Articolo metodologico

Stima dell'RNA contenente ripetizioni telomeriche da complessi ibridi DNA/RNA

DOI:

10.3791/67984

⸱

5 dicembre 2025

 ,  ,  ,  , 
1Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, 2Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 3INSERM-CNRS, Université de Nice

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo consente l'isolamento degli ibridi DNA:RNA e del loro RNA associato (incluso TERRA) su più tessuti. Sebbene il nostro approccio coglia un sottoinsieme di interazioni ibride, sarebbe necessaria una mappatura genomica aggiuntiva per una caratterizzazione genomica completa a livello genomico.

Abstract

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L'RNA contenente ripetizioni telomeriche (TERRA) è un lungo RNA non codificante trascritto da tutti i telomeri negli eucarioti superiori, e solo un sottoinsieme di queste molecole forma ibridi stabili DNA/RNA ai telomeri. Abbiamo delineato un protocollo molecolare dettagliato per identificare e purificare queste stime ibride. Questo metodo semplificato consente l'estrazione diretta delle interazioni ibride DNA/RNA formate naturalmente in vivo e può essere applicato per rilevare tutte queste regioni. Minimizzando i passaggi procedurali, questa tecnica è altamente efficiente nell'isolare l'RNA attaccato al DNA, stimando l'affidabilità e la riproducibilità del sequenziamento a valle. Il reagente guanidina isotiocianato viene utilizzato per la lisi e l'omogeneizzazione totale delle cellule, preservando l'integrità degli acidi nucleici (DNA e RNA), in particolare degli ibridi DNA/RNA. L'aggiunta del cloroformio avvia la separazione delle fasi tramite centrifugazione (tre strati distinti): una fase inferiore di fenolo-cloroformio, un'interfase e una fase acquosa superiore. L'RNA, rilasciato sia dal nucleo che dal citoplasma, viene trattenuto nella fase acquosa, mentre il DNA ad alto peso molecolare, incluse le regioni ibride DNA/RNA, è confinato all'interfase. Con l'alcol isopropilico, seguito dalla centrifugazione, vengono recuperate la fase acquosa (RNA libero), l'interfase e il DNA, in particolare gli ibridi DNA/RNA. Per rimuovere le tracce residue di proteine, il campione viene incubato con la Proteinasi K. Si utilizza trattamento con DNasi, estrazione di fenolo/cloroformio, alcol isopropilico e centrifugazione per rilasciare RNA ibrido in DNA.

Introduzione

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La trascrizione del genoma porta alla formazione di molecole ibride temporanee, note come anelli R, che consistono in strutture a tre filati. Queste strutture includono i filamenti non codificanti e codificanti del DNA, con il filamento non codificante spostato dalla formazione di ibridi con l'RNAcomplementare 1. Durante la trascrizione del genoma, un gran numero di RNA non codificanti viene prodotto a velocità variabile da entrambi i filamenti di DNA. La maggior parte di questi RNA funge da intermediari di breve durata, ma alcuni svolgono ruoli critici nelle reti regolatorie che governano la biologia genomica, in particolare quelle provenienti da regioni non codificanti come telomeri ecentromeri 1. La distribuzione degli ibridi DNA/RNA nel genoma può anche riflettere l'attività trascrizionale delle cellule in un dato momento.

Con la crescita dell'interesse per le funzioni regolatorie degli RNA non codificanti, cresce la curiosità di monitorare la loro trascrizione e distribuzione nel genoma, in particolare sotto forma di ibridi temporanei DNA/RNA. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato un test indipendente per la rilevazione di ibridi stabili DNA/RNA, applicabile a qualsiasi cellula o tessuto biologico. Questo metodo consente l'isolamento degli RNA complementari che co-purificano con il DNA, seguito da un'analisi tramite precipitazione o sequenziamento per PCR.

Ricerche su modelli di coltura cellulare hanno stabilito che durante la replicazione e la trascrizione del DNA, lo stress replicativo, il danno al DNA, le collisioni tra forchette di replicazione e la pausa della polimerasi RNA II possono verificarsi a causa di eventi topologici, strutturali e di ibridazione. Questi processi, in particolare lo srotolamento della doppia elica del DNA, introducono stress torsionale, che può portare alla formazione di strutture anomale, come gli anelli R, durante latrascrizione 1.

La maggior parte dei dati sull'anello R è stata generata utilizzando cellule tumorali di lievito o coltivate, basandosi sull'anticorpo monoclonale specifico ibrido DNA-RNA S9.6. Studi strutturali hanno dimostrato che il frammento di legame antigenico (Fab) di S9.6 si lega specificamente aun duplex ibrido RNA-DNA a 13 bp. La rilevazione basata su anticorpi dei R-loop ha identificato principalmente ibridi che si formano in regioni ricche di guanina durante la trascrizione, dove è probabile che si verifichi un'ibridazione RNA-DNA potenziata. Gli studi in vitro con l'anticorpo S9.6 suggeriscono che gli RNA contenenti quattro o più guanine consecutive vicino alla loro estremità 5′ sono più facilmente rilevabili, correlando con un aumento della formazione del loopR 1. Vari enzimi, come elicasi, topoisomerasi, RNasi H1 e RNasi H2, aiutano a mantenere l'equilibrio dell'anello R durante la trascrizione. La disgregazione dell'omeostasi del R-loop è collegata a un aumento dell'instabilità genomica, contribuendo a malattie come il cancro e disturbineurodegenerativi 2.

I telomori, un tempo ritenuti trascrizionalmente silenziosi, sono stati trovati in grado di trascrivere lunghi RNA non codificanti noti come RNA contenente ripetizioni telomeriche (TERRA)3. Questi trascrizioni provengono da regioni subtelomeriche e contengono ripetizioni telomeriche, svolgendo ruoli essenziali nel mantenimento dell'omeostasidei telomeri 4. In questo manoscritto, ci riferiamo all'RNA TERRA-ibrido come le molecole di RNA rilasciate dai complessi ibridi DNA/RNA tramite trattamento DNasi I, presumibilmente incluse sequenze TERRA basate sulle proprietà di estrazione e sulla specificità del primer.

La trascrizione di TERRA avviene nella direzione centromero-telomerica ed è variabile in lunghezza, variando da 100 bp a 9 kb, con la maggior parte di TERRA recuperata in fase acquosa come molecola di RNA libero. Una piccola frazione rimane attaccata al DNA ed è associata a processi biologici chiave, come il cancro e l'invecchiamento 4,5. I livelli di TERRA variano a seconda dei loci subtelomerici e sono regolati dallo stato eterocromatico deitelomeri 6. Gli studi sulle colture cellulari indicano anche che i trascrizioni TERRA provenienti da varie regioni subtelomeriche mostrano eterogeneità in lunghezza. In alcuni studi di coltura cellulare derivata dai tumori, i ricercatori hanno scoperto che la regione subtelomerica 20q è la fonte primaria dei trascrizioni TERRA, e questa regione è spesso metilata nelle isole CpG 7,8,9. Nei topi, la regione subtelomerica del cromosoma 18 è un sito importante della produzione diTERRA 10,11. Inoltre, i PAR-TERRA, che sono trascrizioni TERRA originati da regioni pseudoautosomali subtelomeriche nelle cellule embrionali, hanno dimostrato di avere fino a 200 volte più TERRA rispetto ai cromosomi 18,11,12.

La trascrizione di TERRA è controllata dalla metilazione del DNA e da modifiche agli istoni come la trimetilazione di H3K9 e H4K20, che sopprimono TERRA, mentre l'acetilazione degli istoni è positivamente correlatacon la trascrizione 6,13,14 di TERRA. TERRA si lega anche alle regioni estratelomeriche, inclusi siti intergenici e introni, indicando un ruolo più ampio nella regolazione delgenoma 2.

Inoltre, l'esaurimento di TERRA porta a una disregolazione di numerosi geni, in particolare quelli vicini ai suoi siti di legame, suggerendo il suo ruolo nella regolazione epigenetica della cromatina e nell'espressionegenica 2. L'accumulo di TERRA nei telomeri accorciati favorisce l'estensione dei telomeri basati sulla ricombinazione omologa (HR), contribuendo all'omeostasi della lunghezzadei telomeri 15,16.

Per affrontare il ruolo di TERRA e di altri ibridi DNA/RNA, abbiamo utilizzato un saggio specificamente progettato per isolare molecole di RNA ibridate stabilmente al DNA. Per un breve periodo, i nuclei sono stati isolati e trattati con RNasi priva di DNasi per rimuovere l'RNA non protetto. Gli ibridi DNA/RNA sono stati poi estratti tramite digestione selettiva della DNasi, che rilascia RNA originariamente ibridato con DNA. Questa frazione, nota come "RNA associato ibrido DNA/RNA", è stata successivamente analizzata tramite RNA-seq e confrontata con l'RNA solubile totale ottenuto con l'estrazione standard difenolo-cloroformio 17. Questo approccio ci ha permesso di identificare sia i siti telomerici che quelli non telomerici della formazione ibrida RNA-DNA, e di confrontare i profili trascrittomici tra pool di RNA legati al DNA e quelli solubili. Un tempo considerato semplicemente un sottoprodotto della trascrizione dei telomeri, TERRA è ora riconosciuto per il suo duplice ruolo nella manutenzione dei telomeri, influenzando l'attività della telomerasi e la ricombinazione omologa, fondamentali per l'omeostasi della lunghezza dei telomeri. Inoltre, i progressi nei saghi di rilevamento hanno permesso una comprensione più dettagliata delle interazioni dinamiche tra RNA e DNA attraverso il genoma. Questa conoscenza apre la strada a un'ulteriore esplorazione delle implicazioni degli ibridi DNA/RNA, come TERRA, nei processi cellulari e dei loro potenziali legami con malattie come il cancro e i disturbi neurodegenerativi. La ricerca in corso in questo campo approfondirà senza dubbio la nostra comprensione della regolazione genomica e della sua rilevanza per la salute e la malattia.

Il metodo utilizzato per identificare le molecole di TERRA e gli ibridi DNA/RNA in questo studio è lo stesso protocollo ottimizzato di estrazione guanidinio-tiocianato-fenolo-cloroformio descritto qui. Questo protocollo è stato sviluppato per consentire l'isolamento simultaneo di ibridi RNA-DNA/RNA, RNA totale e DNA genomico all'interno di un flusso di lavoro unificato. Modificando strategicamente il classico metodo di separazione trifase, questo protocollo facilita la ritenzione selettiva degli ibridi DNA/RNA all'interfase fenolica, minimizzandone così la perdita – una limitazione intrinseca delle tecniche di estrazione convenzionali.

Tradizionalmente, la rilevazione e l'isolamento degli ibridi DNA/RNA si sono basati sull'immunoprecipitazione con l'anticorpo monoclonale S9.6, che riconosce specificamente le strutture ibride DNA/RNA 18,19. Questo approccio basato su S9.6, sebbene ampiamente utilizzato, può essere limitato dall'accessibilità degli anticorpi, dal costo e dalla potenziale reattività incrociata. Al contrario, il nostro protocollo offre un'alternativa economica e indipendente dagli anticorpi, facilmente applicabile sia a campioni cellulari che a quelli di origine tessuta.

Per migliorare ulteriormente la purezza e l'integrità strutturale della frazione ibrida isolata DNA/RNA, abbiamo incorporato la deproteinizzazione mediata da K tramite proteinasi, seguita dal trattamento con DNasi I. Il DNasi I digerisce selettivamente il filamento di DNA degli ibridi DNA/RNA, rilasciando così l'RNA ibrido per un successivo isolamento e analisi molecolarea valle 20. Questo approccio garantisce che le specie di RNA recuperate siano specificamente quelle che sono state ibridate stabilmente con DNA in vivo. Grazie alla sua configurazione modulare e scalabilità, il nostro protocollo è ampiamente adattabile a contesti biologici diversi, fornendo ai ricercatori uno strumento robusto per interrogare la biologia ibrida DNA/RNA in una vasta gamma di sistemi sperimentali.

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Protocollo

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Tutti i protocolli sperimentali che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal Comitato di Etica Animale dell'Università di Erciyes (numero di licenza 19-07-2019, decisione n. 19/127). In questo studio sono stati utilizzati topi Balb/c : cinque femmine sane, 6 settimane di età (25 g) e cinque maschi, 8 settimane di età (30 g). I topi venivano curati e trattati secondo i Principi di Cura degli Animali da Laboratorio (regole europee). Lo studio qui presentato ha utilizzato campioni di sangue di 13 soggetti sani di controllo, derivati da un precedente progetto di ricerca che ha ricevuto l'approvazione etica del Comitato di Etica Umana dell'Università di Erciyes (Decisione n. 17/002). Un abstract grafico di questo protocollo è fornito nella Figura 1. Utilizzare materiali senza RNasi e tecniche asettiche in tutte le fasi per minimizzare la degradazione dell'RNA.

1. Gestione dei topi

  1. Per determinare il dosaggio anestetico appropriato necessario per l'eutanasia, pesare ogni topo e somministrare ketamina a una dose di 60 mg/kg e xilazina a 10 mg/kg tramite iniezione intraperitoneale.
  2. Dopo la somministrazione dell'anestesia, confermare l'anestesia completa in assenza del riflesso di ritiro del pedale (pizzicamento del dito del piede) e dalla mancanza di risposta alla stimolazione tattile. Una volta confermata l'anestesia, eseguire l'eutanasia tramite lussazione cervicale.

2. Campioni umani

  1. Selezionare i partecipanti come controlli sani dopo averli selezionati per escludere qualsiasi storia di malattie croniche (come diabete, malattie cardiovascolari, ipertensione o cancro), infezioni acute, disturbi autoimmuni o infiammatori, condizioni neurologiche o psichiatriche, e uso recente di farmaciprescritti 17.
  2. Raccogliere campioni di biopsia cutanea dall'area dietro il ginocchio (fossa poplitea) di ogni volontario utilizzando uno strumento da perforazione da 2 mm. Somministrare anestesia locale sottocutanea prima della procedura e eseguire tutte le biopsie in condizioni sterili.

3. Estrazione ibrida DNA/RNA da tutti i tipi cellulari

  1. Raccolta e lisi dei tessuti
    1. Per ogni estrazione, utilizzare 500 μL di sangue cardiaco, complesso ipotalamo-ipofisario intero, ghiandola surrenale intera o un campione di sperma raccolto da un singolo topo.
    2. Trasferire tutti i campioni raccolti in tubi sterili da 1,5 mL. Aggiungi 500 μL di fenolo a ogni provetta. Campioni di sangue del vortice da miscelare accuratamente.
      1. Per i campioni di tessuto, omogeneizzare completamente usando una siringa da 2 mm finché non rimangono frammenti visibili.
    3. Posiziona i tubi su un blocco di raffreddamento per mantenere l'integrità del campione.
      NOTA: Segui sempre le linee guida di sicurezza di laboratorio quando manipolazioni di reagenti pericolosi come fenolo, cloroformio e acetato di ammonio.
  2. Separazione di fase
    1. Aggiungi 180 μL di cloroformio a ogni tubo e crea un vortice breve per mescolare. Incubare i tubi sul ghiaccio per 15 minuti per permettere la separazione delle fasi.
    2. Ispeziona i campioni - assicurati che la fase acquosa appaia limpida. Se la fase è torbida, si torna a formare un vortice e tornare al ghiaccio per altri 5 minuti.
    3. Centrifugare campioni a 12.000 × g, 4 °C per 15 minuti.
  3. Precipitazione dell'RNA
    1. Trasferire con attenzione la fase acquosa trasparente in un nuovo tubo sterile per microcentrifuga da 1,5 mL posizionato su un blocco di raffreddamento.
    2. Aggiungere un volume uguale (1:1) di isopropanolo alla fase acquosa, mescolare brevemente e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.
    3. Centrifuga a 12.000 × g, 4 °C per 15 minuti.
      NOTA: Il pellet di RNA dovrebbe essere visibile sul fondo del tubo.
  4. Lavaggio del pellet di RNA
    1. Inverti con attenzione il tubo per scartare il soprantantante senza disturbare il pellet.
    2. Aggiungi 1,5 mL di etanolo al 70% al pellet. Tocca delicatamente il tubo per 5 secondi per lavarlo.
    3. Centrifuga a 7.500 × g, 4 °C per 5 minuti.
    4. Inverti il tubo per scartare il surnadante. Ripeti il lavaggio con etanolo 2 volte (per un totale di tre lavaggi).
  5. Purificazione dell'RNA
    1. Dopo il lavaggio finale con etanolo, inverti il tubo e lascia asciugare all'aria eventuali residui di etanolo oppure rimuovi con attenzione con una pipetta.
    2. Aggiungi 100 μL di acqua senza RNasi al pellet di RNA e pipetta delicatamente su e giù o sbatti il tubo per risospendere completamente l'RNA.
      NOTA: Tieni sempre i campioni di RNA sul ghiaccio o su un rack/blocco di raffreddamento raffreddato per prevenire il degrado.
  6. Quantificazione e memorizzazione dell'RNA
    1. Metti il tubo contenente RNA sospeso sul ghiaccio.
    2. Misura la concentrazione e la purezza dell'RNA usando uno spettrofotometro. Registra l'assorbanza a 260 nm (A260) per determinare la concentrazione di RNA. Valutare la purezza calcolando i rapporti A260/A280 e A260/A230.
    3. Utilizzare solo campioni di RNA con rapporti A260/A280 tra 1,9 e 2,1 per applicazioni a valle.
      NOTA: In questo studio, le concentrazioni tipiche di RNA variavano da 100 a 180 ng/μL.
    4. Conservare i campioni di RNA a −80 °C fino a un ulteriore utilizzo.
  7. Rimozione delle proteine e isolamento del DNA
    1. Dopo l'isolamento dell'RNA, si mantiene l'interfase della fase di estrazione del fenolo.
      NOTA: Questo passaggio è necessario perché l'interfase contiene DNA, che può essere ulteriormente processato per l'isolamento del DNA dopo l'aggiunta e la centrifugazione del fenolo.
    2. Procedere con l'estrazione del DNA seguendo i passaggi 3.2.1-3.4.1, iniziando dall'interfase come materiale di partenza. Trasferire con cura l'interfase interfase (contenente DNA) dall'estrazione del fenolo a un tubo sterile da 1,5 mL per microcentrifuga tenuto su una griglia di raffreddamento.
    3. Digestione proteica: Aggiungere 0,5 mL di tampone per la lisi (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 100 mM EDTA; 0,1% SDS; 400 μg/mL Proteinasi K) al tube. Incubare durante la notte a 56 °C per digerire le proteine.
    4. Precipitazione salina del DNA
      1. Il giorno seguente, aggiungere 100 μL di 5 M acetato di ammonio a ciascun campione e mescolare brevemente. Centrifuga a 1.788 × g per 20 minuti a temperatura ambiente.
      2. Trasferire con cura la fase acquosa trasparente in un nuovo tubo sterile per microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere un volume uguale di isopropanolo di grado biologico molecolare (rapporto 1:1) alla fase acquosa, mescolare con inversione gentile e centrifugare a 1.788 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il sovrantato senza disturbare la pallina di DNA.
      3. Lavare la pellet di DNA con 1 mL di etanolo al 70%, poi centrifugare a 1.788 × g per 10 minuti.
      4. Rimuovi e butta via il lavaggio all'etanolo. Lascia asciugare brevemente la pellet di DNA.
      5. Risospendere il pellet di DNA essiccato in 50 μL di acqua senza nucleasi.
  8. Rimuovere l'acido nucleico libero per pulire il DNA:
    1. Carica il DNA disciolto su una colonna di spin del DNA. Centrifugare a 15.000 × g per 15 secondi e eliminare il flusso diretto.
    2. Lava la colonna 2 volte con etanolo al 70%, centrifugando ogni volta per 1 minuto a 15.000 × g. Scartare il flusso di flusso dopo ogni lavaggio.
    3. Trasferisci la colonna spinante in un tubo di raccolta pulito da 1,5 mL. Aggiungere 30 μL di acqua senza nucleasi alla matrice della colonna, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, poi centrifugare per 1 minuto a 15.000 × g per eluire il DNA.
    4. Metti il DNA eluzionato sul ghiaccio. Dividere il campione in due tubi: uno per l'immagazzinamento del DNA a 4 °C, il secondo per l'estrazione successiva di ibridi DNA/RNA.
  9. Estrazione di RNA attaccato al DNA (ibridi DNA/RNA)
    1. Trattamento con DNasi
      1. Prepara una miscela digestionale di DNasi combinando 5 μL (15 U) di DNasi I e 75 μL di 10x DNase digestione buffer.
      2. Aggiungi 80 μL della miscela di DNasi al pellet di DNA essiccato. Incubare il campione a temperatura ambiente per 15 minuti.
    2. Estrazione del fenolo-cloroformio
      1. Aggiungi 300 μL di fenolo al campione e incuba a temperatura ambiente per 5 minuti.
      2. Aggiungi 180 μL di cloroformio alla miscela e incuba per altri 5 minuti a temperatura ambiente.
      3. Centrifugare alla velocità massima (ad esempio, 15.000 × g) per 10 minuti a 4 °C per separare le fasi. Trasferire con attenzione la fase acquosa superiore (contenente ibridi RNA:DNA) in un nuovo sondetto.
  10. Isolamento ibrido DNA/RNA
    1. Completare l'isolamento degli ibridi DNA/RNA dai passaggi 3.3 a 3.5.2.
    2. Aggiungere un volume uguale (1:1) di isopropanolo alla fase acquosa, mescolare brevemente e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.
    3. Centrifuga a 12.000 × g, 4 °C per 15 minuti. Cerca il pellet di RNA sul fondo del tubo. Inverti con attenzione il tubo per scartare il soprantantante senza disturbare il pellet.
    4. Aggiungi 1,5 mL di etanolo al 70% al pellet. Tocca delicatamente il tubo per 5 secondi per lavarlo. Centrifugare a 7.500 × g, 4 °C per 5 minuti. Inverti il tubo per scartare il surnadante. Ripeti il lavaggio con etanolo 2 volte (per un totale di tre lavaggi).
  11. Purificazione dell'RNA:
    1. Dopo il lavaggio finale con etanolo, inverti il tubo e lascia asciugare all'aria eventuali residui di etanolo oppure rimuovi con attenzione con una pipetta.
    2. Aggiungi 30 μL di acqua senza RNasi al pellet ibrido DNA/RNA e pipetta delicatamente su e giù o muovi il tubo per risospendere completamente l'RNA.
    3. Conservare campioni ibridi DNA/RNA a −80 °C fino a un ulteriore utilizzo.

4. Sintesi del cDNA

NOTA: Garantire l'integrità di RNA, cDNA e DNA utilizzando materiali privi di RNasi/DNasi e mantenendo i campioni sul ghiaccio durante tutta la procedura.

  1. Per ogni campione, utilizzare 6 μL (20 ng di RNA; come isolato nello Passo 3.6.5 per l'RNA libero o nello Passo 3.13.3 per l'ibrido DNA/RNA). Trasferire il volume richiesto di RNA in tubi PCR marcati.
  2. Prepara il master mix di sintesi cDNA secondo le istruzioni del produttore del kit. Per ogni reazione, assicurarsi che il mix master contenga trasscrittasi inversa, dNTP, primer, tampone e inibitori RNasi. Per ogni reazione, si combinano 14 μL di master mix con 6 μL del campione di RNA in un tubo PCR (volume totale: 20 μL per reazione). Includere almeno un controllo senza trascritasi inversa (-RT) preparando una reazione parallela senza aggiungere l'enzima trascritasi inversa, utilizzando la stessa quantità di RNA.
  3. Eseguire la sintesi del cDNA in un thermal cycler utilizzando il programma di temperatura specificato nella Tabella 1.
  4. Diluire il cDNA risultante 1:5 con acqua priva di nucleasi e conservare a −80 °C fino all'analisi qPCR.

5. Determinazione dei livelli di espressione di TERRA tramite Q-PCR

  1. Prepara la miscela di reazione qPCR utilizzando un kit qPCR a base di SYBR Green, seguendo le istruzioni del produttore. Per ogni reazione, si combinano 1 μL di SYBR Green Master Mix, 0 μL di primer diretto per TERRA ( vedi Tabella 2), 0 μL di primer inverso per TERRA (vedi b) e μL di acqua priva di nucleasi.
  2. Dispensare 16 μL della miscela di reazione in ciascun pozzo di una piastra qPCR da 96 pozzi.
  3. Aggiungi 4 μL di cDNA diluito (dal Passaggio 4.6) in ciascun pozzo, per un volume finale di reazione di 20 μL.
    NOTA: Per ogni campione, includere almeno due repliche tecniche e due repliche biologiche. Includere controlli senza modello (NTC) per verificare la contaminazione e controlli senza trasscrittasi inversa per garantire la specificità dei segnali derivati dall'RNA.
  4. Esegui la qPCR utilizzando il programma di temperatura specificato nella Tabella 3.
  5. Normalizzare l'espressione di TERRA in β-Actin (gene di mantenimento domestico) utilizzando il metodo 2-ΔΔCt .

6. Determinazione della lunghezza dei telomeri

  1. Preparare la miscela qPCR per la misurazione della lunghezza dei telomeri 21. Per ogni reazione, si combinano 1 μL di SYBR Green Master Mix, 0 μL di primer frontale dei telomeri (vedi Tabella 2]), 0 μL di primer inverso dei telomeri (vedi Tabella 2) e μL di acqua priva di nucleasi.
  2. Erogare 16 μL della miscela della reazione dei telomeri in ciascun pozzetto di una piastra qPCR da 96 pozzi.
  3. Aggiungere 4 μL di DNA genomico (dal Passaggio 3.10.5) in ciascun pozzo, per un volume finale di reazione di 20 μL.
  4. Eseguire la qPCR secondo i parametri di programma appropriati specificati dal produttore (vedi Tabella 3).
  5. In parallelo, imposta reazioni per un gene di riferimento a copia singola (36B4) utilizzando le stesse concentrazioni e volume finale.
  6. Curve standard sono state generate utilizzando diluizioni seriali di un oligonucleotide telomerico sintetico (Tabella 2) per stimare l'abbondanza relativa e l'efficienza dell'amplificazione. Non è stata effettuata una quantificazione assoluta. La lunghezza relativa dei telomeri viene calcolata come rapporto T/S (numero di copie ripetute dei telomeri a numero gene a copia singola) utilizzando il metodoΔCt 21.

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Risultati

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In questo studio, abbiamo quantificato e confrontato i livelli di TERRA libero, ibrido DNA/RNA TERRA e lunghezza dei telomeri su più tessuti di topo (sangue, spermatozoi, pelle, ipotalamo, ipofisi, surrenali), così come in campioni di sangue e pelle umani, per indagare la dinamica specifica dei tessuti e la relazione con la biologia dei telomeri. Free TERRA è stato isolato dalla fase acquosa dopo l'estrazione del fenolo-cloroformio (passa...

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Discussione

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Un punto di forza centrale del protocollo qui presentato risiede nell'estrazione e nella discriminazione graduale di TERRA libero e ibrido DNA/RNA TERRA da campioni di tessuto complessi. I passaggi critici includono la separazione attenta delle frazioni acquose e interfasiche durante l'estrazione del fenolo-cloroformio, poiché la contaminazione incrociata può confondere la distinzione tra TERRA libera e ibrida. Il successivo trattamento con DNasi I della frazione interfase è anch'esso fo...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siamo grati all'Unità di Ricerca Scientifica dell'Università Erciyes per il supporto a questo lavoro con i numeri di finanziamento TYL-2019-9224 e TSA-2022-11929.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tubi PCR da 0,2 mL  Greiner671201
Tubi Falcon da 15 mLIsolab078.02.001
Siringa da 2 mLHayatN/A
96 - Piastra multipozzoGreiner50-720-3203
Etanolo AssolutoMerck1070172511
Acetato di AmonnioSigma238074-500G
Kit di Sinesi cDNARoche07 912 439 001
CloroformioMerck1024451000
DNAse I Kit ZymoE1010
EDTASigmaE9884-1KG
Bottiglia di vetroIsolabLB. IS.061.01.901
Cilindro graduatoIsolab  015.01.901
Guanidina isotiocianato  SigmaG9277-100G
IsoproponenteMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Tubi microcentrifughe (1,5 mL)Greiner616201
Micropipette (10 & micro; L)GilsonFD10001
Micropipette (100 & micro; L)GilsonFD10004
Micropipette (1000 & micro; L)GilsonFD10003
Micropipette (2 & micro; L)GilsonGFAM00064
NanodropShimadzuC101-E112
PBS TabletSigmaP4417-50TAB
Dispositivo PCRSensoquestT3-0140
PGL3 Vettore di basePromega #212936
Punte di pipetta (10 & micro; L, 200 & micro; L, 1000 & micro; L)Greiner772352
Piastre di Petri in plasticaGreiner627102
Proteinasi KSigmaP6556-10MG
SDSSigma8170342500
Pipetta sierologicaGreiner760107
GiroGilsonPMC880
Sybr Green MasterRoche4707516001
TermomiscelatoreEppendorf#5355
Base TrizmaSigma1503-1KG         
TrizolBiorad7326890
Unimax 1010 DT ShakerHeidolph543-12310-00-6
VorticeHeidolph541-10000-00-1
Colonne Zymo-Spin IZymoC1003-50

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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