Il plasma ricco di piastrine (PRP) è utilizzato nel trattamento dei disturbi muscoloscheletrici equini. Diverse tecniche producono PRP con concentrazioni variabili di piastrine e leucociti. Questo articolo descrive un metodo per ottenere il PRP dal sangue di cavallo.
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Articolo metodologico
Un semplice metodo di doppia provetta per centrifugazione per ottenere plasma ricco di piastrine dal sangue equino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il plasma ricco di piastrine (PRP) è ampiamente utilizzato come trattamento di routine per le condizioni muscoloscheletriche croniche nei cavalli, come l'osteoartrite, le tendinopatie e le desmopatie. Questa efficacia deriva dall'alta concentrazione di fattori di crescita e citochine antinfiammatorie che vengono rilasciati dopo l'attivazione di questo agente ortobiologico, sia attivati endogenamente che esogenamente. Nonostante la sua crescente popolarità, c'è una notevole assenza di video didattici che dimostrino le tecniche per ottenere il PRP nei cavalli.
Questo studio esamina un metodo a doppia provetta per centrifugazione per ottenere PRP nei cavalli. Il sangue intero di sei cavalli è stato raccolto in provette di citrato di sodio e centrifugato due volte a 120 × g per 5 minuti e 240 × g per 5 minuti. La concentrazione media di piastrine per PRP è stata di 360,95 ± 56,31 piastrine (PLT) × 103/μL, mentre la concentrazione media di leucociti è stata di 3,05 ± 1,53 cellule × 103/μL. La conta piastrinica nel PRP era 2,41 volte superiore a quella del sangue intero, mentre la concentrazione di leucociti nel PRP era 0,44 volte inferiore. L'efficienza di raccolta per PLT nel PRP è stata del 17%, mentre l'efficienza di raccolta per i leucociti nel PRP è stata del 3,1%. Le concentrazioni medie del fattore di crescita trasformante beta 1 e del fattore di crescita derivato dalle piastrine BB nel PRP sono state rispettivamente di 2601,82 (intervallo di confidenza (CI) al 95%: 2358,88-2844,76) pg/mL e 1208,05 (IC 95%: 1051,09-1365,02) pg/mL. Questi risultati indicano che il PRP può essere ottenuto in modo efficiente e riproducibile attraverso un metodo semplice ed economico, adatto all'uso da parte dei professionisti equini.
Introduzione
Il plasma ricco di piastrine (PRP) è un prodotto ortobiologico comunemente usato per trattare le condizioni muscoloscheletriche croniche equine come tendinopatie, desmopatie, artrosi e laminite 1,2,3. È anche efficace nel trattamento delle ferite degli arti e delle malattie della superficie oculare 4,5. Il razionale del suo utilizzo si basa sulle alte concentrazioni di fattori di crescita (GF) rilasciati principalmente dalle piastrine6. I leucociti contribuiscono anche rilasciando citochine regolatorie e antinfiammatorie7. I GF come il fattore di crescita trasformante beta 1 (TGF-β1) e il fattore di crescita derivato dalle piastrine BB (PDGF-BB) esercitano potenti effetti anabolici, proliferativi, angiogenici e antinfiammatori8. Dopo l'attivazione esogena o endogena, il PRP polimerizza in un gel ricco di piastrine, facilitando il traffico, l'ancoraggio e la differenziazione cellulare 6,9. In questo modo, il PRP funge da complessa impalcatura vivente e non solo da contenitore per GF e citochine10.
Diversi sistemi classificano i prodotti PRP utilizzati sia nell'uomo che nei cavalli 6,11,12. Uno dei sistemi più semplici e comuni classifica questi emocomponenti in base alla concentrazione di leucociti11,12. Secondo questa classificazione, i prodotti PRP con concentrazioni di leucociti da basse a trascurabili e concentrazioni di piastrine da basse a moderate - rispetto ai livelli nel sangue intero del cavallo - sono indicati come PRP puro (P-PRP)6,11,12. Al contrario, i prodotti PRP con concentrazioni leucocitarie da rilevabili ad alte e concentrazioni piastriniche da moderate ad alte sono indicati come plasma ricco di leucociti e piastrine (L-PRP)6,11,12.
I prodotti P-PRP sono tipicamente ottenuti mediante centrifugazione da provetta a provetta in cui il sangue intero viene raccolto dai cavalli in provette contenenti anticoagulanti come citrato di sodio e citrato, fosfato e destrosio13. Il sangue viene centrifugato due volte per separare le piastrine dagli altri componenti14. Al contrario, i prodotti a base di L-PRP sono preparati principalmente utilizzando kit semiautomatici progettati per il sangue umano, alcuni dei quali sono stati convalidati per l'uso nei cavalli 6,15. Questi kit semiautomatici richiedono generalmente centrifughe specializzate e hanno un costo più elevato16, nonché potenziali problemi di manipolazione asettica, che possono complicarne l'uso pratico in ambito clinico17. Inoltre, questi kit possono causare una concentrazione indesiderata di leucociti o globuli rossi eccessivi, che potrebbero essere dannosi in determinate situazioni cliniche18. Ad esempio, una conta leucocitaria elevata può provocare un'infiammazione eccessiva e una sovrabbondanza di globuli rossi potrebbe interferire con il processo di guarigione o portare a complicazioni come irritazione o rigetto dei tessuti15; tuttavia, un metodo comunemente usato per la produzione di L-PRP equino comporta un processo gravitazionale che non richiede attrezzature specializzate19.
Alla luce di queste limitazioni, sono altamente auspicabili alternative più semplici ed economiche per la preparazione del PRP. Vari studi in vitro, modelli sperimentali di malattie muscoloscheletriche e osservazioni negli equini hanno dimostrato che sia i prodotti P-PRP che L-PRP hanno effetti benefici sulle cellule e sui tessuti trattati 1,2,20. Questi prodotti promuovono la guarigione, riducono l'infiammazione e migliorano la rigenerazione dei tessuti6. Tuttavia, la decisione di utilizzare il P-PRP o l'L-PRP per trattare un equino potrebbe essere influenzata da fattori tecnici ed economici.
Secondo gli autori, non ci sono studi pubblicati che descrivano e dimostrino pienamente una procedura passo-passo ampiamente convalidata per ottenere un prodotto PRP dal sangue equino. Questo articolo delinea le procedure necessarie per raccogliere in sicurezza il sangue intero dai cavalli e produrre un prodotto PRP adatto sia per uso sperimentale che clinico. Include anche la convalida di questo farmaco ortobiologico mediante la quantificazione di piastrine e leucociti e la determinazione della concentrazione di TGF-β1 e PDGF-BB, che sono parte integrante dei suoi effetti terapeutici. Standardizzando il processo e dimostrando l'efficacia del prodotto, questo studio cerca di fornire un metodo affidabile e accessibile per i professionisti equini per preparare il PRP con sicurezza e precisione.
Sebbene il metodo della doppia centrifugazione per la produzione di PRP equino sia stato descritto per la prima volta da Argüelles et al.14 nel 2006, questa è la prima volta che il protocollo è stato completamente presentato in un video. Questo video vuole essere una risorsa pratica per i professionisti equini che devono affrontare limitazioni tecniche e vincoli di budget che impediscono loro di utilizzare kit PRP più sofisticati e costosi per cavalli con disturbi muscoloscheletrici.
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Protocollo
Questo studio è stato condotto in conformità con i protocolli interni per la preparazione e l'uso del PRP nei cavalli presso l'Ospedale Universitario Veterinario dell'Universidad de Caldas, Manizales, Colombia. Questo studio non ha richiesto l'approvazione del Comitato Interno per la Cura degli Animali poiché i dati sono stati ottenuti da cavalli zoppi trattati clinicamente presso il nostro istituto. Per sviluppare questo protocollo sono stati utilizzati i dati di sei cavalli creoli colombiani, tre fattrici e tre castrati, con un'età media di 7,4 (± 2,6) anni. I proprietari dei cavalli sono stati informati della natura dello studio e hanno firmato un modulo di consenso informato. Tutti i cavalli inclusi nello studio erano clinicamente sani, ad eccezione del problema muscoloscheletrico da trattare. Sono stati inclusi solo gli animali con una conta piastrinica basale superiore a 100 × 103/mL di sangue intero. È importante notare che i cavalli con concentrazioni piastriniche più basse possono essere considerati trombocitopenici14. Inoltre, questi animali hanno mostrato un normale esame emocromocitometrico, parametri biochimici clinici epatici e renali e valori di analisi delle urine entro l'intervallo normale per la specie equina.
1. Restrizione del cavallo e disinfezione della pelle
- Per la sicurezza sia del cavallo che del veterinario, trattenere saldamente il cavallo (Eqqus caballus) in uno scivolo per esami clinici o con una briglia (Figura 1A), a seconda del comportamento dell'animale. Quindi, taglia un'area di peli di 5 cm x 5 cm con un rasoio elettrico nel terzo medio di un lato del collo, sopra la vena giugulare.
NOTA: Alcuni proprietari preferiscono che il cavallo non venga tosato. Uno studio indica che il taglio dei capelli nel sito di venipuntura non è necessario per prevenire la contaminazione batterica di P-PRP21. Pertanto, questa procedura è a discrezione del veterinario. - Eseguire una preparazione preliminare della pelle non sterile sull'area tagliata della vena giugulare per almeno 10 cm utilizzando una garza e guanti non sterili per circa 3 minuti. Applicare diversi pezzi di garza imbevuti di schiuma antisettica in uno schema circolare (Figura 1B).
- Preparare il sito di puntura venosa in modo asettico utilizzando sia guanti sterili che garze imbevute di disinfettante. Strofinare la pelle nella zona del collo con un movimento circolare per circa 5 minuti. Pulire l'area con una garza sterile imbevuta di alcol etilico al 95%.
2. Prelievo asettico del sangue
- Mettere 16 provette da 4,5 mL di citrato di sodio, precedentemente pulite con una garza imbevuta di alcol etilico al 95%, in una griglia di plastica pulita. Impregnare i cappucci in gomma dei tubi a vuoto con alcol etilico al 95%, soprattutto nell'incavo per l'accoppiamento dell'ago.
NOTA: In generale, sono necessarie otto provette da 4,5 ml di citrato di sodio per ottenere 2,5 ml di PRP. Il numero di tubi utilizzati in un caso particolare dipenderà dai tessuti molli o dall'articolazione specifica da trattare. - Inserire sterilemente un ago a farfalla nel sito giugulare disinfettato (Figura 2A) e collegare provette da 4,5 ml di citrato di sodio al supporto (Figura 2B). Agitare delicatamente le provette e metterle in una griglia di plastica.
NOTA: Una provetta da 4,5 mL di citrato di sodio viene utilizzata per gli emogrammi automatizzati e per preparare il plasma dopo la centrifugazione a centrifugazione dura. Questo plasma viene quindi utilizzato come controllo negativo per il confronto dei fattori di crescita e dell'arricchimento di citochine con il PRP.
3. Approvvigionamento di plasma ricco di piastrine
- Posizionare le provette da 4,5 mL di citrato di sodio contenenti sangue intero in un rotore oscillante a quattro posizioni con un angolo di 90° in una centrifuga da banco. Centrifugare le provette a 120 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, posizionare le provette da 4,5 mL contenenti sangue citrato e altre due provette lisce da 10 mL in un rack e posizionare il rack sul lato non dominante della mano dell'operatore all'interno di una cappa a flusso laminare di classe II su un telo sterile e impermeabile.
NOTA: Uno studio suggerisce che una cappa a flusso laminare di Classe II non è essenziale per prevenire la contaminazione batterica durante l'approvvigionamento di PRP21. Invece, il PRP può essere preparato in una camera bianca priva di correnti d'aria e polvere. In questo scenario, il rack per provette di sangue può essere posizionato su un tavolo coperto da un telo sterile e impermeabile. - Prima centrifugazione: Indossando una maschera facciale e guanti sterili, posizionare una siringa luer sterile da 10 ml accoppiata con un ago sterile (21 G 5/8") sul lato dominante della mano all'interno della cappa a flusso laminare.
NOTA: Da questo momento in poi, la mano guantata dominante rimane sempre sterile, mentre i cappucci in gomma delle provette di citrato di sodio devono essere rimossi utilizzando la mano guantata non dominante. - Inserire l'ago sterile in ogni provetta di sangue cittrato centrifugato a 3 mm sopra il buffy coat (Figura 3A) e aspirare delicatamente il 50% della frazione plasmatica, evitando turbolenze di liquidi e aspirazione di sangue. Una volta aspirati 10 mL di plasma da quattro provette da 4,5 mL, distribuirli in provette semplici sterili da 5-10 mL (Figura 3B).
NOTA: Rimuovere i tappi di gomma di questi tubi con la mano non dominante e posizionarli su un sito sterile del telo o tenerli per evitare la contaminazione batterica. - Seconda centrifugazione: richiudere le provette con i tappi di gomma e posizionarle in uno stato di equilibrio in un rotore oscillante a quattro posti con un angolo di 90° nella centrifuga da banco e far girare queste provette a 240 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: La scelta della forza di centrifugazione relativa (RCF o g) si basa su uno studio seminale14 che ha descritto per la prima volta questo metodo per ottenere PRP dal sangue equino. Inoltre, la riproducibilità di questo metodo è stata valutata da altri autori22. - Posizionare le provette in una rastrelliera e posizionarle sul lato non dominante all'interno della cappa a flusso laminare di classe II, sopra il telo precedentemente posato, sterile, impermeabile.
- Utilizzare la mano non dominante per rimuovere i cappucci di gomma e la mano dominante sterile per aspirare lentamente il primo 75% di plasma utilizzando un ago spinale da 18 G e 90 mm collegato a una siringa luer sterile da 10 ml (Figura 3C). Gettare questa siringa o riservarla per altri usi sperimentali o clinici poiché contiene plasma povero di piastrine (PPP). Quindi, collegare l'ago spinale sterile precedentemente utilizzato a una siringa luer sterile da 5 o 10 ml per aspirare il plasma rimanente (25%) dalla provetta liscia sterile da 5-10 ml. Questa frazione è nota come P-PRP (Figura 3D).
NOTA: In determinate condizioni cliniche e sperimentali, un'aliquota di 0,5-1 mL di PRP viene utilizzata per gli emogrammi automatizzati seguiti dall'analisi del fattore di crescita (TGF-β1 e PDGF-BB) mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico. La misurazione di questi mediatori può essere effettuata 3 ore dopo l'attivazione del P-PRP con sali di calcio o trombina23 o dopo aver indotto un danno cellulare mediante variazione di temperatura o aggiunta di detergenti non ionici24. - Avvolgere la siringa luer sterile contenente PRP in un piccolo telo sterile impermeabile con un ago o un cappuccio sterile attaccato per prevenire la contaminazione batterica del prodotto ortobiologico (Figura 4A).
NOTA: La struttura anatomica del cavallo da trattare deve essere preparata per l'iniezione asettica come descritto nella sezione 1 di questo protocollo. Il cavallo deve essere adeguatamente trattenuto e sedato per ridurre al minimo il disagio e garantire la sicurezza sia del cavallo che del veterinario. Il prodotto PRP deve essere maneggiato utilizzando guanti e aghi sterili e può essere attivato o meno in base alle preferenze del medico (Figura 4B).
4. Analisi statistica
- Raccogli dati sulla conta piastrinica e leucocitaria nel sangue intero e nel PRP. Valutare i dati per la normalità utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov. Se i dati sono distribuiti normalmente (P > 0,05), confrontare e analizzare i dati delle celle utilizzando il t-test. Se i dati sulla concentrazione di piastrine e leucociti non sono distribuiti normalmente (P < 0,05), confrontare e analizzare i dati utilizzando un test di Wilcoxon.
- Determinare la concentrazione di efficienza piastrinica e leucocitaria nel P-PRP secondo le seguenti formule25:
Efficienza di raccolta piastrinica =
× 100
Efficienza di raccolta dei leucociti =
× 100 - Raccogliere dati dalle concentrazioni di TGF-β1 e PDGF-BB nei surnatanti PRP plasmatici (controllo negativo) (dopo 3 ore di attivazione con gluconato di calcio) e lisati di PRP ottenuti mediante l'aggiunta di una soluzione detergente non ionica.
- Utilizzare un modello misto lineare generalizzato per confrontare le concentrazioni dei fattori di crescita tra plasma, surnatanti PRP e lisato di PRP. In caso di differenze statistiche significative, applicare un test post-hoc di Tukey.
- Considera p < valori 0,05 statisticamente significativi per tutti i test.
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Risultati
La conta piastrinica media (piastrine × 103/μL) era significativamente più alta nel PRP rispetto al sangue intero (p < 0,001). Al contrario, la concentrazione media di leucociti (leucociti × 103/μL) nel PRP era significativamente inferiore a quella nel sangue intero (p < 0,001) (Tabella 1). In particolare, la conta piastrinica nel PRP era 2,41 volte superiore a quella del sangue intero, mentre la concentrazione di leucociti nel PRP era 0,44 volte inferiore. L'efficienza di rac...
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Discussione
L'uso del PRP in medicina umana e veterinaria per il trattamento dei disturbi muscoloscheletrici cronici è in aumento 1,8,26,27. Tuttavia, una delle principali critiche alle applicazioni del PRP in contesti sperimentali e clinici è la mancanza di dati di base sulle tecniche e sui protocolli utilizzati per preparare questi emocomponenti28...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados dell'Universidad de Caldas, Manizales, Colombia per il loro sostegno finanziario alla pubblicazione di questo articolo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per la raccolta del sangue venoso da 10 mL | BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, Stati Uniti | Riferimento 366430 | Questo è solo un esempio, è possibile utilizzare tubi di altre marche. |
| Provette da 4,5 mL di citrato di sodio (105 M/3,2%) | BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, Stati Uniti | 107451 | Questo è solo un esempio, è possibile utilizzare tubi di altre marche. |
| Centrifuga da banco | Rotofix 32A, Hettich GmbH, Tuttlingen, Germania | Possono essere utilizzate altre centrifughe da banco. | |
| Ago a farfalla (21 G & volte; 0,75 pollici) con 12 pollici. tubo e supporto prefissato | Set per la raccolta del sangue Safety-Lok, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA | Rif: 367296 | Questo è solo un esempio, è possibile utilizzare aghi a farfalla di altre marche. |
| Soluzione schiumogena di clorexidina al 2,3-4% | Il marchio o i nomi commerciali di questi prodotti possono variare da paese a paese. | ||
| Cappa a flusso laminare di classe II | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti | Possono essere utilizzate altre cappe a flusso laminare di classe II | |
| Lettore ELISA | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti | ||
| Alcol etilico al 95% | Il marchio o i nomi commerciali di questi prodotti possono variare da paese a paese. | ||
| Umano PDGF-BB DuoSet ELISA | R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, Stati Uniti | DY220 | |
| Umano TGF-beta 1 DouSet ELISA | R& D Systems, Inc, McKinley Place, MN, Stati Uniti | DY240 | |
| Soluzione di schiuma di iodio povidone al 4-10% | Il marchio o i nomi commerciali di questi prodotti possono variare da paese a paese. | ||
| Software SPSS 25.0 | IBM Corp, SPSS, NY, STATI UNITI | ||
| Siringhe luer sterili di vari volumi | Siringa Discardit, BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA | Questo è solo un esempio, è possibile utilizzare siringhe di altre marche. | |
| Ago spinale sterile (18 G & volte; 90 mm) | Ago di spinello BD Quincke, Franklin Lakes, NJ, Stati Uniti | Questo è solo un esempio, è possibile utilizzare aghi spinali di altre marche. |
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