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Articolo metodologico

Trattamento isolato delle isole pancreatiche e misurazione dell'apoptosi

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DOI:

10.3791/67996

⸱

2 maggio 2025

 ,  , 
1Chemical & Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Quantitative Biosciences & Engineering, Colorado School of Mines, 3Barbara Davis Center for Diabetes, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In questo articolo

Sommario

Questo studio utilizza marcatori di morte cellulare e apoptosi basati sulla fluorescenza multi-colorazione combinati con la microscopia confocale per valutare l'apoptosi indotta da citochine e la morte specifica delle cellule β nelle isole pancreatiche. Rivela cambiamenti spaziali e temporali nella morte cellulare e nell'apoptosi in risposta a stimoli extracellulari.

Abstract

Questo studio indaga l'effetto delle citochine pro-infiammatorie sulle isole pancreatiche, in particolare sulle cellule β produttrici di insulina, utilizzando una combinazione di tecniche di colorazione a fluorescenza e microscopia confocale per valutare la vitalità cellulare, l'apoptosi e la morte specifica per β cellule. Le isole di topo isolate sono state trattate con concentrazioni variabili di un cocktail di citochine, tra cui TNF-α, IL-1β e IFN-γ, per imitare l'apoptosi immuno-mediata durante lo sviluppo del diabete di tipo 1. La vitalità delle cellule insulari è stata valutata con la doppia colorazione FDA/PI, dove la conversione della FDA in fluoresceina indicava cellule vitali e cellule compromesse dalla membrana marcate con PI. YOPRO-1 e la colorazione nucleare hanno fornito ulteriori dati sull'apoptosi, con l'annessina-V che conferma le cellule apoptotiche precoci. L'analisi quantitativa ha rivelato aumenti significativi dei tassi di apoptosi e di mortalità cellulare nelle isole trattate con citochine. Per valutare in modo specifico gli effetti sulle cellule β, è stata utilizzata la colorazione selettiva con indicatore Zn2+ per marcare le cellule produttrici di insulina attraverso l'associazione zinco nei granuli di insulina, rivelando una sostanziale perdita di cellule β dopo il trattamento delle isole con citochine pro-infiammatorie per 24 ore. Questi protocolli multi-colorazione catturano e quantificano efficacemente l'entità del danno indotto dalle citochine nelle isole e possono essere utilizzati per valutare le terapie progettate per prevenire l'apoptosi β cellulare nel diabete di tipo 1 precoce.

Introduzione

Le isole pancreatiche, note anche come isole di Langerhans, sono un insieme di cellule endocrine situate all'interno del pancreas. Le cellule β produttrici di insulina sono il componente più abbondante e funzionalmente significativo delle isole pancreatiche. Queste cellule β secernono insulina, un ormone che svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi del glucosio1. Nel diabete di tipo 1 (T1D), il sistema immunitario prende di mira e si infiltra nelle isole pancreatiche, distruggendo le cellule β produttrici di insulina. Questo attacco autoimmune è mediato principalmente da citochine pro-infiammatorie, tra cui l'interleuchina-1β (IL-1β), il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α) e l'interferone-gamma (IFN-γ)2. Queste citochine avviano una cascata di eventi di segnalazione all'interno delle cellule β che alla fine innescano l'apoptosi3. L'apoptosi, la morte cellulare programmata, è un processo strettamente regolato che coinvolge l'attivazione delle caspasi, la frammentazione del DNA e la disintegrazione cellulare. Contribuisce alla graduale perdita della massa e della funzione delle cellule β durante l'insorgenza del T1D3.

Comprendere i meccanismi molecolari che guidano l'apoptosi β cellulare è fondamentale per identificare strategie per prevenire o mitigare la distruzione delle cellule β nel T1D. Per raggiungere questo obiettivo, le isole pancreatiche isolate da modelli sperimentali o cadaveri umani fungono da sistema modello robusto e consolidato per lo studio della patologia β-cellulare 2,3. Trattando queste isole isolate con citochine pro-infiammatorie, i ricercatori possono replicare l'ambiente che caratterizza il T1D precoce, consentendo lo studio dettagliato della disfunzione e della morte delle cellule β in vitro 4,5. Questi esperimenti forniscono informazioni chiave sulla vulnerabilità e la sopravvivenza delle cellule β in condizioni associate alla malattia e servono anche come piattaforma per testare interventi terapeutici volti a proteggere o salvare le cellule β dall'apoptosi indotta dalle citochine. Utilizzando questo sistema in vitro, possiamo analizzare efficacemente come le isole di diverse specie rispondono a varie condizioni, fornendo una migliore comprensione delle variazioni funzionali e apoptotiche tra le specie.

Studi precedenti hanno dimostrato che le isole di topo e umane trattate per 24 ore con un cocktail (1x = 10 ng/mL di TNF-α, 5 ng/mL di IL-1β e 100 ng/mL di IFN-γ) di citochine di topo e di derivazione umana, rispettivamente, hanno provocato una morte significativa delle cellule insulari 4,5,6. La vitalità delle isole è stata confermata colorando le cellule trattate con citochine con fluoresceina diacetato (FDA) e ioduro di propidio (PI)5,6. A livello globale, la vitalità delle isole viene valutata utilizzando la tecnica standard di esclusione del colorante legante l'acido desossiribonucleico (DNA) con FDA e PI7. I coloranti fluorescenti o i substrati coniugati con colorante valutano la vitalità cellulare in base all'integrità e alla permeabilità della membrana. FDA, un colorante permeabile alle cellule, viene convertito dalle cellule viventi in fluorescenza verde (fluoresceina). Al contrario, il PI, un colorante cellulo-imponente, colora solo i nuclei delle cellule morte con membrane compromesse7. Le cellule vengono quindi analizzate attraverso l'imaging a due colori su un microscopio confocale, dove le lampade fluorescenti verdi e rosse contrassegnano rispettivamente le cellule vitali e quelle morte.

Il limite del protocollo di colorazione FDA/PI è che il PI entra solo nelle cellule che hanno perso la selettività della membrana, il che significa che non è in grado di distinguere le cellule apoptotiche precoci. Inoltre, questo metodo non è in grado di differenziare tra sottogruppi cellulari, il che lo rende inadatto per valutare selettivamente la vitalità β-cellulare. Il protocollo Annexin V/PI è comunemente usato per lo studio delle cellule apoptotiche e il protocollo è stato modificato per migliorarne l'accuratezza8. Le prime fasi dell'apoptosi comportano la traslocazione della fosfatidilserina dallo strato interno a quello esterno della membrana plasmatica. L'annessina V, una proteina calcio-dipendente, si lega con elevata affinità a questa fosfatidilserina esposta. La colorazione con PI viene condotta insieme all'annessina-V per distinguere le cellule apoptotiche (solo annessina V-positiva) dalle cellule necrotiche (positive sia per l'annessina-V che per il PI), poiché le cellule necrotiche mostrano anche fosfatidilserina a causa della compromissione dell'integrità della membrana9. Altri coloranti, come YOPRO-1, vengono utilizzati anche per quantificare l'apoptosi delle cellule insulari. La membrana cellulare delle cellule vitali è impermeabile a YOPRO-1, a differenza dell'annessina-V, che non è in grado di quantificare le cellule viventi in fase di apoptosi.

Per valutare la morte delle cellule β pancreatiche, sono necessari coloranti specifici che mirano solo alle cellule produttrici di insulina. Una caratteristica distintiva delle cellule β pancreatiche è che una porzione di Zn2+ intracellulare è immagazzinata in vescicole come un complesso Zn2+-insulina (rapporto 2:1)10. Lo Zn2+ libero esiste anche nello spazio extragranulare attorno alle celle β come serbatoi. Lo Zn2+ e lo Zn2+ liberi legati all'insulina in granuli secretori possono essere visualizzati utilizzando coloranti leganti lo zinco. Il ditizone, un colorante legante lo zinco, è comunemente usato per valutare la purezza delle isole, ma non può essere combinato con coloranti fluorescenti utilizzati per valutare la vitalità e la funzione delle cellule β11. Sonde UV come TSQ e Zinquin, che sono altamente selettive nei confronti dello Zn2+, sono state sviluppate per quantificare le cellule β mediante imaging e misurazione dello Zn2+ intracellulare libero; 12,13. Tuttavia, il loro uso è limitato dalla scarsa solubilità, dal carico irregolare delle cellule, dai requisiti di eccitazione UV e dalla compartimentazione in vescicole acide14. Anche le sonde fluorescenti a lunghezza d'onda visibile, come il verde di Newport e l'indicatore selettivo Zn2+, sono state sviluppate per superare queste limitazioni e sono ora ampiamente utilizzate per rilevare le cellule β in isole umane isolate15,16. FluoZin-3 (indicatore selettivo Zn2+) ha un'affinità per Zn2+ più elevata e una resa quantica superiore rispetto a Newport Green e si è dimostrato efficace per l'imaging di Zn2+ co-rilasciato con insulina in isole isolate14,17.

L'utilizzo di coloranti fluorescenti come FDA, PI, Annexina V, YOPRO-1 e Zn2+ consente la misurazione e la differenziazione tra cellule morte vitali, apoptotiche e totali. La combinazione di sonde compatibili e altamente selettive offre anche un metodo mirato per valutare e quantificare la vitalità e l'apoptosi delle cellule β, che è fondamentale per comprendere e mitigare la distruzione delle cellule β nella ricerca sul diabete e nello sviluppo di farmaci.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti con i topi sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Colorado di Denver (Protocolli 000929). I topi C57Bl/6 utilizzati per questo esperimento sono stati acquistati dal Jackson Laboratory e alloggiati in una struttura a temperatura controllata con un ciclo luce/buio di 12 ore con accesso a cibo e acqua ad libitum. Le isole isolate di topo sono state ottenute utilizzando il protocollo di digestione della collagenasi, che è stato precedentemente descritto 5,18.

1. Preparazione di soluzioni e terreni di coltura

NOTA: I terreni di coltura, le scorte di citochine e altri reagenti devono essere preparati in condizioni sterili.

  1. Preparare un terreno di coltura delle isole aggiungendo il 10% di siero fetale bovino (FBS), 10.000 U/mL di penicillina e 10.000 μg/mL di streptomicina a 500 mL di terreno 1640 RPMI.
  2. Preparare 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4. Preparare una soluzione madre 1000x di cocktail di citochine di topo, 10 μg/mL di TNF-α 10μg/mL, 5 μg/mL di IL-1β e 100 μg/mL di IFN-γ in PBS sterile contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) e conservare la soluzione in aliquote da 10 μL a -20 °C.
  3. Preparare una soluzione madre FDA da 46 μM (50x) in acetone e conservarla in aliquote da 1 mL a -20°C. Preparare una soluzione madre di PI da 1,434 mM (50x) in PBS e conservarla in aliquote da 1 mL a 4 °C.
  4. Preparare 500 mL di tampone Krebs-Henseleit HEPES (BMHH) modificato con bicarbonato con 125 mM di NaCl, 5,7 mM di KCl, 2,5 mM di CaCl2, 1,2 mM di MgCl2 e 10 mM di HEPES in 500 mL di dH2O. Regolare il pH a 7,4.
  5. Preparare 100 mL di tampone legante l'Annessina-V con 10 mM di HEPES, 140 mM di NaCl e 2,5 mM di CaCl2 in 100 mL di dH2O. Regolare il pH a 7,4.
  6. Preparare 1 mM di soluzione madre per indicatore selettivo Zn2+ in DMSO e conservare in aliquote da 10 μl a -20 °C.
    NOTA: I coloranti fluorescenti sono sensibili alla luce, quindi la conservazione e l'incubazione devono essere al buio.

2. Trattamento di isole isolate con citochine

  1. Isolare le isole di topo con una micropipetta da 10 μL nel terreno di coltura e incubare per una notte a 37 °C e 5% di CO2 per riprendersi dallo stress da isolamento prima del trattamento con citochine.
  2. Aggiungere 2 mL del terreno di coltura delle isole sterilizzato a piastre di Petri non trattate con colture tissutali da 35 mm ed etichettarle in modo appropriato per differenziare le piastre trattate con citochine e quelle non trattate senza citochine.
  3. Per le piastre trattate con citochine, rimuovere 6 μL di terreno di coltura e sostituirlo con 2 μL di ciascuna citochina dalla soluzione madre per ottenere una concentrazione relativa finale di citochine di 10 ng/mL, 5 ng/mL di IL-1β e 100 ng/mL di IFN-γ (1x RCC).
    NOTA: L'RCC inferiore di 0,5x e 0,1x può essere preparato diluendo le soluzioni madre con PBS sterile contenente lo 0,1% di BSA rispettivamente a 1:1 e 1:9.
  4. Alle 12 h-24 h dopo l'isolamento, prelevare 10-20 isole utilizzando una micropipetta al microscopio ottico e trasferirle nelle piastre e incubarle in un incubatore umidificato a 37 °C, CO2 al 5% per 24 h.
    NOTA: Il tempo di incubazione può variare a seconda degli specifici obiettivi sperimentali.

3. Misurazione della vitalità delle isole con FDA/PI

  1. Aggiungere 20 μl di soluzioni madre FDA e PI a 960 μl del tampone BMHH contenente lo 0,1% di BSA per ottenere una concentrazione finale di 0,46 μM e 14,34 μM di coloranti fluorescenti, rispettivamente.
  2. Aliquotare 100 μl della soluzione colorante in una piastra di Petri non trattata con colture tissutali con fondo di vetro da 7 mm.
  3. A 24 ore dopo l'incubazione con citochine, trasferire con cura almeno 6 isole da ciascun trattamento nella capsula di Petri con fondo di vetro. Incubare per 5 - 10 minuti a temperatura ambiente al buio (coprire con un foglio).
  4. Scatta immagini utilizzando la microscopia a fluorescenza con un obiettivo a immersione in acqua 40x. Scatta le immagini entro 15 minuti dalla colorazione FDA/PI.
  5. Utilizzare laser di eccitazione a 488 nm e 514 nm per rilevare le emissioni di fluorescenza rispettivamente per FDA (520 nm) e PI (620 nm).
  6. Immagini di isolotti come z-stack composto da tre immagini, distanti 10 μm l'una dall'altra. Fotografare solo la parte inferiore 1/3 - 1/2 dell'isolotto per ridurre la perdita di segnale dovuta a problemi di dispersione della luce nell'isolotto.
  7. Contare manualmente le cellule verdi vive (FDA-positive) e rosse morte (PI-positive) in ImageJ (NIH) per almeno 5 isole per topo (n = 3). Calcola la percentuale di morte cellulare come segue:
    percentuale di morte delle isole = numero di cellule morte/ (numero di cellule morte + numero di cellule vive) x 100%

4. Misurazione dell'apoptosi mediante colorazione

  1. Aggiungere 8 μL di YOPRO-1 (soluzione 1mM) a 992 μL di tampone di imaging BMHH per una concentrazione finale di 0,8 μM.
  2. Aliquotare 500 μl della soluzione colorante in una piastra di Petri da 14 mm con fondo di vetro non trattato con coltura tissutale.
  3. A 24 ore dall'incubazione con citochine, trasferire con cura almeno 6 isole di ciascun trattamento nella capsula di Petri con fondo di vetro e incubare per 1 ora a 37 °C al buio (coprire con un foglio).
  4. Dopo 20 minuti di incubazione, aggiungere una goccia di NucBlue (colorazione nucleare, 20 μL) a ciascuna capsula di Petri con fondo di vetro e continuare l'incubazione. Il tempo totale di incubazione è di 1 ora per YOPRO-1 e di 40 minuti per la colorazione nucleare.
  5. Dopo 1 ora di incubazione, trasferire le isole in un tampone di imaging BMHH fresco contenente lo 0,1% di BSA (100 μL) in una piastra di Petri da 7 mm con fondo di vetro non trattata con coltura tissutale.
  6. Scatta immagini utilizzando la microscopia a fluorescenza con un obiettivo a immersione in acqua 40x. Utilizzare laser di eccitazione a 405 nm e 488 nm per rilevare le emissioni di fluorescenza della colorazione nucleare (460 nm) e di YOPRO-1 (509 nm), rispettivamente.
  7. Immagini di isolotti come z-stack composto da tre immagini, distanti 10 μm l'una dall'altra. Fotografare solo la parte inferiore 1/3 - 1/2 dell'isolotto per ridurre la perdita di segnale dovuta a problemi di dispersione della luce nell'isolotto.
  8. Contare manualmente le cellule vive blu (positive alla colorazione nucleare) e verdi apoptotiche (YOPRO-1-positive) in ImageJ (NIH) per almeno 5 isole per topo (n = 3). Calcola la percentuale di cellule insulari apoptotiche come segue:
    Percentuale di cellule insulari apoptotiche = Numero di cellule apoptotiche / (numero di cellule apoptotiche + numero di cellule vive) x 100%

5. Misurazione dell'apoptosi con annessina V/colorazione nucleare

  1. Aggiungere 2 gocce di colorante nucleare (40 μL) a 1 mL di tampone legante l'annessina. Aliquotare 100 μl della soluzione in una piastra di Petri non trattata con colture tissutali con fondo di vetro da 7 mm.
  2. A 24 ore dopo l'incubazione con citochine, sciacquare accuratamente pipettando su e giù almeno 3 volte almeno 6 isole da ciascun trattamento in PBS pipettando su e giù tre volte utilizzando la micropipetta da 10 μl. Trasferire le isole nella capsula di Petri con fondo di vetro con la soluzione di colorante nucleare e incubarle per 40 minuti a 37 °C al buio (coprire con un foglio).
  3. Dopo 25 minuti di incubazione, aggiungere 5 μL di Annessina V Alexa Flour 488 coniugato a ciascuna capsula di Petri con fondo di vetro e continuare l'incubazione. Il tempo totale di incubazione è di 40 minuti per la colorazione nucleare e di 15 minuti per l'annessina V.
  4. Dopo 40 minuti di incubazione, trasferire le isole in un tampone di imaging BMHH fresco (senza annessina V o colorazione nucleare) in una capsula di Petri con fondo di vetro da 7 mm.
  5. Scatta immagini utilizzando la microscopia a fluorescenza con un obiettivo a immersione in acqua 40x. Utilizzare laser di eccitazione a 405 nm e 488 nm per rilevare le emissioni di fluorescenza della colorazione nucleare (460 nm) e del coniugato di annessina V (515 nm), rispettivamente.
  6. Immagini di isolotti come z-stack composto da tre immagini, distanti 10 μm l'una dall'altra. Fotografare solo la parte inferiore 1/3 - 1/2 dell'isolotto per ridurre la perdita di segnale dovuta a problemi di dispersione della luce nell'isolotto.
  7. Contare manualmente le cellule vive blu (colorazioni nucleari positive) e verdi apoptotiche (annessina V-positiva) in ImageJ (NIH) per almeno 5 isole per topo (n = 3). Calcola la percentuale di cellule insulari apoptotiche come segue:
    Percentuale di cellule apoptotiche = numero di cellule apoptotiche / (numero di cellule apoptotiche + numero di cellule vive) x 100%

6. Misurazione della morte β cellulare utilizzando l'indicatore selettivo Zn2+ / colorazione nucleare/PI

  1. Aggiungere 2 μL di soluzione madre per indicatore selettivo Zn2+ AM a 998 μL di tampone di imaging BMHH per ottenere una concentrazione finale di 0,2 μM. Aliquotare 500 μL della soluzione colorante in una piastra di Petri da 14 mm con fondo di vetro non trattata con coltura tissutale.
  2. A 24 ore dopo l'incubazione con citochine, trasferire con cura almeno 6 isole da ciascun trattamento nella capsula di Petri con fondo di vetro. Incubare per 1 ora a 37 °C al buio con la soluzione AM di indicatore selettivo Zn2+ (coprire con un foglio).
  3. Dopo 20 minuti di incubazione, aggiungere una goccia di colorante nucleare (20 μl) a ciascuna capsula di Petri con fondo di vetro, secondo le istruzioni del produttore e continuare l'incubazione. Il tempo totale di incubazione è di 1 ora per l'indicatore selettivo Zn2+ e di 40 minuti per la colorazione nucleare.
  4. Dopo 1 ora di incubazione, trasferire le isole in un tampone di imaging BMHH fresco contenente lo 0,1% di BSA (100 μL) in una piastra di Petri da 7 mm con fondo di vetro non trattata con coltura tissutale. Aggiungere 2 μL di soluzione madre PI per 10 minuti per ottenere una concentrazione finale di 20 μg/mL.
  5. Scatta immagini entro 15 minuti dalla colorazione PI utilizzando la microscopia a fluorescenza con un obiettivo a immersione in acqua 40x. Utilizzare laser di eccitazione a 405 nm, 488 nm e 514 nm per rilevare le emissioni di fluorescenza della colorazione nucleare (460 nm), dell'indicatore selettivo Zn2+ (516 nm) e del PI (620 nm), rispettivamente.
  6. Immagini di isolotti come z-stack composto da tre immagini, distanti 10 μm l'una dall'altra. Fotografare solo la parte inferiore 1/3 - 1/2 dell'isolotto per ridurre la perdita di segnale dovuta a problemi di dispersione della luce nell'isolotto.
  7. Contare manualmente le cellule vive blu (colorazione nucleare positiva), verde di zinco (Zn2+ indicatore selettivo positivo) e rosso morto (PI-positivo) in ImageJ (NIH) per almeno 5 isole per topo (n = 3). Calcola la percentuale di morte delle cellule β come segue:
    percentuale di morte delle cellule β = numero di cellule zinco-positive e PI-positive / (numero di cellule insulari morte + cellule insulari vive) x 100%
    o
    percentuale di morte delle cellule β = numero di cellule zinco-positive e PI-positive / (numero di cellule zinco-positive) x 100%

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Risultati

La doppia colorazione con FDA e PI è stata utilizzata per valutare la vitalità delle isole trattate con citochine. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato (n = 3) e i dati sono stati generati da più immagini z-stack a 10 μm di distanza, con ciascuna replica contenente dati medi da 5 o 6 isole, per garantire la riproducibilità e il confronto statistico tra le isole trattate e non trattate. La Figura 1A mostra le isole sane del gruppo di controllo non trattato che mostrano una ...

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Discussione

Questo studio dimostra l'efficacia dei metodi di colorazione multipla con coloranti fluorescenti e microscopia confocale nella valutazione della vitalità delle cellule insulari, dell'apoptosi e della sopravvivenza delle cellule β in condizioni di stress indotto da citochine. La colorazione FDA/PI ha rivelato un aumento dose-dipendente della morte cellulare all'interno delle isole esposte alle citochine, come evidente dalla fluorescenza rossa che contrassegna le cellule compromesse dalla ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Le seguenti sovvenzioni hanno fornito fondi per questo lavoro: premio NIDDK R01 DK137221, JDRF 3-SRA-2023-1367-S-B a N.L.F. e ADA 7-20-JDF-020 a N.L.F. Gli autori desiderano ringraziare il supporto del Diabetes Research Center presso l'Università del Colorado Anschutz Campus P30-DK116073 e le strutture di base associate utilizzate per supportare questo lavoro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra Petri con fondo in vetro da 14 mmMattekP35G-1.5-14-C
1640 RPMICorning10-041-CV
Piastra Petri da 35 mmCelltreat229638
Piastra Petri con fondo in vetro da 7 mmMattekP35G-1.5-7-C
Annexin V, Alexa Flour 488Thermo Fisher (Invitrogen)A13201ex488/em515
Cloruro di calcio diidratoFisherC79
Dimetil solfossido anidroSigma276855
Siero fetale bovinoThermo Fisher (Gibco)26140079
Flouzin-3, AMThermo Fisher (Invitrogen)F24195ex488/em516
Fluoresceina diacetato (FDA)Thermo Fisher (Invitrogen)F1303ex488/em520
HEPESSigma54457
Software di elaborazione delle immaginiNIHImageJ
Cloruro di magnesioSigmaM8266
NucBlue Live ReadyProbes Reagente (Hoechst 33342)Thermo Fisher (Invitrogen)R37605ex360/em460
Penicillina-StreptomicinaThermo Fisher (Gibco)15-140-122 
Compresse saline tamponate con fosfatoFisherBP2944-100
Cloruro di potassio, Macron granulare6858-04
Ioduro di propidioThermo Fisher (Invitrogen)P1304MPex535/em620
Proteina ricombinante di topo IFN-gamma ProteinaR& D Systems485-MI-100/CF
Topo ricombinante IL-1 beta/IL-1F2 R& D Systems401-ML-100/CF
Proteina Ricombinante di TNF-alfa di topo (aa 80-235) D Systems410-MT-100/CF
Cloruro di sodio, cristalloMacron7581-12
Stellaris Microcope confocale con rivelatori spettraliLeicaDMI-8  Obiettivo ad immersione in acqua 40x.
Yopro-1 IoduroThermo Fisher (Invitrogen)Y3603ex488/em509

Riferimenti

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