Articolo metodologico

Un protocollo di citometria per elettroporazione per microscopia a fluorescenza su cellule vive utilizzando la coltura cellulare U2 OS

DOI:

10.3791/68005

⸱

13 giugno 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biology, Toronto Metropolitan University, 2Institute for Biomedical Engineering, Science and Technology (iBEST), a partnership between St. Michael's Hospital, a site of Unity Health Toronto, and Toronto Metropolitan University, 3Keenan Research Centre for Biomedical Science at St. Michael's Hospital

In questo articolo

Sommario

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L'elettroporazione è l'uso di campi elettrici pulsati (PEF) per creare pori transitori nelle colture cellulari per introdurre il carico molecolare. Questa tecnica è recentemente diventata ampiamente utilizzata nella ricerca e in contesti clinici. Qui, descriviamo le tecniche di elettroporazione utilizzando il "Sistema di citometria per elettroporazione" recentemente sviluppato per l'esecuzione di microscopia a fluorescenza su cellule vive.

Abstract

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I campi elettrici pulsati (PEF) hanno un'ampia gamma di applicazioni nella ricerca medica e nelle applicazioni cliniche. Un'area chiave di ricerca si concentra sull'elettroporazione (reversibile o irreversibile). L'elettroporazione reversibile è stata utilizzata per diversi decenni per il trasferimento di molecole attraverso le membrane cellulari come il DNA plasmidico, tipicamente indicato come elettrotrasferimento genico (GET). Al contrario, l'elettroporazione irreversibile è diventata una tecnica popolare nel trattamento del cancro, fornendo un'alternativa non tossica rompendo permanentemente le cellule utilizzando i PEF. Questo può essere combinato con vari tipi di farmaci o reagenti per migliorare l'effetto che è diventato noto come elettrochemioterapia (ECT). Tuttavia, nonostante l'ampio successo nelle applicazioni pratiche, sono necessarie ulteriori tecnologie e ricerche di supporto per migliorare le tecniche attuali. Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un sistema di citometria per elettroporazione per supportare la sperimentazione di PEF su cellule vive con la capacità di eseguire la microscopia a fluorescenza a lungo termine. Questo è stato in combinazione con una linea cellulare FUCCI(CA)5 U2-OS ad espressione stabile per valutare i cambiamenti nel ciclo cellulare in risposta all'esposizione alla PEF. In tal modo, è stata ottenuta una microscopia timelapse fino a 30 ore, fornendo variazioni in tempo reale dell'attività cellulare sulla base del reporter FUCCI(CA)5. Di conseguenza, i cambiamenti specifici di fase erano quantificabili per l'analisi a valle.

Introduzione

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I campi elettrici pulsati (PEF) sono cresciuti fino a diventare uno strumento comune per una varietà di applicazioni in biologia e applicazioni cliniche1. Questi possono essere ampiamente classificati in elettroporazione (EP) ed elettrostimolazione (ES). L'elettroporazione ha due sottocampi noti come elettroporazione reversibile e irreversibile. L'elettroporazione reversibile (RE) è stata utilizzata per decenni come strumento efficace per trasferire carichi molecolari come il DNA plasmidico in cellule di vario tipo come mammiferi, batteri e lieviti2. Più recentemente, l'elettroporazione irreversibile (IRE) è cresciuta in importanza come alternativa non tossica agli attuali trattamenti antitumorali3. Un sottocampo emergente è indicato come ablazione in campo pulsato (PFA), che si concentra sulla rimozione non termica dei tessuti, in particolare per il trattamento di alcune disfunzioni cardiache4. In combinazione con farmaci e altri reagenti, questo ha portato allo sviluppo dell'elettrochemioterapia (ECT). Tuttavia, l'attuale comprensione dei trattamenti con PEF è stata superata dalle applicazioni cliniche5. Qui presentiamo un sistema di citometria per elettroporazione per lo studio delle elettrochemioterapie. Il ciclo cellulare rappresenta un indicatore chiave della vitalità cellulare e i cambiamenti possono identificare effetti specifici della fase. Sviluppando questi strumenti, i protocolli possono essere adattati più rapidamente, fornendo trattamenti più efficaci per una gamma più ampia di tumori.

Il nostro sistema di elettrocitometria personalizzato (Figura 1) comprende una camera con elettrodi a piastre parallele in alluminio e un fondo in vetro di copertura, nonché un semplice generatore di impulsi a decadimento esponenziale. La camera è costruita da una camera stampata in 3D e un fondo in vetro di copertura #1.5 è fissato con adesivo sensibile alla pressione di grado medico. Gli elettrodi sono formati da una pellicola adesiva di alluminio posizionata su supporti integrati nella camera, fornendo due elettrodi paralleli a 0,4 cm di distanza. Si tratta di una configurazione comune per gli elettrodi commerciali e fornisce un design robusto in grado di adattare rapidamente i protocolli attuali. La camera può essere inserita all'interno di custodie ambientali progettate per vetrini da 25 mm x 55 mm, che è anche un formato di vetrino comune supportato dai fornitori di microscopi commerciali. Il generatore di impulsi fornisce impulsi di decadimento esponenziale fino a 330 V, consentendo di realizzare un'ampia gamma di esperimenti, tra cui l'elettroporazione reversibile e irreversibile.

Per studiare gli effetti dei PEF sul ciclo cellulare, abbiamo utilizzato una linea cellulare di osteosarcoma umano transgenico (U2 OS) che esprime l'indicatore fluorescente del ciclo cellulare di ubiquitinazione (CA)5 (FUCCI(CA)5), un costrutto reporter fluorescente del ciclo cellulare vivo. Il sistema introduce due forme fluorescenti tronche di Geminin e Cdt1, che vengono prodotte e riciclate a velocità specifiche durante il ciclo cellulare. Inoltre, l'apoptosi può essere monitorata direttamente durante l'esperimento utilizzando una linea di cellule U2-OS FUCCI(CA)5 che esprime stabilmente. Durante il ciclo cellulare, il reporter opera in modo prevedibile con ogni fase perché queste vengono prodotte e degradate alle stesse velocità delle versioni funzionali naturalmente espresse nella cellula. Quando si verifica l'apoptosi, questo ciclo viene interrotto e il ciclo cellulare si interrompe rapidamente. Tipicamente, questo si manifesta visivamente come lo stallo della fluorescenza all'interno del ciclo cellulare, seguito da drammatici cambiamenti morfologici al nucleo, che è chiaramente visibile a causa della localizzazione dei reporter al nucleo6. Ciò consente l'identificazione visiva di ogni fase nelle singole cellule nel tempo (Figura 2). L'elettroporazione reversibile provoca cambiamenti nelle condizioni intracellulari ed è stato selezionato per l'indagine un impulso di decadimento esponenziale di 180 V. Questo impulso è stato selezionato per limitare il più possibile la morte cellulare, garantendo al contempo l'elettroporazione nella maggior parte della popolazione. Questo è stato determinato sulla base di ricerche precedenti che studiavano i parametri ottimali dell'impulso di elettroporazione per sei linee cellulari di mammiferi. La densità di energia di un impulso a 180 V era leggermente inferiore ai parametri di trasfezione ottimali, fornendo una migliore vitalità cellulare con un'elevataporzione7. L'effetto dell'impulso è stato studiato in cellule non sincronizzate e in cellule sincronizzate in fase S utilizzando un doppio blocco di timidina con e senza applicazione di PEF (Figura 3). I risultati hanno indicato una diminuzione della lunghezza media per S e G2 rispetto al controllo. Ciò indicava che la fase S era sensibile all'esposizione alla PEF, con conseguente ciclo cellulare più veloce. Ciò ha dimostrato che il sistema di citometria per elettroporazione è stato in grado di combinare la somministrazione di PEF con l'imaging a lungo termine di cellule vive per lo studio del ciclo cellulare. Sebbene abbiamo utilizzato questa piattaforma per osservare la progressione cellulare attraverso il ciclo cellulare in risposta ai PEF, questo è uno strumento utile per studiare una varietà di applicazioni e condizioni per i PEF e la coltura cellulare.

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Protocollo

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1. Preparazione della coltura cellulare

  1. Preparare la linea stabile utilizzando l'elettroporazione reversibile con i seguenti parametri: 100 μL di cellule OS U2 risospese (6 × 106 cellule/mL) con 5 μg di DNA plasmidico in una cuvetta da 0,4 cm e un impulso a onda quadra da 180 V per 10 ms.
  2. D-print il design della camera personalizzata utilizzando qualsiasi stampante 3D appropriata e plastica biocompatibile come l'acido polilattico (PLA) (vedi File supplementare 1). Disinfettare la camera completata con etanolo (70%) e conservarla in un contenitore sterile prima dell'uso.
  3. Coltura di 5 cellule U2-OS FUCCI(CA)5 in una piastra da 10 cm con 10 mL di Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)-High Glucose contenente il 10% di siero fetale bovino e l'1% di PenStrep e incubazione a 37 °C e 5% di CO2.
  4. Quando la coltura raggiunge l'80% di confluenza, aspirare il terreno, lavare la coltura cellulare con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e dissociare le cellule utilizzando 1 mL di tripsina allo 0,25% per 1,5 minuti.
  5. Neutralizzare la tripsina risospendendo la coltura cellulare in 5 ml di DMEM-High Glucose (contenente il 10% di FBS e l'1% di PenStrep).
  6. Dalla coltura cellulare risoluta, prelevare un campione da 100 μL e posizionarlo nella camera del sistema di citometria per elettroporazione sul vetrino inferiore in vetro. Assicurarsi che la camera sia confluente al 30% dopo l'introduzione del campione. Se il campione sembra essere troppo confluente prima dell'incubazione, aspirare il campione e abbassare il volume del campione.
  7. Lentamente, aggiungere 4 ml di DMEM-High Glucose (contenente il 10% di FBS e l'1% di PenStrep) all'estremità più lontana della camera, evitando che il liquido fuoriesca dal campione.
  8. Posizionare un vetrino da microscopio standard sulla parte superiore della camera e incubare la camera a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore, assicurandosi che la coltura abbia aderito completamente al fondo della camera. Facoltativamente, utilizzare Hoechst 33342 (1 μg/mL) per colorare i nuclei cellulari per facilitare la quantificazione delle cellule a valle e l'apoptosi. Eseguire la colorazione 30 minuti prima della microscopia time-lapse.

2. Preparazione del microscopio

  1. Innanzitutto, accendi un microscopio a fluorescenza invertito con controlli ambientali e camera, consentendo alle condizioni di stabilizzarsi prima di eseguire l'elettroporazione.
    NOTA: Qualsiasi microscopio a fluorescenza invertito con un sistema ambientale in grado di accettare il vetrino da camera da 25 mm x 55 mm x 16 mm. Il progetto è stato originariamente progettato per funzionare sul microscopio invertito di riferimento (vedi Tabella dei materiali) e sul sistema ambientale corrispondente.
    Il riscaldamento del tavolino può causare una deriva nell'immagine a causa dell'espansione del metallo.
  2. Mentre il sistema ambientale sta raggiungendo la temperatura ottimale, collegare un multimetro digitale al condensatore del generatore di impulsi e all'interruttore ad alta tensione utilizzando cavi elettrici adeguati. Per seguire questo protocollo, utilizzare cavi a clip "a coccodrillo" per consentire un rapido montaggio e smontaggio con la camera di elettroporazione.
  3. Quindi, selezionare l'ingrandimento 20x e, utilizzando il software del microscopio, assicurarsi che i canali FITC (GFP) e A594 (TexRed/mCherry) (opzionalmente, canale DAPI per Hoechst 33342) siano selezionati corrispondenti alle due proteine fluorescenti nel sistema FUCCI(CA)5. Utilizzare impostazioni di esposizione basse (in genere <0,05 s) per evitare danni alla foto durante time-lapse a lungo termine.
  4. Ottimizza la messa a fuoco e la qualità dell'immagine scattando immagini di prova prima di iniziare il time-lapse.
    NOTA: La fluorescenza deve essere luminosa solo quanto necessario per la visualizzazione dei colori.
  5. Programma il time-lapse per catturare 3-6 punti di vista ogni 10 minuti per 24 ore per ottenere un elevato volume di dati del ciclo cellulare per time-lapse mitigando al contempo i danni fotografici.
    NOTA: La durata può variare a seconda della scala temporale dell'attività cellulare.
  6. Assicurarsi che la messa a fuoco automatica sia abilitata per il canale A594 per ottenere i migliori risultati nel monitoraggio della coltura cellulare durante il time-lapse.
  7. Lasciare il software in modalità standby fino a quando non viene eseguita l'elettroporazione. Una volta erogato l'impulso, attivare immediatamente il time-lapse per garantire la massima precisione possibile dei dati.

3. Elettroporazione

  1. Posizionare la camera di citometria per elettroporazione nel microscopio con una camera ambientale appropriata. Prima dell'elettroporazione, lasciare la camera chiusa con il sistema ambientale in funzione per garantire che il ciclo della cella non venga influenzato.
  2. Collegare un multimetro digitale al generatore di impulsi e collegare il generatore di impulsi agli elettrodi della camera utilizzando cavi a coccodrillo aprendo la camera ambientale.
  3. Caricare il condensatore nel generatore di impulsi a 180 V e scaricare rapidamente l'impulso nella camera fino a quando il multimetro digitale non legge 0 Volt.
  4. Rimuovere i collegamenti elettrici alla camera e riposizionare il coperchio il più rapidamente possibile per garantire condizioni di coltura adeguate.
  5. Attivare immediatamente il time-lapse una volta che il sistema ambientale del microscopio è in posizione.

4. Acquisizione dati time-lapse

  1. Dopo che il time-lapse è stato completato, utilizzare il software del microscopio per salvare il time-lapse come un singolo video basato sulle immagini catturate per tutta la durata del time-lapse. Migliorare la qualità visiva in questa fase per facilitare la quantificazione manuale.
    NOTA: È possibile selezionare qualsiasi frame rate; Tuttavia, 6 fotogrammi / s forniscono una velocità di riproduzione moderata con 1 secondo video che si traduce in 1 ora di tempo reale.
  2. Una volta preparato il video time-lapse, traccia le fasi della cella nel tempo osservando i cambiamenti nei segnali FITC e A594

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Risultati

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Utilizzando il sistema FUCCI (Figura 2), i dati visivi del ciclo cellulare sono stati ottenuti misurando il periodo di tempo per il quale ciascun colore è stato espresso dalla cellula come risultato dell'espressione proteica e dell'unbiquitinazione. Sulla base dei risultati degli esperimenti non sincronizzati e sincronizzati (Figura 3), era evidente che l'esposizione alla PEF in fase S sovraregolava il ciclo cellulare. Ciò è stato evidenziato dalla diminuzione d...

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Discussione

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Se eseguiti correttamente, i dati della fase del ciclo cellulare possono essere quantificati per volumi elevati di singole cellule per periodi fino a 24 ore. Questo protocollo ha prodotto dati sul ciclo cellulare comparabili a metodi alternativi come i FAC. Questo è un metodo comunemente usato in base al quale le cellule vengono marcate in fluorescenza man mano che progrediscono nel ciclo cellulare. Dopo un'incubazione di almeno 24 ore, vengono ordinati in base all'intensità fluorescente...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare sia il Gupta Lab che i membri del Gruppo Rackus per il loro continuo supporto all'interno e all'esterno del laboratorio. Sovvenzioni generosamente fornite attraverso la partnership con Mitacs.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vetrino da camera (stampato/valutato in 3D) N/AN/A
Piastra di coltura (10 cm)Sarstedt83.3902
Delta VisionOlympusN/APossono essere utilizzati anche modelli di microscopi alternativi. Assicurarsi che il tavolino e il sistema ambientale possano ospitare il vetrino della camera di elettroporazione (55 mm x 
DMEM – Gibco ad alto glucosio11965092
fetale bovino ThermoFisherA5256701 
i3 MK3S Stampante 3DPrusaN/AÈ possibile utilizzare modelli di stampante alternativi che possono utilizzare file STL.
Pen StrepThermoFisher15070063
soluzione salina tamponata con fosfatoGibco10010031
tFUCCI(CA)5Addgene153521
TripsinaSigma-Aldrich9002-07-07
U2-OS Linea cellulareATCCHTB-96
siero

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  2. Kandušer, M., Miklavčič, D. Electroporation in biological cell and tissue: An overview. Electrotechnologies for extraction from food plants and biomaterials. Food Engineering Series. , Springer. New York. (2009).
  3. Cemazar, M., Sersa, G. Recent advances in electrochemotherapy. Bioelectricity. 1 (4), 204-213 (2019).
  4. Iyengar, S. K., Iyengar, S., Srivathsan, K. The promise of pulsed field ablation and the challenges ahead. Front Cardiovasc Med. 10, 1235317(2023).
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