Un flusso di lavoro computazionale bilingue per identificare potenziali inibitori PLK1 nella lingua dei segni americana e in inglese

Summary

Questo protocollo bilingue fornisce un flusso di lavoro computazionale di scoperta di farmaci che valuta le interazioni proteina-ligando delle Kinasi Polo-Simili 1 a 3 (PLK1–3) e delle proprietà ADMET-S, Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, Toxicity, and Stability (ADMET-S).

Abstract

La Kinasi Simile al Polo 1 (PLK1) svolge ruoli essenziali nelle fasi S, G2 e M del ciclo cellulare, e la sua sovraespressione è frequentemente osservata in molteplici tumori, incluso il cancro al seno, dove contribuisce all'instabilità genomica e all'apoptosi disregolata. A differenza degli inibitori ATP-competitivi convenzionali che mirano al dominio chinasi, l'inibizione selettiva del dominio polo-box (PBD) di PLK1 offre una strategia promettente per interrompere le interazioni proteina-ligando, fondamentali per la progressione mitotica, innescando così l'apoptosi nelle cellule tumorali. Tuttavia, l'elevata somiglianza strutturale tra PLK1 e i suoi omologhi (PLK2 e PLK3), vitali rispettivamente per la funzione neurologica e la risposta allo stress, richiede un'eccezionale selettività per evitare effetti fuori bersaglio. Per affrontare questa sfida, il protocollo prevede un flusso di lavoro computazionale bilingue (American Sign Language e inglese) che integra screening virtuale, clustering strutturale, docking proteina-ligando, previsione dell'affinità di legame, profilazione ADMET-S e analisi della stabilità quantmeccanica (QM). A partire dal database di prodotti naturali SuperNatural 3.0, i composti sono stati filtrati utilizzando criteri di rilevanza per il tumore al seno e di somiglianza farmacologica, raggruppati per garantire la diversità chimica e valutati le loro interazioni con le strutture PLK1-, PLK2- e PLK3-PBD. Sebbene l'aggancio virtuale e le valutazioni ADMET-S in silico non possano confermare in modo definitivo la selettività o il meccanismo d'azione, questo studio genera ipotesi testabili e dà priorità a un insieme focalizzato di candidati derivati da prodotti naturali per future simulazioni di dinamica molecolare, validazione biochimica o screening sperimentale.

Introduction

Le chinasi simili a Polo (PLK) sono una famiglia di chinasi proteiche strutturalmente composta da un dominio N-terminale e un C-terminale costituito da uno o due domini polo-box (PBD^)1,2.  Il numero e la diversità funzionale di questi domini da polo variano tra i diversi membri della famiglia PLK. PLK1 è coinvolta nelle fasi S, G2 e M della divisione cellulare. Nel ciclo cellulare, PLK1 funziona come punto di controllo per il danno del DNA nella fase S e come regolatore della condensazione cromosomica e della maturazione del centrosoma nella fase G2. PLK1 favorisce inoltre l'ingresso mitotico nella fase M, seguito dall'assemblaggio del fuso, dall'ingresso nell'anafase e dalla^{citocinesi 3,4}. La sovraespressione di PLK1 porta a instabilità genetica dovuta a una formazione anomala di centrosomi, con conseguente malfunzionamento dei cicli cellulari che rendono le cellule incapaci di regolare l'apoptosi.  Questa sovraespressione si osserva nei tumori ai polmoni, alla testa e al collo, nell'esofago, gastrico, colorettale e al seno⁴. Pertanto, l'inibizione di PLK1 tramite agenti che mirano al PBD potrebbe scatenare l'apoptosi ^5,6. Questo flusso di lavoro mira a raggiungere un'elevata selettività per evitare di inibire PLK2 e PLK3, che sono fondamentali per la funzione neurologica e la gestione dello stress^{genotossico 3}.

PLK2 funziona come soppressore tumorale in determinati contesti, regolando la transizione G1/S e promuovendo la degradazione della ciclina E per prevenire una proliferazione cellulare incontrollata. PLK3 svolge un ruolo complesso sia nella regolazione del ciclo cellulare sia nella risposta allo stress genotossico, contribuendo al mantenimento dell'integrità genomica attraverso il suo coinvolgimento nell'attivazione dei checkpoint di danno al DNA e nell'induzione^{dell'apoptosi 7}. È importante sottolineare che, sebbene l'inibizione di PLK1 sia emersa come una strategia terapeutica promettente per il trattamento del cancro, i ruoli essenziali di PLK2 e PLK3 nel funzionamento neurologico e nella risposta allo stress rendono necessaria lo sviluppo di inibitori altamente selettivi per minimizzare gli effetti off-target su queste chinasi^{cruciali 3}. Questo contesto biologico e le somiglianze strutturali superiori al 38%³ sottolineano l'importanza di identificare composti che colpiscono specificamente il dominio polo-box (PBD) di PLK1 senza interferire con le funzioni protettive di PLK2 e PLK3 nella fisiologia cellulare normale.

Inibitori noti della kinasi simile alla polo (PLK), in particolare quelli che mirano a PLK1, sono stati ampiamente studiati grazie alle loro potenziali applicazioni terapeutiche nel trattamento del cancro. Diversi composti, tra cui BI 2536, volasertib (BI 6727), onvansertib (NMS-1286937) e GSK461364, sono stati sviluppati e portati a sperimentazioni cliniche, spesso come inibitori ATP-competitivi ^8,9,10. Altri tipi di inibitori mirano alla PBD, tra cui Timochinone (TQ)^11,12, Poloxin^13,14 e Allopolo-A¹⁵. Sebbene si riferisce promettente, attualmente non esistono inibitori specifici per PBD approvati né studi clinici in stadio avanzato a causa di sfide, tra cui proprietà ADMET-S subottimali ed effetti fuori^{bersaglio 6}. Ad esempio, diversi inibitori di PLK1-PBD sono alchilatori di^{proteine non specifici 16}, limitandone l'applicabilità clinica. Pertanto, migliorare la selettività e i profili ADMET-S dei potenziali inibitori PLK1-PBD rimane un obiettivo cruciale nella scoperta di farmaci.

L'obiettivo di questo studio è esplorare potenziali inibitori PLK1-PBD con proprietà ADMET-S utilizzando screening virtuale, filtraggio della similarità strutturale, docking, calcoli di energia di legame e valutazione ADMET-S. PLK2 e PLK3 sono stati sottoposti agli stessi protocolli per valutare la possibile selettività. Sebbene esistano numerose pipeline computazionali per la scoperta di inibitori delle chinasi, poche integrano lo screening di selettività concorrente tra i PBD PLK1–3 con analisi complete di stabilità ADMET-S e meccanica quantistica, in particolare utilizzando librerie di prodotti naturali. Il flusso di lavoro si basa su paradigmi di screening virtuale consolidati, ma è adattato per l'accessibilità educativa e la generazione di ipotesi nelle prime fasi iniziali. Il protocollo richiede solo un laptop standard (8 GB di RAM), software accademico gratuito e nessuna esperienza pregressa di programmazione, rendendolo adatto a contesti di scuola superiore, laurea triennale e magistrale, incluse esperienze di ricerca universitarie basate su corsi (CUREs).

La pipeline computazionale per questo lavoro inizia con la preparazione proteica, dove le strutture di PLK1-PBD, PLK2-PBD e PLK3-PBD vengono recuperate dal Protein Data Bank (PDB) o modellate e processate per risolvere discrepanze strutturali. Successivamente, è stato effettuato uno screening su un database di prodotti naturali, filtrando i composti in base al potenziale come anti-cancro al seno e la conformità alla Regola dei Cinque di Lipinski. I passi successivi sono la concentrazione in 50 strutture rappresentative basate sull'impronta molecolare e sulla somiglianza. Questi rappresentanti sono stati sottoposti a calcoli di aggancio e legame proteina-ligando, generando dati di interazione per i tre PLK. Successivamente, le proprietà di ADMET-S vengono valutate utilizzando tre diversi server web per prevedere farmacocinetica, somiglianza con i farmaci, tossicità e stabilità metabolica. I calcoli di QM sono stati utilizzati per valutare la stabilità molecolare tramite l'analisi Highest Occupied Molecular Orbital (HOMO) e Lowest Unoccupied Orbital (LUMO) del gap HOMO–LUMO. Infine, i dati ADMET-S sono stati analizzati per filtrare e classificare i composti in base a criteri fisicochimici, di assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione, tossicità e stabilità come potenziali e selettivi inibitori PLK1-PBD.

Protocol

Gli Identificatori delle Risorse di Ricerca (RRID) e i numeri di versione di tutti gli strumenti software utilizzati sono forniti nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione delle proteine target

1. Crea una directory funzionante per questo progetto dove possano essere memorizzati file strutturali e risultati computazionali.
2. Visita la Protein Data Bank per recuperare l'identificatore della proteina bersaglio PLK1-PBD (4HCO¹¹) e segui con il servizio di Chimica presso HARvard Molecular Mechanics - Interfaccia Grafica (^{CHARMM-GUI 17,18}) per risolvere eventuali discrepanze strutturali.
   1. Visita CHARMM-GUI e registra un account accademico. Dopo aver registrato un account accademico, clicca sul generatore di input, poi su PDB Reader, inserisci il PDB ID 4HCO e clicca sul passo successivo.
   2. Nella pagina successiva, assicurati che sia selezionata solo PROA – catena proteica A e clicca sul passo successivo per le due pagine successive.
   3. Scarica step1_pdbreader.pdb in una directory, rinomina il file in 4hco o prefered, e usa un editor di testo o un codice per rinominare le occorrenze di istidina (HSD) in (HIS).
3. Ripeti la procedura per il PLK2-PBD (identificatore PDB: 4XB0¹⁹) usando CHARMM-GUI.
   NOTA: Per strutture senza identificatori PDB, come il PLK3-PBD, si utilizzano strutture modellate a omologia o Alphafold²⁰. Garantire l'accuratezza della sequenza da^{Uniprot 21}.

2. Screening dei database dei prodotti naturali

1. Visita il database SuperNatural 3.0 Library dei prodotti naturali e seleziona la sottopagina²² delle malattie.
   1. Seleziona il cancro al seno con limiti di fiducia o nessuno, poiché l'intero risultato dovrà essere filtrato a programmazione, e clicca su Trova. Clicca su Download the complete result file per salvare i risultati in una cartella preferita come .csv. Successivamente, si usa il codice per filtrare coloro che hanno limiti di confidenza 0,900–1,000 (n = 1.193 su 73.406).
      NOTA: In alternativa, l'identificatore KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) per il cancro al seno può essere inserito nella sottopagina²³ delle vie di lavoro.
   2. Vai alla sottopagina delle FAQ , in fondo trova l'intero dataset disponibile per il download come file .csv. Scaricalo e usa uno script per abbinare le stringhe SMILES (Simplified Molecular Input Line Entry System) del dataset agli identificatori SuperNatural delle 1.193 molecole e prepara una lista delle loro stringhe SMILES (smiles.csv).

3. Campionamento a grappolo

1. Scarica una distribuzione Anaconda (https://www.anaconda.com/download) contenente quasi tutti i pacchetti open-source, oppure scarica individualmente un ambiente di sviluppo integrato (IDE) come RStudio (RStudio Desktop - Posit) o Jupyter (Jupyter Notebook). Installa^{RDKit 24}, un pacchetto open-source di chimica e machine learning che utilizza Conda.
   NOTA: Le istruzioni per installare Conda e creare un ambiente Conda sono disponibili alla documentazione conda 25.9.2.dev31. Per l'installazione di RDKit e la configurazione del modulo nell'ambiente, vedi Installazione — La documentazione RDKit 2025.03.6.
2. Metti lo script "Lipinski.py" nel Supplemental File 1 nella stessa cartella di "smiles.csv" ed eseguilo. Lo script apre l'ambiente Conda, carica moduli, legge il file delle stringhe SMILES, applica un filtro basato sulla Regola dei 5 di Lipinski per la stima della biodisponibilità e assorbimento (n = 999 su 1.193) e salva una lista di stringhe SMILES come "all.csv".
   NOTA: Confermare che "all.csv" è stato generato e contiene ~999 composti (sottoinsieme filtrato). Apri il file per verificare che ogni voce contenga una stringa SMILES valida. Python viene eseguito in RStudio dopo aver eseguito quanto segue nella console: library(reticulate); Reticulate::use_condaenv(nomedecondaenv)
3. Inserisci lo script "Clustering.py" (Supplemental File 1) nella stessa cartella di "all.csv" ed eseguilo nell'IDE preferito. Gli script caricano moduli di clustering, leggono il file di stringhe SMILES e raggruppano i composti in 50 cluster basati su fingerprinting molecolare e somiglianza con Tenomo.
   NOTA: 50 strutture rappresentative (rep_struct.csv, nel File Supplementare 1) sono salvate nella directory come elenco di stringhe MILES. La somiglianza di Tanimoto (nota anche come indice di Jaccard in chemioinformatica⁾²⁵ è una metrica utilizzata per quantificare la somiglianza strutturale tra due molecole basandosi sulle loro impronte digitali molecolari, con il coefficiente di Tanimoto che varia da 0 (nessuna somiglianza) a 1 (impronte identiche). Assicurati che "rep_struct.csv" abbia esattamente 50 voci SMILES uniche che rappresentino ogni cluster.

4. Docking proteica-ligando e calcolo dell'affinità di legame

1. Visita il server web Blind Docking guidato da rilevamento cavità basato su Vina AutoDock (CB-Dock2)²⁶.
   1. Vai nella scheda docking e carica la proteina 4HCO.
   2. Per caricare il ligando, clicca su disegna ligando e incolla un ligando dalla lista delle stringhe SMILES (rep_struct.csv, Supplemental File 1). Inserisci un indirizzo email nel campo successivo per una raccolta dati più semplice, poi clicca su Auto Blind Docking. Ripeti per i restanti 49 piccoli aggregati di molecole, etichettandoli come lig1, lig2, ..., lig50.
2. Vai al risultato inviato via email e scarica le cartelle zip in una sottodirectory intitolata 4HCO, titolandole in modo ordinario (4hco_lig1, 4hco_lig2, ..., 4hco_lig50).
   1. Scomprimi le cartelle e rimuovi tutti i file tranne quelli complessi proteina-ligando che terminano con ".complex.pdb".
      NOTA: Verifica che ogni directory di ligando (da 4hco_lig1 a 4hco_lig50) contenga il corrispondente file ".complex.pdb".
   2. Apri un file di esempio .complex.pdb con un editor di testo per annotare attentamente l'ID della catena proteica: P e l'ID del ligando A:UNL e ricomprimi le cartelle usando un'utilità di compressione file.
   3. Visita il server web PROtein binDing enerGY prediction (PRODIGY) per valutare la selettività e l'affinità di legame^{proteina-ligando 27}.
      1. Clicca sulla scheda PRODIGY-lig (proteina-piccola molecola) per caricare una cartella zippata con più complessi proteina-ligando contemporaneamente (come 4hco_lig1). Inserisci gli ID della catena proteica e dei ligandi, completa la verifica del captcha e procedi cliccando su Invia Prodigy-Ligand.
      2. Una volta elaborati i dati, clicca sul file d'archivio di tutti gli output (.zip) per scaricare i risultati. Ripeti il passaggio precedente e la raccolta dei risultati per tutte le sottodirectory fino a 4hco_lig50.
   4. Ripeti tutti i passaggi per le proteine 4XB0 e PLK3 con attenzione cautela alla nomenclatura dei file (come 4xb0_lig1 o plk2_lig1).
      NOTA: Confermare che i CSV in uscita per tutti i complessi proteina-ligando siano stati scaricati e contengano sia le colonne di dati ΔG che quelle di residui di interfaccia.

5. Valutazione ADMET-S

1. Visita la piattaforma²⁸ di ADMETlab3 3.0.
   1. Clicca su INIZIA sotto "ADMET Screening" e inserisci un elenco di SMILES.
      1. Apri rep_struct.csv in una directory per incollare l'intera lista delle stringhe SMILES nel campo di testo e invia.
      2. Valuta la farmacocinetica e le proprietà di somiglianza con i farmaci utilizzando il sistema di punteggio a colori della piattaforma e scarica i risultati della valutazione come file .csv per ulteriori analisi.
      3. Naviga allo strumento^{SwissADME 29}.
2. Incolla la lista delle stringhe SMILES per tutte e 50 le molecole nel campo di input.
   1. Clicca su Run per calcolare le proprietà di biodisponibilità e permeabilità, inclusa la penetrazione del BBB.
   2. Scarica l'output come file .csv per integrarlo con altri risultati ADMET.
3. Scarica e installa ToxTree³⁰ (Toxic Hazard Estimation by a decision tree approach) compatibile con il sistema operativo dell'utente.
   1. Apri il software tramite il terminale usando il comando: sh Toxtree.sh
   2. Inserisci le stringhe SMILES singolarmente in ToxTree per classificare la tossicità secondo le regole di Cramer.
   3. Esporta i risultati come file .csv per l'integrazione con altri dati ADMET.
      NOTA: Controlla che i CSV di output ADMETLab3 e SwissADME corrispondano al numero di ligandi (n = 50) e che i risultati Toxtree classifichino ogni composto secondo le regole di Cramer (I–III).
4. Dopo aver installato ORCA³¹, crea una cartella chiamata stabilità nella directory di lavoro e nelle sottocartelle per ogni molecola (ad esempio, plk1_lig1, plk1_lig2, ..., plk1_lig50).
   1. Usa Avogadro (Avogadro) per costruire ogni molecola dalla sua stringa SMILES: vai nella scheda Estensioni e clicca su Ottimizza Geometria per ottimizzare la molecola. Genera file di input ORCA tramite estensioni > ORCA > genera input ORCA e applica le seguenti impostazioni:
      ! B3LYP OPT freq def2-TZVP
      %maxcore 4000
      %pal
      NCrS 1
      fine
   2. Modifica il file di lavoro .sh scaricato per ogni ligando per includere nomi unici di lavoro e un indirizzo email. Successivamente, trasferire la directory "stabilità" in un sistema di calcolo ad alte prestazioni (HPC) utilizzando i seguenti comandi:
      ssh xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu
      MKDIR ~/4hco
      SCP -r /local/path/to/stability xsedeu0000@darwin.hpc.udel.edu:~/4hco
   3. Esegui i lavori tramite Simple Linux Utility for Resource Management (gestore di carichi di lavoro SLURM per cluster HPC) con uno script di ciclo:
      per i in {1..50}; do
      cd ~/4hco/stabilità/plk1_lig${i}
      chmod +x job_lig${i}.sh
      sbatch job_lig${i}.sh
      Fatto
   4. Dopo aver ricevuto le email di completamento del lavoro, naviga nelle cartelle dei ligandi e apri i file di output per rivedere i dati e annotare i valori HOMO e LUMO:
      CD ~/4hco/stabilità/plk1_lig1
      nano lig1.out

6. Analisi dei dati ADMET-S

1. Combina i dati sulle proprietà fisicochimiche derivati dalle carte radar di biodisponibilità e permeabilità di SwissADME in un file .csv.
   1. Salva il file .csv da SwissADME e chiamalo "Physiochemical.csv."
   2. Metti lo script "Physiochemical.py" (Supplemental File 1) nella stessa cartella di "Physiochemical.csv" ed eseguilo.
   3. Applica i seguenti criteri: nHD: 0–7, nHA: 0–12, nStereo: <2, LogP: 0–3, LogD: 1–3, LogS: –4 a 0,5, Fsp3: >0,41, e nHet: 1–15.
2. Ricava i dati di assorbimento e distribuzione da SwissADME.
   1. Fai una snapshot e salva il grafico^{BOILED-Egg 32} su SwissADME.
   2. Applicare i seguenti criteri: le molecole devono trovarsi nella regione dell'"uovo" e agire come inibitori della p-glicoproteina, poiché si preferiscono i punti rossi.
3. Derivare i dati metabolici da ADMETlab3.0 per il substrato e gli inibitori del citocromo (CYP).
   1. Salva .csv file da ADMETlab3.0 e chiamalo "Metabolism.csv".
   2. Modifica il file .csv e tieni solo le colonne di CYP-inh e CYP-sub.
   3. Metti lo script "Metabolism.R" (Supplemental File 1) nella stessa cartella di "Metabolism.csv" ed eseguilo.
   4. Applicare i seguenti criteri: si preferiscono inibitori CYP p450 e non substrati come categoria 0.
4. Derivare i dati di escrezione da ADMETlab3.0 per la clearance del plasma e l'emivita.
   1. Salva .csv file da ADMETlab3.0 e chiamalo "Excretion.csv".
   2. Modifica il file .csv e tieni solo le colonne di cl-plasma e t0.5.
   3. Metti lo script "Excretion.py" (Supplemental File 1) nella stessa cartella di "Excretion.csv" ed eseguilo.
   4. Applicare i seguenti criteri: clearance al plasma: 0,01–5 ml/min/kg.
   5. nDati di tossicità da Toxtree per la classe di tossicità e ADMETlab3.0 per il numero di tossicofori.
      1. Salva .csv da ADMETlab3.0 e chiamalo "Toxicity.csv."
      2. Modifica il file .csv, mantenendo solo la colonna Toxicophore, e aggiungi una nuova colonna che registri la classe di tossicità di ogni ligando da Toxtree.
      3. Metti lo script "Toxicity.py" (File Supplementare 1) nella stessa cartella di "Toxicity.csv" ed eseguilo.
      4. Applicare il seguente criterio: numero di tossicofori a 0–2.
   6. Ricava i dati di stabilità dai file di output ORCA. Le ("ENERGIE ORBITALI", in particolare i valori energetici HUMO e LUMO).
      1. Crea un grafico Excel che registri le energie HUMO e LUMO di ogni ligando come colonne separate.
      2. Aggiungi una nuova colonna che calcola il gap di banda (HUMO–LUMO = gap di banda).
      3. Salva la tabella Excel come "Stability.csv."
      4. Metti lo script "Stability.py" (Supplemental File 1) nella stessa cartella di "Stability.csv" ed eseguilo.
      5. Applicare i seguenti criteri: differenza di gap di banda compresa tra 3,6 e 5 eV.

Results

Il protocollo del file di struttura della proteina target garantisce che il file della proteina target sia ottimizzato per l'analisi e l'aggancio basato sulla struttura. Il file strutturale risultante, in formato PDB, è privo di residui mancanti, idrogeni, tipi di atomi mancanti e componenti non necessari come molecole d'acqua e liganti co-cristallizzati. Le Figure 1A,B mostrano differenze visive (visualizzate da Mol* Viewer³³) nelle strutture prima e dopo la preparazione. Se rimangono residui di formattazione (come nomi di atomi non riconosciuti o residui incompleti), CB-Dock2 di solito emette un errore al caricamento. A quel punto, possono essere applicate piccole correzioni manuali, come rinominare HSD in HIS o rimuovere residui non standard, prima di ritentare il passaggio di attracco.

La Figura 2 mostra i risultati del clustering tramite analisi dei componenti principali (PCA) basata sull'impronta molecolare e sulla somiglianza di Tanomo. Nella figura, ogni gruppo è raggruppato da un ovale sfumato di grigio contenente punti di colore simile, che rappresentano le molecole presenti in quei cluster.  I componenti PCA 1 e 2 sugli assi forniscono una rappresentazione lineare bidimensionale della riduzione da elementi ad alta dimensione nelle matrici di Tanomo. In questo studio, la somiglianza con Tanimoto viene utilizzata durante la fase di campionamento a grappolo per ridurre la ridondanza e aumentare la diversità chimica tra i 999 prodotti naturali conformi a Lipinski. Calcolando le somiglianze di Tanimoto a coppie usando impronte molecolari, il dataset viene suddiviso in 50 cluster di composti strutturalmente correlati. Viene quindi selezionata una singola molecola rappresentativa da ciascun cluster, assicurando che l'insieme finale di 50 liganti catturi un ampio spazio chimico, minimizzando al contempo la ridondanza computazionale nelle analisi di docking a valle e ADMET-S. Questa strategia migliora l'efficienza e la rappresentatività dello screening virtuale, in particolare quando si lavora con grandi librerie di prodotti naturali come SuperNatural 3.0. (vedi Figura 2).

Vengono simulate posizioni ottimali per ciascun complesso proteina-ligando, accompagnate da affinità previste sotto forma di punteggi di Vina tra le cinque posizioni CurPocket della proteina PLK1 in CB-Dock2, considerando le forze di van der Waals e i legami a idrogeno.  Un esempio di simulazione del ligando 1 nella Figura 3 mostra il miglior binding alla seconda posizione CurPocket (C2), con il punteggio Vina più basso di –7,5 kcal/mol, rispetto alle altre quattro posizioni superiori. L'aggancio molecolare con CB-Dock2 avviene tramite una funzione di punteggio basata su parametri empirici e un algoritmo di ottimizzazione globale stocastica. CB-Dock2 è stato rigorosamente validato e ha dimostrato prestazioni superiori rispetto ad altri strumenti di attracco cieco all'avanguardia, rendendolo una scelta eccellente per gli studi di attracco^26,34. Il server raggiunge un tasso di successo di circa l'85% per la previsione della posizione di binding (RMSD <2 Å), superando strumenti popolari, inclusa la prima versione CB-Dock, SwissDock, COACH-D e MTiAutoDock³⁴. Questa elevata accuratezza è attribuita all'integrazione innovativa di CB-Dock2 di due schemi di attracco complementari: approcci basati sulla struttura e basati su template.

La Figura 4 illustra una mappa termica delle affinità medie previste per ciascuna combinazione proteina-ligando utilizzando le affinità predette dal server web PRODIGY.  Affinità più elevate, indicate da energie molari più basse (kcal/mol) e tinte di heatmap più verdi, sono affinità di legame favorevoli. Al contrario, affinità più basse, indicate da energie molari più elevate e tinte di heatmap più rosse, sono meno favorevoli. Dal punto di vista della selettività, è ideale avere composti con affinità favorevoli per la proteina bersaglio (PLK1) rispetto agli omologhi (PLK2–3). Ad esempio, il ligando 27 è un ligando selettivo PLK1-PBD rispetto al ligando 45, che mostra affinità simili tra tutte e tre le proteine. Sebbene i risultati 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 e 49 mostrino maggiore affinità per PLK1-PBD rispetto a PLK2/3, sono chimicamente diversificati nello spazio delle impronte digitali 2D (media ECFP4 Tanimoto ≈ 0,135, nessuna coppia ≥ 0,50), suggerendo che una specificità più ampia sia probabilmente guidata dalla geometria conservata della tasca PBD e dai modelli condivisi di farmacoforo/interazione 3D piuttosto che dall'identità del ponte. Le raccomandazioni includono il confronto interazione-impronta digitale e la mappatura farmacoforica per identificare i determinanti strutturali del riconoscimento PLK1-PBD.

I risultati della valutazione delle proprietà fisicochimiche sono mostrati in un grafico radar (Figura 5). Le proprietà valutate includono interazioni atomiche, solubilità e biodisponibilità. Alcuni composti si distinguono per le loro proprietà fisicochimiche più desiderabili con intervalli accettabili: nHD = 0–7, nHA = 0–12, nStereo < 2, LogP = 0–3, LogD = 1–3, LogS = –4 a 0,5, Fsp3 > 0,41 e nHet = 1–15. Questa carta radar fornisce una visualizzazione completa e multidimensionale delle proprietà fisicochimiche dei 50 liganti rappresentativi identificati nel flusso di lavoro di screening computazionale. È progettato per valutare quanto bene ogni composto aderisce ai criteri predefiniti di "simile a un farmaco", tracciandone le proprietà rispetto ai limiti inferiori e superiori stabiliti. La tabella mostra dieci descrittori molecolari chiave disposti attorno all'asse polare, tra cui pKa acido e pKa base. L'area ombreggiata tra il poligono verde (Limite Inferiore) e il poligono blu (Limite Superiore) segnava l'intervallo ideale o accettabile per ciascuna proprietà, in base alle soglie fornite nel protocollo. I limiti superiori e inferiori dell'acido pKa (2–12 e della base pKa (3–10)) sono stati assegnati sulla base delle revisioni della^letteratura 35,36,37, poiché non esiste un unico limite superiore e inferiore per il pKa nella scoperta di farmaci. Ogni linea colorata rappresenta uno dei 50 ligandi. La forma formata collegando i punti dati di un singolo ligando mostra il suo profilo attraverso le dieci proprietà selezionate simultaneamente. La stragrande maggioranza dei 50 liganti si colloca all'interno o molto vicino alla regione accettabile definita dai poligoni verde e blu. Ciò indica che i primi passaggi di filtraggio, in particolare l'applicazione della Regola dei Cinque di Lipinski e il clustering basato sulla somiglianza con Tanivoto, sono stati altamente efficaci nell'arricchire il dataset con molecole che possiedono proprietà favorevoli simili a quelle dei farmaci. Si raccomanda la rappresentazione dell'intera gamma di valori documentati per tutti i parametri.

La Figura 6A–C mostra componenti dei dati ADME di ADMETlab3.0 e SwissADME. Partendo dall'assorbimento e dalla distribuzione, il modello BOILED-Egg³⁸ nella Figura 6A di SwissADME rappresenta l'assorbimento e la distribuzione dei farmaci tramite lipofilicità e permeabilità, come indicato dalle ellissi gialle e bianche nel grafico. Include substrati e inibitori della P-gp, rappresentati rispettivamente da punti blu e rossi, dove inibire la P-gp è cruciale per tassi di assorbimento più elevati. Nella Figura 6B, la mappa termica del metabolismo visualizza l'inibizione e il substrato di circa 7 varietà di enzimi CYP citocromo p450. L'esito desiderato per i ligandi è che fungano da CYP non inibitori e non substrati (green), con risultati desiderati che confermano un profilo di sicurezza sicuro del farmaco con nessuna o bassa interazione farmaco-farmaco. La Figura 6C rappresenta i dati di escrezione relativi alla clearance e all'emivita del farmaco. L'escrezione può essere distinta per la clearance ottimale del plasma (<5 mL/min/kg). L'emivita di tutti i farmaci anticancerosi dipende dal meccanismo d'azione, dalla tossicità e dal bersaglio del farmaco. L'emivita ideale bilancia il mantenimento delle concentrazioni di farmaci all'interno di una finestra terapeutica, minimizzando la tossicità e consentendo schedologie di dosaggio^{convenienti 39,40}.

Viene rappresentata la combinazione di due tipi di valutazioni di tossicità. Nella Figura 7A è mostrato il numero di tossicofori identificati da ADMETlab3.0 per ciascun ligando.  Non esiste una soglia o informazioni precise sugli intervalli accettabili dei tossicofori.  Nella Figura 7B, l'applicazione di Toxtree fornisce informazioni relative alla classe di tossicità (I-III) così come alle violazioni e all'adesione della Regola di Cramer. Il risultato campione per il ligando 1 mostra i risultati di tossicità e il suo codice SMILES nella barra superiore, con la struttura nella finestra in basso a sinistra. L'identificazione della tossicità di classe nella finestra in alto a destra indica un'alta tossicità (Classe III) basata sulle Regole di Cramer per il ligando 1, piuttosto che su altre possibilità come la Classe II (tossicità media) o la Classe I (bassa tossicità).  La finestra in basso a destra mostra il ragionamento scritto dell'identificazione delle classi basato sull'albero decisionale della Regola di Cramer.

I calcoli ORCA QM della frequenza vibrazionale per strutture ottimizzate calcolano i valori di energia orbitale per determinare il gap di banda. La Figura 8 mostra il gap di banda (eV) di ciascun ligando derivato dalla differenza tra HOMO e LUMO. L'intervallo di soglia è rappresentato nella regione ombreggiata tra 3,6 eV e 5,0 eV, dove ogni punto nella regione ombreggiata soddisfa i livelli energetici associati a una stabilità e reattività più desiderabili. Una panoramica dell'intero flusso di lavoro computazionale è riassunta nella Figura 9, che illustra le fasi sequenziali dalla preparazione delle proteine target e dallo screening del database di prodotti naturali fino alla valutazione ADMET-S, progettata per identificare inibitori selettivi del PLK1-PBD garantendo al contempo proprietà simili a quelle dei farmaci e stabilità chimica. Questa roadmap visiva sottolinea la modularità, l'accessibilità e l'idoneità del protocollo per l'implementazione educativa.

La Tabella 1 operativizza il protocollo trasformandolo da una sequenza lineare di istruzioni in una pipeline robusta e consapevole degli errori, adatta all'uso in aula e alla ricerca indipendente. Affronta esplicitamente la riproducibilità, una sfida nota nella scoperta computazionale di farmaci, inserendo criteri di validazione nei punti chiave di transizione. Ad esempio, confermare che i residui di istidina sono etichettati uniformemente come "HIS" dopo l'elaborazione CHARMM-GUI previene guasti silenziosi nel docking a valle, mentre la validazione dell'integrità SMILES prima del clustering evita errori a cascata nella previsione ADMET. La tabella evidenzia anche il design pedagogico, con ogni consiglio di risoluzione dei problemi applicabile con un minimo background computazionale (ad esempio, "apri .complex.pdb in un editor di testo per controllare gli ID della catena"), in linea con l'obiettivo del manoscritto di accessibilità per sordi, studenti universitari/magistrali e studenti delle scuole superiori. Inoltre, segnalando i passaggi in cui i risultati influenzano in modo sproporzionato i risultati, come la valutazione della selettività tramite il punteggio comparativo PRODIGY, la tabella aiuta gli utenti a dare priorità all'attenzione e alle risorse.

Un punto di forza chiave di questo flusso di lavoro integrato è la sua capacità di evidenziare discrepanze tra previsioni computazionali complementari, rivelando casi limite che sottolineano i limiti di un singolo metodo. Ad esempio, il ligando 5 per PLK1-PBD ha mostrato un forte punteggio di Vina CB-Dock2 (−7,9 kcal/mol) e un'affinità PRODIGY favorevole (ΔG = −9 kcal/mol, Figura 4) ma ha fallito diversi filtri ADMET. Non si conformava al modello di distribuzione di assorbimento delle uova bollite, mostrava un valore di clearance del plasma meno desiderabile (9,3 mL/min/kg, Figura 6), suggerendo una rapida eliminazione, ed è stato classificato come Cramer Classe III (alta tossicità) da Toxtree contenente cinque tossicofori (Figura 7A). Al contrario, il ligando 33 ha mostrato un'affinità PLK1 moderata prevista da PRODIGY (−5,4 kcal/mol) ma ha soddisfatto tutti i criteri ADMET, mostrando bassa tossicità (Classe I), LogP ottimale (0,7) e una distribuzione favorevole dell'assorbimento e clearance del plasma. Nonostante la sua affinità più debole, il ligando 33 è un candidato più simile a un farmaco. Questo contrasto illustra un principio fondamentale nella scoperta di farmaci nelle prime fasi iniziali: un'alta affinità di legame da sola è insufficiente senza farmacocinetica e sicurezza favorevoli. Allo stesso tempo, composti come il ligando 5, sebbene con scarse prestazioni ADMET, possono comunque fornire preziose idee per l'impalcatura future al fine di migliorare la sicurezza o la stabilità metabolica senza compromettere la potenza.

Sebbene i primi filtri in questo flusso di lavoro siano pensati per il triage e la prioritizzazione, non per l'esclusione permanente, una ulteriore semplificazione dei 50 candidati ne designa alcuni come "top hit" applicando limiti desiderabili disponibili dagli strumenti ADMET e dalla letteratura. Dei 50 liganti selezionati valutati tra 114 descrittori ADMET e elettronici, 13 soddisfacevano almeno 95 dei criteri di proprietà desiderabili. Tra questi, sei composti (10, 13, 14, 32, 43 e 47) hanno dimostrato sia profili ADMET-S favorevoli sia affinità di legame più elevate per PLK1-PBD rispetto a PLK2/3 e sono quindi designati come principali candidati inibitori (Figura 10). Le analisi comparative strutturale-funzionali e quantitative di similarità hanno rivelato che i successi identificati condividono caratteristiche farmacoforiche chiave con i noti inibitori PLK1-PBD, suggerendo una possibile convergenza nel comportamento di legame. Tutti i colpi contenevano impalcature aromatiche o eteroaromatiche che rispecchiano i sistemi idrofobici degli anelli TQ, Poloxin e Allopole-A, permettendo interazioni π–π e idrofobe all'interno della tasca PBD. La sovrapposizione funzionale era evidente attraverso motivi di legame di idrogeno conservati (carbossile, ammide e gruppi carbonilici) analoghi a quelli che mediano i principali contatti polari negli inibitori di riferimento. Linker alifatici e ciclici flessibili presenti in diversi colpi parallelano l'adattabilità conformazionale degli analoghi della Poloxina, facilitando l'orientamento verso residui di legame essenziali. Quantitativamente, i punteggi di somiglianza di Tanimoto (0,36–0,54) hanno confermato una somiglianza strutturale moderata tra i colpi e gli inibitori noti, con i colpi 10, 13 e 14 più simili a Poloxin, da 32 a TQ, e quelli 43 e 47 ad Allopolo-A. Collettivamente, questi risultati evidenziano una chiara sovrapposizione strutturale e funzionale, indicando che i successi probabilmente imitano la topologia di legame e i modelli di interazione degli inibitori PLK1-PBD validati, mantenendo al contempo una novità sufficiente per ulteriori ottimizzazioni (Figura 10).

Per valutare la robustezza del flusso di lavoro computazionale, sono stati analizzati come controlli positivi i noti inibitori PLK1-PBD (Poloxinpan¹⁴ e Allopole-A¹⁵), con Metformina e Imeglimina (due agenti antidiabetici strutturalmente non correlati senza attività segnalata di PLK1-PBD) come controlli negativi nelle analisi di affinità ADMET-S, docking e legame. I controlli positivi hanno mostrato affinità di legame rispettivamente di –5,8 e –5,6 kcal/mol, mentre i controlli negativi hanno mostrato affinità più deboli di –5,1 kcal/mol (Metformina) e –4,8 kcal/mol (Imeglimin), coerenti con la loro mancanza di attività di legame PBD. Curiosamente, la valutazione ADMET-S ha rivelato che i controlli negativi hanno soddisfatto descrittori più desiderabili (88 su 114 proprietà) rispetto ai controlli positivi (80 su 114), convalidando così la capacità del flusso di lavoro di distinguere la favorabilità farmacocinetica dal potenziale di legame specifico al bersaglio. Questi legame rafforzano l'importanza di mantenere una prospettiva equilibrata: i composti non dovrebbero essere scartati prematuramente solo sulla base di previsioni ADMET subottimali se mostrano una forte affinità bersaglio, poiché tali impalcature possono comunque offrire preziosi punti di partenza per l'ottimizzazione. Al contrario, molecole con eccellenti proprietà farmacocinetiche ma un legame debole possono fungere da modelli a basso rischio per lo sviluppo analogico. È necessaria ulteriore validazione biochimica e cellulare per confermare queste osservazioni computazionali e perfezionare i criteri di priorità.

Figura 1: Confronti strutturali tra una struttura 4HCO non preparata e una preparata da CHARMM-GUI. (A) Struttura 4HCO caricata direttamente dal PDB, evidenziando i residui mancanti. (B) Struttura 4HCO dopo il protocollo di preparazione CHARMM-GUI. 4HCO (PLK1-PBD legato a TQ) è stato selezionato perché è tra i pochi cristalli PLK1-PBD con un ligando organico legato, rendendolo direttamente applicabile a questa scoperta di inibitori a piccole molecole basati sulla struttura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi delle componenti principali (PCA) di 999 prodotti naturali conformi a Lipinski dopo il clustering K-means basato su impronte molecolari e somiglianza con Tanimoto. Ogni punto rappresenta un composto, colorato dal suo cluster assegnato (1–50), con gruppi raggruppati da ellissi grigie per enfatizzare la somiglianza chimica. Il raggruppamento stretto all'interno dei cluster e la separazione tra i cluster indicano che il clustering basato su Tamimoto ha ridotto con successo la ridondanza strutturale preservando la diversità chimica all'interno del dataset. Questa diversità garantisce che i 50 liganti rappresentativi selezionati per l'attracco a valle coprono un'ampia area dello spazio chimico, migliorando la robustezza e la generalizzazione dei risultati dello screening virtuale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Il docking cieco CB-Dock2 identifica una posa di legame ad alta affinità del ligando 1 all'interno del dominio polo-box (PBD) PLK1. La conformazione C2 di CurPocket visualizzata (punteggio Vina = −7,5 kcal/mol) rappresenta la posa ottimale tra cinque siti di legame previsti, caratterizzata da contatti di van der Waals favorevoli e legami a idrogeno con residui chiave di PBD (Trp414, His538 e Lys540). Questo risultato convalida l'uso del blind docking basato sulla struttura per localizzare tasche di legame biologicamente rilevanti in assenza di un ligando co-cristallizzato, dimostrando come il flusso di lavoro dia priorità alle pose con la più forte energia di legame prevista per l'analisi della selettività a valle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: La mappa termica del server web PRODIGY ha previsto affinità tramite combinazioni proteina-ligando. La heatmap affronta direttamente la sovrapposizione tra i liganti quando sono legati a PLK1, PLK2 e PLK3. Mentre alcuni liganti (incluso il ligando 45) mostrano affinità di legame comparabili tra tutte e tre le isoforme PLK, suggerendo una scarsa selettività, altri (in particolare i ligandi 3, 5, 6, 7, 27, 28, 34, 35 e 49) mostrano una forte preferenza per PLK1 (ΔΔG ≥ 3,0 kcal/mol rispetto a PLK2/PLK3), che si allinea con l'obiettivo dell'inibizione selettiva per PBD. Quantitativamente, 20 dei 50 ligandi mostrano una selettività quasi doppia per PLK1 sia su PLK2 che su PLK3, basandosi sui valori ΔG previsti da PRODIGY. Questo legame differenziale è attribuito a sottili variazioni nelle tasche di collegamento PBD, che il protocollo di docking cieco cattura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Rappresentazione delle proprietà fisicochimiche combinate da ADMETlab3.0 e SwissADME. I parametri sono: nHD = numero di donatori di idrogeno, nHA = numero di accettori di idrogeno, pKa base, pKa acido, nStereo = numero di Stereocentri, LogP = n-ottanolo/coefficiente di distribuzione dell'acqua, LogD = n-ottanolo/coefficiente di distribuzione dell'acqua a pH=7,4, LogS = valore di solubilità acquosa, Fsp3 = numero di carboni ibridizzati sp3/numero totale di carbonio, e nHet = numero di eteroatomi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Una combinazione di risultati ADME da ADMETlab3.0 e SwissADME. (A) Tabella dell'uovo BOLLITO di Wildman-Crippin LogP (WLOGP) vs. Area Topologica della Superficie Polare (TPSA) di SwissADME che rappresenta la permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB) di assorbimento e distribuzione nella regione gialla (tuorlina), l'assorbimento attraverso il tratto gastrointestinale (HIA) nell'ellisse bianca, i substrati P-glicoproteici e i non-substrati nei punti blu e rosso rispettivamente. Le molecole che si trovano al di fuori dell'"uovo" sono considerate con scarsa assorbimento e distribuzione. (B) Mappa termica del metabolismo con vari identificatori di Citocromo P450 (CYPs) che coinvolgono la stabilità del Metabolismo del Fegato Umano (HLM), dove il rosso funge da inibitori/substrati e il verde come non inibitori/non-substrati, lasciando il verde come desiderabile. (C) L'escrezione coinvolge i parametri, la liberazione del plasma e l'emivita. La linea rossa tratteggiata indica un clearance del plasma desiderabile (<5 mL/min/kg), mentre 5-15 mL/min/kg e >15 mL/min/kg indicano rispettivamente clearance moderato e alto.  Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Il profiling integrato della tossicità rivela responsabilità critiche per la sicurezza tra i liganti sottoposti allo screening. (A) Distribuzione dei conteggi di tossicofori tra i 50 prodotti naturali rappresentativi, come previsto da ADMETlab3.0. (B) Risultati di tossicità campione per il ligando 1, che indicano la tossicità di Classe III evidenziata in rosso, con una spiegazione dettagliata delle Regole di Cramer correlate elencate nella casella di testo qui sotto. Questo approccio a doppia valutazione (tossicofori + classe di Cramer) consente un triaggio precoce dei composti ad alto rischio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Energie del gap di banda HOMO–LUMO (in eV) per i 50 liganti rappresentativi derivati dal prodotto naturale, calcolati usando ORCA a livello teorico B3LYP/def2-TZVP. La regione ombreggiata (3,6-5,0 eV) indica la finestra di stabilità ottimale: i gap di banda inferiori a 3,6 eV suggeriscono un'elevata reattività chimica o potenziale fotodegradazione, mentre valori superiori a 5,0 eV possono indicare scarsa polarizzazione elettronica e riduzione dell'adattabilità del legame. I liganti rientrati in questo intervallo mostrano un equilibrio favorevole tra stabilità cinetica e risposta molecolare, supportando la loro priorità come potenziali candidati inibitori PLK1-PBD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Diagramma di flusso del flusso di lavoro bilingue di scoperta computazionale di farmaci. La pipeline inizia con la preparazione delle strutture PBD PLK1-PLK3, seguita da screening focalizzato sulle malattie del database SuperNatural 3.0 e filtraggio tramite la Regola di Cinque di Lipinski (peso molecolare ≤ 500 Da, donatori di legami idrogeno ≤ 5, accettatori ≤ 10, LogP ≤ 5). I composti rappresentativi vengono selezionati dopo il clustering e poi valutati tramite docking proteica-ligando, previsione dell'affinità di legame e profilazione ADMET-S completa, inclusi assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione, tossicità e valutazione della stabilità della MQ QM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Sovrapposizione strutturale-funzionale comparativa tra i liganti candidati principali e i noti inibitori PLK1-PBD. La figura evidenzia i sei principali composti candidati (10, 13, 14, 32, 43 e 47) identificati dalle analisi combinate di screening virtuale, clustering, affinità di legame e profilazione ADMET-S. Questi liganti soddisfacquero almeno 95 dei 114 descrittori fisicochimici e farmacocinetici desiderabili e mostravano affinità di legame più elevate per PLK1-PBD rispetto a PLK2/3. Per valutare la possibile convergenza strutturale e funzionale, ogni ligando è stato confrontato con gli inibitori noti di PLK1-PBD TQ, Poloxin e Allopolo-A, basandosi su motivi farmacoforici di base condivisi e coefficienti di similarità di Tanimoto a coppie (impronte ECFP4). Punteggi di similarità moderati (0,36–0,54) e gruppi funzionali comuni come anelli aromatici o eteroaromatici, coppie donatore/accettore di legami idrogeno e legatori idrofobici indicano una parziale sovrapposizione nelle caratteristiche di legame. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fase del flusso di lavoro	Checkpoint intermedio (come confermare il successo)	Passo critico (perché determina il successo/fallimento)	Problemi comuni e consigli per la risoluzione dei problemi
1. Preparazione delle proteine target	• File PDB si carica senza errori nella vista Mol*. • Nessun residuo mancante nella tasca di legame (ispezione visiva). • Residui di istidina etichettati come "HIS" (non HSD/HSE)	Struttura proteica inaccurata → false tasche di legame → pose di attracco fuorvianti. CHARMM-GUI garantisce una corretta protonazione, posizionamento dell'idrogeno e rimozione di acque/liganti.	Problema: CB-Dock2 rifiuta il file PDB. Correzione: rimuovere residui non standard, assicurarsi che sia presente solo la catena proteica e standardizzare i nomi di atomi/residui utilizzando un editor di testo.
2. Filtraggio dei prodotti naturali (regola del 5 di Lipinski)	• "all.csv" contiene solo SMILES validi (non blank, chimicamente analizzabili). • Contare le partite attese (ad esempio, 999/1.193).	SMILES invalido fa crashare RDKit, i docking server e gli strumenti ADMET. Il filtraggio deve preservare la validità chimica.	Problema: Lo script fallisce durante il clustering. Correzione: Aggiungi la validazione SMILES usando Chem.MolFromSmiles (smiles, sanitize=True) in Python; Registra e rimuovi le voci non valide prima di procedere.
3. Campionamento a grappolo	• 50 SORRISI unici in "rep_struct.txt". • Il grafico PCA (Fig. 2) mostra una netta separazione del cluster.	Un cluster scarso → rappresentanti ridondanti o poco diversificati → screening inefficiente.	Problema: Tutte le molecole si raggruppano in un unico gruppo. Correzione: Verifica il tipo di impronta digitale (ad esempio, Morgan/ECFP4), la soglia Tanimoto e la standardizzazione MILES. Considera di aumentare il numero di cluster se la diversità è bassa.
4. Aggancio Proteina-Ligando (CB-Dock2)	• Ogni ligando restituisce ≥1 file ".complex.pdb". • I punteggi di Vina sono negativi (ad esempio, ≤ −5 kcal/mol). • Il ligando è posizionato in CurPocket (non in superficie).	Il docking definisce la posizione di legame e l'affinità. Posa sbagliata → false previsioni PRODIGY.	Problema: Il lavoro fallisce, o il ligando non è collegato. Correzione: Ridisegnare il ligando in CB-Dock2 usando SMILES; assicurarsi che non ci siano caratteri speciali nel nome del file; Verifica l'email per lo stato del lavoro. Se persisti, prova SwissDock come backup.
5. Affinità di Lego (PRODIGIO)	• PRODIGY restituisce valori ΔG per tutti i complessi. • Le affinità sono correlate con i punteggi CB-Dock (Vina) (coerenza delle tendenze).	La valutazione della selettività dipende da una precisione ΔG per PLK1 rispetto a PLK2/PLK3. ID di catena/ligando assegnati male → previsioni errate.	Problema: errore "Catena non trovata". Correzione: Apri .complex.pdb in un editor di testo; confermare l'identificazione della catena proteica (ad esempio, "P") e il nome del residuo del ligando (ad esempio, "UNL"); inserisci correttamente in PRODIGY.
6. Valutazione ADMET-S	• Tutti i 50 SMILES restituiscono i risultati in SwissADME, ADMETlab3.0 e ToxTree. • Nessuna riga "N/A" o "Errore" nei CSV di output.	Dati ADMET incoerenti → una classifica dei candidati difettosa. Le piattaforme possono guastarsi su impalcature di prodotti naturali esotici.	Problema: ADMETlab3.0 rifiuta i SORRISI. Correzione: Canonica SMILES usando RDKit (MolToSmiles(MolFromSmiles(...))). Per ToxTree, inserisci una molecola alla volta e verifica la rendering della struttura.
7. Stabilità Quantistica (ORCA)	• Ogni lavoro ORCA si completa senza "SCF non convergente" o "errore di geometria". • Valori HOMO/LUMO presenti nel file di output (.out).	La banda interbanda determina la stabilità/reattività chimica. Lavori falliti = dati mancanti per il filtro delle chiavi.	Problema: crash del lavoro ORCA. Correzione: Riottimizzare la geometria in Avogadro; assicurarsi che non si siano duplicati atomi; aumentare il %maxcore o passare alla base def2-SVP per molecole di grandi dimensioni.
8. Filtraggio ADMET-S integrato	• Elenco finale dei liganti soddisfa tutti i criteri (ad esempio, LogP 0–3, gap di banda 3,6–5 eV, Classe di Cramer I/II). • ≥1 ligando mostra selettività PLK1 (ΔΔG ≥ 2 kcal/mol rispetto a PLK2/3).	Soglie eccessivamente rigide o incoerenti eliminano vantaggi validi; Soglie troppo permissive favoriscono composti tossici o instabili.	Problema: nessun ligando passa attraverso tutti i filtri. Correzione: Allenta un criterio alla volta (ad esempio, permette LogP ≤ 4 o 3 tossicofori) e documenta i compromi. Confronta con farmaci noti per il benchmarking.

Tabella 1: Punti critici di controllo qualità, punti decisionali ad alto impatto e strategie di risoluzione dei problemi attraverso il flusso di lavoro computazionale bilingue a otto stadi per l'identificazione degli inibitori selettivi PLK1-PBD. Ogni riga corrisponde a una fase principale del protocollo, dalla preparazione delle proteine al filtraggio ADMET-S integrato, e specifica (i) come verificare il completamento con successo (checkpoint intermedio), (ii) perché il passaggio è fondamentale per il successo o il fallimento complessivo (motivazione del passo critico), e (iii) soluzioni pratiche ai fallimenti tecnici comuni (guida per la risoluzione dei problemi). Questa tabella funge sia da roadmap di validazione sia da strumento didattico per studenti e ricercatori che implementano il protocollo in contesti accademici o con risorse limitate.

File supplementare 1: script Python. Contiene lo script Python per l'applicazione delle regole Lipinski; lo script Python usato per l'analisi di clustering; lo script Python per i calcoli delle proprietà fisicochimiche; lo script R per l'analisi del metabolismo; lo script Python per l'analisi delle escrezioni; lo script Python per la previsione della tossicità; lo script Python per la valutazione della stabilità; e le stringhe SMILES dei 50 composti analizzati. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Questo studio si concentra su un flusso di lavoro computazionale esplorativo per identificare e valutare potenziali inibitori PLK1-PBD tramite screening virtuale, docking e analisi ADMET-S. La pipeline dà efficacemente priorità ai composti in base alle tendenze di legame previste e alle proprietà farmacocinetiche. In questo protocollo viene identificato un insieme di possibili inibitori PLK1 e vengono valutate le loro proprietà ADMET e affinità di legame per le proteine PLK1–3. Il protocollo utilizza un approccio focalizzato sulla malattia per identificare 50 molecole da un database di circa 73.400 (Figura 9). Successivamente, queste 50 molecole sono state sottoposte a valutazione ADMET-S, durante la quale sono state calcolate le loro proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche, la somiglianza del farmaco e la stabilità. Inoltre, è stata calcolata la loro affinità di legame per le proteine PLK1–3 per valutare la loro potenza inibitoria contro PLK1 e la loro selettività. Sulla base dei risultati, diverse molecole hanno mostrato proprietà più desiderabili. Gli studi successivi di scoperta di farmaci potrebbero scegliere di eliminare alcune molecole e concentrarsi su alcune di questa esplorazione, oppure astenersi dall'eliminazione precoce e utilizzare questi risultati più avanti nel processo di progettazione del farmaco per ottimizzare le proprietà ADMET.

La motivazione biologica per concentrarsi su PLK1, PLK2 e PLK3, escludendo PLK4 e PLK5, si basa sia su considerazioni strutturali che funzionali. PLK4 e PLK5 sono esclusi da questo lavoro a causa delle differenze strutturali e funzionali distinte rispetto a PLK1 e della loro limitata rilevanza per la terapia oncologica. PLK1, caratterizzato dal suo dominio chinasi e dal dominio polo-box (PBD), svolge un ruolo fondamentale nella regolazione degli eventi mitotici, rendendolo un bersaglio chiave per il trattamento^{del cancro 41}. Al contrario, PLK4 e PLK5 sono strutturalmente divergenti: PLK4 contiene una criptica polo-box (CPB) invece di un PBD canonico e funziona principalmente nella duplicazione dei centrioli. Allo stesso tempo, PLK5 manca di un dominio funzionale della chinasi ed è espressa quasi esclusivamente nel^{cervello 3}. Data la loro minima sovrapposizione strutturale con PLK1-PBD e la limitata rilevanza per la disregolazione mitotica nel cancro, la loro inclusione non informerebbe in modo significativo la selettività per gli inibitori PLK1-PBD. Pertanto, la strategia di screening offre un quadro biologicamente rilevante e computazionalmente trattabile per valutare la selettività. È importante notare che i sei principali liganti candidati (10, 13, 14, 32, 43 e 47) hanno mostrato energie di legame e profili ADMET-S ancora più favorevoli rispetto agli inibitori noti TQ e Allopole-A, evidenziandoli come potenziali modulatori PLK1-PBD.

Per supportare un'implementazione robusta, in particolare da parte di studenti o ricercatori alle prime armi con gli strumenti computazionali di scoperta di farmaci, nella Tabella 1 è fornito un riassunto dei checkpoint chiave (sempre nella sezione Protocollo), i passaggi critici e le linee guida per la risoluzione dei problemi del flusso di lavoro. The Table supporta l'adattabilità; ad esempio, se un utente non ha accesso HPC, può notare che l'analisi di stabilità ORCA è differibile, e se un server web è fuori uso, vengono suggerite alternative come SwissDock. Questa flessibilità garantisce che il flusso di lavoro rimanga valido in contesti istituzionali diversi, mantenendo al contempo il rigore scientifico e rafforzando la novità dello studio come contributo inclusivo, bilingue e orientato all'educazione alla scoperta di farmaci in fase iniziale. Sebbene l'intero flusso di lavoro sia progettato come una pipeline integrata, diversi passaggi cruciali ne determinano fondamentalmente il successo o il fallimento (vedi Tabella 1). Inoltre, il video accompagnato presenta didascalie sincronizzate in inglese e un segno in Lingua dei Segni Americana (ASL), progettato per garantire un accesso equo senza distrazioni. Le istruzioni del firmatario sono allineate temporalmente con le azioni a schermo, ad esempio firmare "avanti", poi fermarsi mentre il cursore preme il pulsante "Avanti". Durante il passaggio di preparazione 4HCO, il firmatario utilizza l'etichettatura con le dita ("A" e "B") per guidare la selezione della catena, riflessa con precisione nella registrazione dello schermo. Nel segmento di screening SuperNatural 3.0, la finestra del segnatore si ridimensiona e si sposta in alto a destra mentre dirige l'attenzione sull'icona del "percorso", fermandosi mentre il cursore segue. Queste scelte progettuali garantiscono che gli spettatori sordi e con problemi di udito ricevano la stessa guida integrata e in tempo reale degli utenti udenti, replicando efficacemente un'esperienza di laboratorio in presenza guidata dall'istruttore.

Oltre ai benefici, ci sono numerosi modi per migliorare il flusso di lavoro. Innanzitutto, il filtraggio iniziale può essere modificato; Invece di metodi focalizzati sulle malattie e a cluster, si potrebbero iniziare con simulazioni di aggancio di tutte le molecole nel database dei prodotti naturali per identificare quali composti sono più adatti al legame proteico ligando-bersaglio. Inoltre, sono necessarie stime più dettagliate per una previsione accurata dell'affinità di legame.  I calcoli "no elettrostatici" di PRODIGY sull'affinità proteina-ligando prevedono l'adattamento dei conteggi dei tipi categorizzati di contatti atomici coinvolti nell'interazione (Carbonio-Carbonio, Azoto-Azoto, Ossigeno-Ossigeno e altri atomi) in un modello addestrato di regressione lineare multipla con validazione incrociata a 4 volte, e questo metodo si è correlato significativamente con affinità sperimentali in varie^{occasioni 42,43}.  Possono essere impiegati approcci alternativi, come FoldX⁴⁴, fastDRH⁴⁵, modelli di deep^{learning 46} e MD con campionamento avanzato, e si prevedono diversi gradi di concordanza nelle previsioni a seconda dell'accuratezza di ciascun^{metodo 47}.

Un altro aspetto è che i vari strumenti software utilizzati nella valutazione ADMET-S generano numerose metriche, e comprendere ogni metrica utilizzata per valutare la candidatura al farmaco è fondamentale. Un modo per garantire l'accuratezza potrebbe essere sottoporre diversi farmaci sul mercato al protocollo per determinare come soddisfano le soglie.  In tale contesto, la tossicità richiede ulteriori ricerche, poiché le molecole non vengono scartate solo sulla base dei profili di tossicità provenienti da alberi decisionali sfumati come le Regole di Cramer, poiché molti farmaci disponibili per l'uso portano classificazioni simili.  Il numero di tossicofori non è inoltre completamente informativo sulla tossicità, nemmeno in relazione ai profili di tossicità.  In questo contesto, un'estensione di questo flusso di lavoro sarebbe quella di effettuare revisioni comparative di campioni di piccole molecole con farmaci disponibili per orientare le interpretazioni.  Ad esempio, i ricercatori si sono riferiti alla letteratura precedente che documentava l'applicazione e le osservazioni dei calcoli DFT in farmaci attuali per il cancro al seno come^{Tamoxifen 48}, Letrozolo⁴⁹ e Cisplatino⁵⁰nell'interpretare la stabilità determinata dai calcoli QM dei valori di banda banda HOMO–LUMO. In precedenza, sono stati adottati flussi di lavoro simili per identificare potenziali inibitori per vari bersagli di malattia/^{disturbo 51}. Recentemente, Stafford et ^al.6 hanno esaminato strategie di progettazione degli inibitori PLK1-PBD e le opportunità terapeutiche nel cancro. Gli studi più recenti hanno identificato inibitori a doppio targeting contro PLK1-PBD e PLK4-PB3 utilizzando modellazione farmacoforica guidata dalla struttura, screening virtuale, docking molecolare, simulazione della dinamica molecolare (MD) e valutazione^{biologica 52}. Zhou et al. hanno inoltre identificato inibitori PLK1-PBD dalla libreria di prodotti naturali marini utilizzando il farmacoforo QSAR 3D, ADMET, scaffold hopping, docking molecolare e MD⁵³.

Nel complesso, la novità di questo studio è quadruplica. Innanzitutto, è un protocollo computazionale bilingue, erogato sia in Lingua dei Segni Americana che in inglese, promuovendo così l'accessibilità e l'inclusione nelle STEM, in particolare per studenti e ricercatori sordi e con problemi di udito. Questa erogazione bilingue è rara nella scoperta computazionale di farmaci e si allinea con la missione della Gallaudet University di promuovere un'educazione scientifica equa. In secondo luogo, sebbene PLK1 rimanga un bersaglio anticancro convincente, studi computazionali rigorosi che valutano la selettività tra PLK1, PLK2 e PLK3 utilizzando criteri strutturali, energetici e ADMET-S integrati sono scarsi. La maggior parte degli sforzi precedenti si concentra esclusivamente sull'inibizione del dominio chinasi o manca di profilazione di selettività comparativa. Questo lavoro colma questa lacuna fornendo un protocollo iniziale esplorativo di screening concorrente contro tre PLK-PBD, con filtri che danno priorità ai composti basandosi su un'alta affinità PLK1 e un legame minimo fuori bersaglio. In terzo luogo, il flusso di lavoro è stato progettato pensando all'efficienza e all'usabilità, in particolare per contesti educativi e con risorse limitate. L'intero pipeline, dal filtraggio del database alla valutazione ADMET-S, può essere completato entro due settimane su hardware accademico standard (un laptop con 8 GB di RAM), sfruttando software web gratuito (CB-Dock2, PRODIGY, SwissADME, ADMETlab). I calcoli di affinità di aggancio e legame non sono passaggi che richiedono molto tempo (~30 secondi per ligando). Il passaggio più dispendioso in termini di tempo è l'analisi della stabilità QM con ORCA, che può essere rimandata a fasi successive o eseguita su risorse di calcolo ad alte prestazioni, come dimostrato. Gli script sono modulari e richiedono solo modifiche di base a riga di comando o su Jupyter Notebook, permettendo un'integrazione fluida nei programmi esistenti. Il tempo di esecuzione è modesto con filtraggio del database e conformità Lipinski che richiedono minuti; Il clustering di ~1.000 molecole si completa in meno di 30 minuti su un desktop tipico. Tutti gli strumenti software sono liberamente disponibili per uso accademico, multipiattaforma (Windows, macOS, Linux) e non richiedono licenze commerciali, abbassando drasticamente le barriere all'ingresso. In quarto luogo, i liganti identificati mostrano affinità di legame promettenti compatibili con le interazioni nel range nanomolare, unite a una somiglianza favorevole al farmaco, stabilità metabolica e profili di tossicità bassi. Diversi candidati emergono come leganti PLK1-PBD forti e selettivi con proprietà ADMET-S desiderabili, richiedendo ulteriori validazioni tramite simulazioni di dinamica molecolare o saghi in vitro .

Pertanto, oltre alla sua utilità metodologica, questo studio esemplifica come strumenti computazionali accessibili, open source ed efficienti possano essere sfruttati come punto di partenza per affrontare una sfida biomedica di alto valore promuovendo al contempo una formazione scientifica inclusiva. Man mano che gli inibitori PLK1-PBD continuano a guadagnare terreno in oncologia, questo flusso di lavoro fornisce un modello riproducibile e educativo per la scoperta di farmaci nelle fasi iniziali. La sua versatilità la rende adatta a contesti di scuola superiore, laurea triennale e post-laurea, e fornisce un'eccellente base per i CURE che offrono agli studenti opportunità di ricerca autentiche e pratiche. A differenza delle pipeline che si basano esclusivamente sull'aggancio a dominio chinasi o sullo screening a singola proteina, l'approccio valuta contemporaneamente la selettività PBD tra PLK1–3, una necessità data la loro omologia strutturale del >38% e i ruoli biologici divergenti. Inoltre, combinando clustering, ADMET-S e stabilità QM in un framework open-access, il rischio di ridondanza e attrito sono stati ridotti rispetto allo screening virtuale a forza bruta.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADMETLab3	Simulations Plus. Inc	V3.0	Proprietà ADMET
Alphafold	Cerca DeepMind & Ricerca su Google Isomorphic Labs (filiali di Alphabet)	V3.0.1	Modellazione 3D delle proteine
Anaconda/Conda	Anaconda, Inc.	V24.9.2	Sistema di gestione pacchetti open source
CB-Dock2	Laboratorio Yang Cao	V2.0	Aggancio cieco proteina-ligando
CHARMM-GUI	Università di Lehigh	V3.8	Manipolazione e simulazione biomolecolare
DARWIN su ACCESS	Università del Delaware	N/A	Calcolo ad alte prestazioni
ORCA	FAccTs GmbH	V6.1.0	Pacchetto di chimica quantistica
Banca Dati Proteica	Banca Mondiale di Dati sulle Proteine	RRID:SCR_006555	Database proteico
RDKit	Open source	RRID:SCR_014274	Programmazione chemioinformatica
SuperNatural 3.0	Istituto di Fisiologia e Scienza-IT (Berlino)	V3.0	Libreria di molecole naturali
SwissADME	Istituto Svizzero di Bioinformatica	RRID:SCR_017865	Proprietà ADME
Toxtree	Ideaconsult Ltd	V3.1.0	Classificazione della tossicità