio dorsale è sia più semplice da eseguire che più favorevole a un rapido recupero post-operatorio dell'animale. Per i topi non gravidi nello studio di Burke et al., sono stati utilizzati aghi piegati o curette per raschiare l'endometrio, imitando così più da vicino i D&C, rispetto alle lesioni incisionali a tutto spessore in questo protocollo che modellano più da vicino i tagli cesarei e le miomectomie32. Nei topi peripartum, Burke et al. hanno introdotto incisioni sulla superficie mesometrial in contrapposizione alla superficie anti-mesometrial dove si impiantano gli embrioni, come descritto qui. Utilizzando un ago sbavato rispetto alle forbici utilizzate da Li et al.31, questo approccio può essere modificato più facilmente da lesioni a tutto spessore a lesioni limitate all'endometrio per modellare sia D&C che tagli cesarei e miomectomie. Sia Li et al. che Burke et al. hanno chiuso le ferite uterine con punti di sutura, il che, sebbene più fedele agli eventi durante un taglio cesareo, introduce un'ulteriore variabilità nel processo di guarigione e il potenziale di effetti da corpo estraneo 31,32,33,34,35,36. Studi simili nei ratti hanno utilizzato le vie addominali per generare ferite uterine incisionalia tutto spessore 37,38 oescissionali 39 che vengono chiuse utilizzando suture 37,38,39 sia in animali non gravidi38,39 che in animali gravidi37. Pertanto, il protocollo qui presentato è particolarmente adatto per i ricercatori interessati a un approccio facile e riproducibile che richiede un'esperienza chirurgica minima, affronta gli eventi correlati all'impianto dell'embrione e alla placentazione a seguito di una lesione uterina a tutto spessore ed è facilmente adattabile a un'ampia varietà di domande, comprese le lesioni simili a D&C all'endometrio27,28.

La fase 1 di questo protocollo delinea le fasi preoperatorie. La fase 2 descrive la procedura chirurgica per indurre una lesione a un corno uterino. Infine, la fase 3 descrive in dettaglio la dissezione di una madre incinta per studiare gli effetti della chirurgia uterina su una gravidanza successiva. Nel complesso, questo studio presenta un modello chirurgico unico per roditori di guarigione delle ferite uterine e degli esiti della gravidanza associati, rapido da eseguire e facile da adottare.

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Protocollo

Tutte le procedure dimostrate in questo protocollo sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California, Davis (IACUC Protocol #23985). Le procedure descritte in questo protocollo sono tipicamente eseguite su femmine C3H di età compresa tra 7-10 settimane e 19-25 g di peso, sebbene questo protocollo sia adatto a topi femmine di tutti i ceppi, età e pesi, a seconda della domanda del ricercatore. Monitorare gli animali prima dell'intervento chirurgico per assicurarsi che per gli studi vengano utilizzati solo animali sani senza segni di lesioni o angoscia. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dell'area chirurgica

  1. Prima del giorno dell'intervento, posizionare tutti gli strumenti chirurgici (pinze sottili (#5 o #55), portaago, forbici per iride curve e applicatore di clip cutanee (caricate con clip)) nelle buste di sterilizzazione e nell'autoclave.
  2. Se si utilizza un anestetico iniettabile, preparare una diluizione operativa di 10 mg/mL di ketamina e 1 mg/mL di xilazina in soluzione salina di cloruro di sodio allo 0,9%.
    NOTA: In alternativa, l'isoflurano somministrato attraverso il cono nasale è una forma accettabile di anestesia40.
  3. Immediatamente prima dell'intervento, indossare dispositivi di protezione individuale (DPI): camice da laboratorio, cuffia chirurgica per capelli, maschera facciale chirurgica e guanti.
  4. Preparare l'area preoperatoria.
    NOTA: Questo può consistere in un tappetino assorbente foderato con tovaglioli di carta e una gabbia in cui l'animale può riposare dopo aver ricevuto l'anestesia prima dell'intervento chirurgico. Foderare la gabbia degli animali con tovaglioli di carta e posizionarla accanto al tappetino della panca pre-operatoria.
  5. Pesare l'animale destinato all'intervento chirurgico in un becher di plastica tarato o in un contenitore simile posto su una bilancia (Figura 1A). Registrare il peso per calcolare le quantità appropriate di anestetico, analgesico e soluzione fisiologica.
  6. Somministrare l'anestesia iniettabile all'animale attraverso i seguenti passaggi:
    1. Riempire una siringa da insulina con il volume appropriato della diluizione di lavoro di ketamina/xilazina (vedere passaggio 1.1) per ottenere una dose di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina (Figura 1B).
      NOTA: Ad esempio, un animale del peso di 22 g richiederebbe 0,22 mL di 10 mg/mL di ketamina e 1 mg/mL di soluzione anestetica xilazina.
    2. Iniettare la dose appropriata di ketamina/xilazina per via intraperitoneale (IP) dopo aver graffiato e capovolto saldamente l'animale in posizione supina41 (Figura 1C).
      NOTA: Se necessario, è possibile utilizzare una protezione antigraffio.
  7. Monitorare l'animale per circa 3 minuti. Iniettare altri 0,02 mL di soluzione di ketamina/xilazina I.P.41 se si osserva un movimento durante questa finestra di tempo.
  8. Verificare l'adeguata sedazione eseguendo un pizzicamento della punta anteriore ~10 minuti dopo l'erogazione dell'anestesia40,42.
    NOTA: Gli animali in genere raggiungono un piano chirurgico di anestesia entro 10-15 minuti. I topi C3H richiedono in genere ~20% in più di anestetico rispetto agli animali C57BL/6 o BALB/c (ad esempio, 0,24 ml di soluzione di ketamina/xilazina per un animale da 20 g). Potrebbe essere necessario determinare empiricamente il dosaggio in base a ogni singolo ceppo.
  9. Dopo l'interruzione del movimento, iniettare per via sottocutanea (S.C.)41 all'animale con 0,5 mg/kg di buprenorfina a rilascio prolungato (Figura 1D).
    NOTA: Dato il volume ridotto e la natura viscosa della buprenorfina a rilascio prolungato, si consiglia di iniettarla vicino alla scapola mentre si tende la pelle con l'altra mano.
  10. Per proteggere gli occhi dell'animale, applicare un unguento oftalmico utilizzando un batuffolo di cotone sterile (Figura 2A).
  11. Posizionare l'animale anestetizzato sul tampone assorbente preoperatorio foderato con carta assorbente.
  12. Radere accuratamente il sito dell'incisione nella parte inferiore e centrale della schiena utilizzando un tagliapellicce (Figura 2B). Rimuovere il pelo in eccesso con l'uso di carta assorbente, seguito da un rullo per pelucchi (Figura 2C).1.12
    NOTA: La crema depilatoria può essere applicata utilizzando un batuffolo di cotone sterile per la rimozione completa del pelo.
  13. Disinfettare il sito dell'incisione utilizzando tamponi imbevuti di alcol e tamponi di iodio povidone nel modo seguente:
    1. Partendo dal centro del sito di incisione previsto, strofinare verso l'esterno con il tampone per la preparazione dell'alcol con un movimento circolare (Figura 2D).
    2. Quindi, pulire il sito dell'incisione con un tampone di iodio povidone in modo simile (Figura 2E).
    3. Alternare tamponi per la preparazione di alcol fresco e tamponi di iodio povidone per un totale di 3 giri.
  14. Preparare l'area chirurgica come segue (vedi Figura 3A):
    1. Posizionare un secondo tampone assorbente sotto un illuminatore, seguito da un telo chirurgico sterile sopra il tampone assorbente.
    2. Sterilizzare guanti e illuminatore con etanolo al 70%.
    3. Posizionare gli strumenti chirurgici sterili ai bordi del telo chirurgico e posizionare l'animale al centro dell'area chirurgica.
  15. Creare un campo sterile posizionando un telo sterile (ad es. Glad Press 'n Seal) sull'animale, lasciando scoperto solo il muso (Figura 3B).
    NOTA: Durante l'uso, gli strumenti chirurgici puliti possono essere posizionati su superfici sterili come il telo sterile all'interno dell'area chirurgica.
  16. Tagliare un piccolo quadrato sulla regione rasata in preparazione per generare un'incisione in quel sito (Figura 3C, D). Vedere la NOTA per il passaggio 2.1 (sotto) per la posizione specifica del sito di incisione.

2. Induzione chirurgica della lesione uterina

NOTA: Questa sezione descrive l'intervento chirurgico e la procedura per introdurre una lesione in un singolo corno uterino di un topo femmina non gravido. In primo luogo, viene eseguita una laparotomia dorsale per esporre la parte superiore del corno uterino. Quindi, un ago sbavato da 25 G viene inserito nel lume uterino per danneggiare l'endometrio uterino e, se lo si desidera, per tagliare il miometrio. Questo crea una ferita longitudinale nel corno uterino danneggiato, consentendo ulteriori sperimentazioni per affrontare questioni come il modo in cui l'utero guarisce e in che modo la lesione influisce su una gravidanza successiva. È importante che l'animale sia adeguatamente sedato prima di eseguire l'intervento chirurgico. Come descritto nel passaggio 1, diversi parametri indicano che un animale è adeguatamente anestetizzato. Questi includono la cessazione del movimento, una riduzione della frequenza respiratoria e l'assenza di un riflesso degli arti anteriori. Inoltre, il riflesso degli arti posteriori dopo un tocco leggero dovrebbe essere assente, anche se questo riflesso a volte rimane presente nonostante un'adeguata anestesia se viene applicata una pressione sufficiente40,42.

  1. Praticare un'incisione di 2-3 mm nella pelle dorsale del topo utilizzando un paio di forbici (forbici dell'iride dritte o curve) tenendo la pelle con una pinza fine (#5 o #55).
    NOTA: Tagliare una distanza di ~1/3 tra la base della coda e il collo e ~0,5 cm dalla linea mediana. Vedere la Figura 4A.
  2. Praticare un'incisione di 2-3 mm nella fascia, sovrapponendo immediatamente il cuscinetto adiposo ovarico (Figura 4B).
  3. Afferrare delicatamente il cuscinetto adiposo ovarico con un paio di pinze ed estrarlo dalle incisioni nella fascia e nella pelle (Figura 4C).
    NOTA: Potrebbe essere necessario tagliare parti del cuscinetto adiposo in modo che l'ovaio e l'utero possano essere rimossi dalla cavità del corpo. Evita di ferire qualsiasi parte del tratto riproduttivo femminile stesso, così come la milza e i grandi vasi sanguigni vicino al cuscinetto adiposo.
  4. Dopo aver esposto il terzo superiore dell'utero, eseguire le seguenti operazioni (Figura 4D):
    1. Fissare delicatamente la legatura uterotubarica con una pinza (Figura 5A, B).
    2. Utilizzare l'estremità affilata di un ago sbavato per creare un piccolo foro nella parte superiore dell'utero (Figura 5A, B).
    3. Inserire l'ago con cautela e iniziare a raschiare la superficie anti-mesometrial del corno uterino (Figura 5C).
    4. Continuare a raschiare fino a quando non è stata raggiunta la perforazione completa di entrambi gli strati endometriale e miometriale (Figura 5D).
      NOTA: Una pressione eccessiva con il forcipe e/o l'inserimento dell'ago può strappare l'utero alla legatura uterotubarica, con conseguente separazione del corno uterino dall'ovidotto e dall'ovaio. Se è difficile creare un foro di ingresso nell'utero con l'ago sbavato senza danneggiare la legatura uterotubarica, in alternativa può essere utilizzato un ago non sbavato da 25 G o 27 G. L'ago sbavato può quindi essere inserito in questo foro per generare l'incisione come descritto sopra. Nell'approccio qui descritto, vengono introdotte incisioni a tutto spessore nel corno uterino. Tuttavia, se si desidera un danno uterino meno esteso, l'ago da 25 G può essere utilizzato per raschiare solo gli strati più interni dell'utero, come l'endometrio. Inoltre, questa procedura non utilizza suture per chiudere l'utero per evitare di introdurre risposte da corpo estraneo come variabile aggiuntiva; Tuttavia, la sutura uterina è un'alternativa accettabile per questa procedura.
  5. Riposizionare delicatamente il corno uterino ferito nella cavità corporea utilizzando una pinza (Figura 6A, B).
  6. Sutura43 la fascia si è chiusa con sutura di misura 4-0 e rimuovere il filo in eccesso (Figura 6C-E).
    NOTA: Una singola sutura è in genere sufficiente per chiudere l'incisione nella fascia.
  7. Chiudere l'incisione cutanea con le clip utilizzando l'applicatore di clip cutanee (Figura 6F).
    NOTA: Sono necessarie una o due clip per chiudere l'incisione.
  8. Iniettare per via sottocutanea41 10 mg/kg di carprofene come analgesia e 0,5 ml di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) per la terapia di supporto post-operatoria. Vedere la Figura 7A.
  9. Utilizzare un punzone per le orecchie o marchi auricolari in metallo numerati per identificare l'animale44.
  10. Posizionare l'animale in una gabbia riscaldata per il recupero post-operatorio (Figura 7B).
    NOTA: Una volta che l'animale è in grado di sollevare la testa, riportalo in una normale gabbia di stabulazione con lettiera. Vedere il passaggio 2.12 di seguito.
  11. Se si eseguono ulteriori interventi chirurgici con gli stessi strumenti chirurgici, eseguire i seguenti passaggi:
    1. Per prima cosa, pulisci con etanolo al 70% e carta assorbente.
    2. Quindi, risterilizzare gli strumenti mettendoli in uno sterilizzatore a perle di vetro asciutto per 30 s.
    3. Lasciare raffreddare gli strumenti a temperatura ambiente prima di un ulteriore utilizzo.
  12. Restituire gli animali da alloggiare nella struttura per animali dopo la ripresa del movimento, ~1-2 ore dopo il recupero dall'intervento chirurgico se sono stati utilizzati ketamina/xilazina o ~5 minuti dopo l'anestesia con isoflurano.
  13. Monitorare quotidianamente gli animali per segni di dolore e angoscia e somministrare iniezioni giornaliere di 10 mg/kg di carprofene secondo necessità per un massimo di 3 giorni dopo l'intervento.
    NOTA: La scala della smorfia45 e il punteggio della condizione corporea46 sono valutazioni veterinarie standard del benessere animale.

3. Accoppiamento e dissezione di topi gravidi per valutare le conseguenze della lesione uterina

NOTA: A seconda della specifica domanda di ricerca, possono essere eseguite varie analisi degli endpoint dopo la lesione uterina. Ad esempio, gli animali non gravidi possono essere sezionati in diversi momenti dopo l'infortunio per esaminare la cinetica della guarigione delle ferite27. Inoltre, gli animali feriti possono essere fecondati mediante accoppiamento naturale o trasferimento di embrioni per esaminare l'impatto della lesione sulle gravidanze successive27. Questa fase descrive la valutazione dello sviluppo embrionale e placentare in un ambiente uterino danneggiato. In particolare, questa fase fornisce dettagli sull'impostazione degli accoppiamenti e della dissezione programmati degli animali al giorno embrionale 12,5 di gestazione (E12,5, con la mattina del tappo vaginale definito come E0,5; ulteriori informazioni sull'identificazione dei tappi vaginali nel passaggio 3.2 di seguito). Nel complesso, la fase 3 fornisce un esempio di analisi a valle che possono essere condotte dopo l'infortunio per esaminare una serie specifica di domande sperimentali.

  1. Dopo il recupero post-operatorio, eseguire accoppiamenti a tempo47 co-alloggiando la femmina ferita con un maschio di stallone di età pari o superiore a 11 settimane.
    NOTA: La durata del recupero post-infortunio sarà determinata dalla specifica domanda di ricerca. Gli studi che utilizzano questo protocollo in genere consentono 30 giorni di recupero (con un intervallo di 5-105 giorni testato) prima di iniziare gli accoppiamenti a tempo. Gli accoppiamenti in trio o harem riducono il costo dell'alloggio e aumentano l'efficienza di questo approccio sperimentale. Tuttavia, si prega di notare che tali configurazioni di accoppiamento richiedono l'approvazione istituzionale e sono destinate esclusivamente alle dissezioni durante la gravidanza; I nati vivi da accoppiamenti in trio o in harem causano stress agli animali e non sono generalmente consigliati o consentiti.
  2. Eseguire i controlli del tappo vaginale ogni mattina fino a quando non viene identificato un tappo (vedere Figura 8), a quel punto la femmina può essere alloggiata separatamente dal maschio del perno.
    NOTA: I tappi appariranno come una massa bianca nel canale vaginale (Figura 8A) o un rigonfiamento dell'intera area vaginale. Se esternamente non è visibile alcun segno di un tappo, un cercatore di sonda può essere inserito lentamente nel canale vaginale (Figura 8C, D). Qualsiasi resistenza prima dell'inserimento completo della punta fino alla curva nel cercatore della sonda è un'indicazione di un tappo. I controlli delle spine devono essere eseguiti alle ~7 del mattino o il più presto possibile al mattino poiché le spine cadono nel corso della giornata. Per maggiori dettagli sul controllo dei tappi vaginali, vedere Behringer et al.48. Per una conferma aggiuntiva e più affidabile della gravidanza, è possibile utilizzare l'ecografia ad alta frequenza49,50. Se l'ecografia non è disponibile o non è desiderata, è stato dimostrato che l'aumento di peso predice la gravidanza con ragionevole precisione con E7.7551.
  3. Sacrificare l'animale (seguendo protocolli istituzionalmente approvati) all'età gestazionale desiderata. Vedere la NOTA di seguito per i dettagli su come eseguire l'eutanasia animale e su come selezionare un'età gestazionale per la dissezione.
    NOTA: La data della spina è indicata come E0.5. Scegliere un'età gestazionale al momento del sacrificio in base alla domanda sperimentale che si sta affrontando. Ad esempio, E4.5-E5.5 è appropriato per studiare la biologia perimplantare. E11.5-E14.5 è consigliabile per indagare i difetti placentari medio-gestazionali, inclusa la presenza di placente fuse. Seguire le linee guida istituzionali per l'eutanasia animale. Una procedura accettabile è un periodo di incubazione di CO2 di 8 minuti, seguito da un periodo di attesa e osservazione di 2 minuti e, infine, la conferma secondaria dell'eutanasia tramite lussazione cervicale.
  4. Dopo l'eutanasia, prepararsi alla dissezione come segue (vedi Figura 9A):
    1. Posizionare l'animale in posizione supina su una superficie di dissezione.
    2. Procurati gli strumenti di dissezione necessari (pinze, forbici), insieme a piastre di Petri riempite con 1× PBS.
    3. Per evitare che le ciocche di pelo sciolte aderiscano al sito di dissezione, bagnare prima il pelo addominale con etanolo al 70%, acqua o 1× PBS prima della dissezione.
  5. Praticare un'incisione nell'addome inferiore tenendo la pelle dell'addome con una pinza e tagliando una forma a V lungo la lunghezza dell'addome con le forbici fino a raggiungere il fondo della gabbia toracica (incisione di ~2 cm per ogni tratto della lettera "V"). Vedere la Figura 9B-D.
  6. Creare un'incisione a forma di V nella parete muscolare addominale sottostante (incisione di ~2 cm per ogni tratto della lettera "V") tenendola con una pinza e tagliandola a forma di V fino a quando la cavità addominale è visibile. Vedere la Figura 9E, F.
  7. Esporre l'utero spostando delicatamente l'intestino e altri contenuti addominali. Estrarre l'utero contenente gli embrioni dalla cavità addominale e metterlo in vista. Vedere la Figura 9G.
  8. Rimuovere l'utero insieme agli embrioni racchiusi dalla cavità addominale. Posizionare l'utero in una capsula di Petri preriempita con 1× PBS. Vedere la Figura 9H.
    NOTA: Utilizzare una pinza per afferrare prima il cuscinetto adiposo ovarico. Quindi, usa le forbici per separare l'utero dal resto della cavità corporea recidendo prima il grasso ovarico, seguito dalle arterie mesometriali, dalla vagina, dalle arterie mesometrial lungo l'altro corno uterino e, infine, dal secondo cuscinetto adiposo ovarico. Un'ulteriore dissezione può essere eseguita, se necessario, per l'analisi a valle desiderata, come la microscopia o l'istologia. Vedere la Figura 10 per i dati di esempio.

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Risultati

Dopo l'intervento chirurgico con l'uso di ketamina/xilazina come anestetico, gli animali sono in genere parzialmente mobili entro ~1 ora e completamente mobili entro ~4-6 ore. Il recupero dall'anestesia con isoflurano avviene in genere entro pochi minuti. Eventuali complicanze che possono insorgere, come la deiscenza o il dolore della ferita, sono in genere evidenti entro 1-3 giorni dall'intervento chirurgico. Eseguire controlli quotidiani del benessere per monitorare il dolore o le complicanze fino a quando l'incisione ...

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Discussione

I tagli cesarei rappresentano ~33% dei parti negli Stati Uniti e fino al 55%-65% dei parti in paesi come il Brasile e l'Egitto 12,52, eppure si sa poco su come l'utero guarisce dopo una lesione o su come queste lesioni influiscono sulle gravidanze successive. Mentre il precedente taglio cesareo è un importante fattore di rischio per i disturbi della gravidanza come lo spettro della placenta accreta (PAS) e la placenta previa, i m...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Ringraziamo l'UC Davis Teaching and Research Animal Care Services (TRACS) per il loro continuo supporto allevamento, procedurale e logistico. Ringraziamo l'UC Davis Cardiovascular Research Institute (CVRI) Animal Model Core e il direttore del core Dr. Yi-Je (Jay) Chen, D.V.M., Ph.D. per la guida tecnica e il supporto, nonché l'uso della suite chirurgica per le riprese. Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Zhang per il loro sostegno a questo lavoro. La Figura 5A è stata creata con BioRender.com (https://BioRender.com/ig9sfon).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NaCl 0,9% per preparazioni iniettabili, sterileFresenius Kabi63323-186-10
25 G x 5/8 pollici BD PrecisionGlide&commercio; AgoBD305122
70% etanoloFisher ScientificoBP82031GAL
Sutura vicryl 4-0 assorbibileEthiconJ214
Gabbie per animaliVWR10712-110 e 10715-323Le gabbie fornite dalla struttura per animali del ricercatore sono accettabili
Pugno all'orecchio animaleFisher Scientifico13-812-201
Sistema di chiusura avvolta AutoClipStrumenti per la scienza12020-00
Siringa da insulina U-100Fisher Scientifico14-826-79Marchio BD
Tamponi BetadineMedlineMDS093901
Buprenorfina a rilascio prolungato, 1,3 mg/ml (Ethiqa XR)Fidelis Prodotti farmaceutici099114Sono accettabili buprenorfina alternativa a rilascio prolungato o buprenorfina HCl
Carprofene (RIMADYL) 50 mg/ml ZoetisCERCHIO-00284R1
Forbici a iride curveStrumenti di precisione mondialiCodice: 501759G
Sterilizzatore per strumenti chirurgici a perle di vetro a seccoVWR INTERNAZIONALE75999-324
Ricarica di perle di vetro a seccoVWR INTERNAZIONALE75999-332
Topi femmine, in genere di età compresa tra 8 e 12 settimane, ad es. ceppo C3HFiume Carlo025
Forbici fini - curve 10,5 cmStrumenti per la scienza14370-23
Tagliabordi per pellicceFisher Scientifico50-195-4544
Glad Press ' n GuarnizioneFisher ScientificoNC1089054
Guanti in nitrileFisher Scientifico19-130-1597C
H2O, distillato sterileStrumenti per la scienza15230170
Illuminatore per interventi chirurgiciAmScopeHL150-AY
Ketamina, 100 mg/mL (Zetamina)Dechra501072
CamiceUlineS-15376W-50
Microscopio otticoFisher ScientificoEpisodio 13039
Rullo per pelucchiFisher Scientifico17-018-329
Nair Crema DepilatoriaBersaglio049-06-3304
Porta aghiStrumenti per la scienza12500-12
Asciugamani di cartaScott1804
PetriFisher Scientifico08-757-100
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientifico10010023
Bicchiere in plasticaThermo Fisher Scientifico12010250
Cercatore di sonda con estremità piegataFisher Scientifico08-995
Fisherbrand&commercio; Buste di sterilizzazione a chiusura istantanea 9 cm (L) x 13,3 cm (A)Fisher Scientifico181250
Fisherbrand&commercio; Buste di sterilizzazione a chiusura istantanea 9 cm (L) x 23 cm (A)Fisher Scientifico181251
Pincipe, Fine, #5Strumenti per la scienza11254-20
Pincipe, Fine, #55 Strumenti per la scienza11295-51
ScalaFisher ScientificoS93805
Forbici chirurgicheStrumenti per la scienza14060-09
Flacone sprayFisher ScientificoS413505P
Tamponi sterili per la preparazione dell'alcolFisher Scientifico22-363-750
Unguento veterinario oftalmico sterilePuralubePH-PURALUBE-VET
Tamponi sterili per l'applicazione di unguento oculareFisher Scientifico18-366-472
Buste per sterilizzazioneFisher Scientifico19-910-673
Telo chirurgicoFisher Scientifico50-209-1792
Cuffia per capelli chirurgicaUlineS-10480BLU
Mascherine chirurgicheFisher Scientifico18-048-010
Thomas Scientific Sottopanca assorbente, Cuscini da banco, 16,5 x 23 pollici / 42 x 58 cmFisher ScientificoNC1588452
Camera di riscaldamento/induzione con riscaldamento completo a pavimentoFisher Scientifico14-370-302
Ricariche per clip per feriteStrumenti per la scienza12022-09
100 mg/ml di xilazinaDechraRompun 100 mg/mL Xilazina

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