Regolazione chemiogenetica nelle cellule precursori derivate da cellule staminali riprogrammate nel trattamento delle malattie neurodegenerative

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per l'ingegnerizzazione di cellule staminali riprogrammate chimicamente per ottenere una modulazione neuronale precisa differenziando queste cellule in cellule precursori dopaminergiche, trapiantandole in modelli murini della malattia di Parkinson e valutando i risultati comportamentali ed elettrofisiologici per confermare il successo dell'integrazione e l'efficacia funzionale delle cellule trapiantate.

Abstract

L'integrazione di recettori progettati attivati esclusivamente da farmaci progettati (DREADD) con terapie basate su cellule staminali presenta una strategia avanzata per una modulazione neuronale precisa. Qui, abbiamo utilizzato cellule staminali umane riprogrammate ingegnerizzate con CRISPR che esprimono recettori DREADD eccitatori (hM3Dq) o inibitori (hM4Di) per valutare l'integrazione funzionale e la modulazione dei precursori dopaminergici trapiantati in un modello murino di malattia di Parkinson (PD). I passaggi chiave includevano la generazione di linee di cellule staminali che esprimono DREADD senza fusione, la loro differenziazione in precursori dopaminergici del mesencefalo e il trapianto di queste cellule nello striato di topi con lesione da 6-idrossidopamina (6-OHDA). Abbiamo condotto valutazioni comportamentali e registrazioni elettrofisiologiche per analizzare gli effetti delle cellule trapiantate. I test comportamentali, come il test del cilindro, hanno dimostrato una modulazione significativa della funzione motoria dopo la somministrazione di clozapina-N-ossido (CNO). In particolare, l'attivazione di hM4Di ha ridotto il movimento controlaterale degli arti anteriori, mentre l'attivazione di hM3Dq è stata associata a un miglioramento del comportamento motorio. Le registrazioni elettrofisiologiche hanno rivelato risposte sinaptiche distinte. L'attivazione di hM4Di ha aumentato gli intervalli tra gli eventi e diminuito le ampiezze di picco delle correnti postsinaptiche eccitatorie spontanee (sEPSC), mentre l'attivazione di hM3Dq ha diminuito gli intervalli tra gli eventi e ha aumentato le ampiezze di picco, riflettendo un aumento della segnalazione eccitatoria. In sintesi, l'integrazione di valutazioni comportamentali ed elettrofisiologiche convalida l'esatta incorporazione funzionale di cellule staminali ingegnerizzate chimicamente riprogrammate nei circuiti neurali dell'ospite.

Introduction

I recettori progettati attivati esclusivamente da farmaci progettati (DREADD) sono recettori accoppiati a proteine G ingegnerizzate che possono essere attivati selettivamente da ligandi sintetici altrimenti inerti¹. L'approccio chemiogenetico è diventato uno strumento essenziale nelle neuroscienze, consentendo ai ricercatori di studiare la connettività dei circuiti neurali con elevata precisione e migliorando la nostra comprensione delle funzioni cellulari sia in vivo che in vitro attraverso l'attivazione selettiva o l'inibizione di specifiche regioni cerebrali o tipi di cellule ^2,3.

La terapia basata sulle cellule staminali rappresenta una strategia promettente per il trattamento delle malattie neurodegenerative. L'efficacia delle cellule del trapianto si basa sulla corretta integrazione, sopravvivenza e contributo funzionale ai tessuti ospiti. Un'attività cellulare incontrollata può portare a conseguenze negative, tra cui la tumorigenesi⁴; che richiede un controllo preciso di queste cellule dopo il trapianto. L'utilizzo della tecnologia DREADD nelle cellule staminali umane riprogrammate e nei neuroni derivati fornisce un mezzo per controllare con precisione l'attività neuronale attraverso la somministrazione del farmaco di progettazione CNO ^2,5. Nel contesto della malattia di Parkinson (PD), che è caratterizzata dalla perdita di neuroni dopaminergici, la manipolazione dell'attività dei neuroni dopaminergici derivati da cellule staminali è fondamentale per studiare i loro input sinaptici e i modelli di proiezione nei modelli di roditori 6,7,8,9,10. L'incorporazione di recettori eccitatori hM3Dq e inibitori hM4Di in questi modelli consente una modulazione precisa dell'attività neuronale^11,12.

La combinazione di valutazioni comportamentali animali e registrazioni elettrofisiologiche consente una valutazione completa degli effetti della modulazione chemiogenetica sulle cellule trapiantate in vivo¹³. Le valutazioni comportamentali, tra cui la rotazione indotta dall'apomorfina, il test del cilindro e il test della rotarod, valutano la coordinazione motoria e forniscono informazioni sui cambiamenti nella funzione motoria associati ai modelli sperimentali di PD¹⁴. Le tecniche elettrofisiologiche, come le registrazioni patch-clamp, consentono il monitoraggio in tempo reale delle risposte sinaptiche e dei potenziali d'azione, fornendo una visione completa del modo in cui le cellule trapiantate si integrano nelle reti neurali esistenti¹⁵. Combinando valutazioni comportamentali con valutazioni elettrofisiologiche, possiamo studiare come la modulazione chemiogenetica influenzi l'integrazione e la funzionalità di queste cellule all'interno dei circuiti neurali dell'ospite¹⁶. I risultati preliminari suggeriscono che la somministrazione di CNO modula efficacemente l'attività neuronale nelle cellule trapiantate, con conseguente miglioramento dei risultati funzionali nei modelli animali.

In questo protocollo, le cellule staminali umane riprogrammate sono state ingegnerizzate per esprimere i recettori hM3Dq o hM4Di utilizzando la tecnologia CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats). Dopo aver differenziato le cellule staminali riprogrammate modificate in cellule precursori dopaminergiche del mesencefalo, queste cellule sono state trapiantate in modelli murini di PD per valutare la loro integrazione e regolazione funzionale all'interno dei circuiti neurali dell'ospite utilizzando valutazioni comportamentali e registrazioni elettrofisiologiche.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida stabilite dall'Associazione di Pechino per la scienza degli animali da laboratorio e dal National Institutes of Health for the Care and Use of Laboratory Animals. Le cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) sono state ottenute da un donatore sano con consenso informato scritto, come descritto in uno studio precedente¹⁷.

1. Costruzione di linee cellulari basate su staminali DREADD non fuse

1. Costruisci il plasmide donatore DREADD.
   NOTA: I siti di digestione devono essere progettati secondo la sequenza vettoriale. I frammenti devono essere sintetizzati e amplificati con sovrapposizioni di 20-30 bp corrispondenti ai bracci del frammento per migliorare l'efficienza dell'assemblaggio.
   1. Progettare e sintetizzare il frammento T2A-ZsGreen (Frammento I).
   2. Amplificare il frammento hM3Dq/hM4Di-T2A dal plasmide originale utilizzando la PCR (Frammento II). Impostare la reazione PCR (50 μL di volume totale) in modo che contenga 1 tampone PCR, 200 μM di ciascuna miscela dNTP, 0,5 μM di primer diretti e inversi, 10-50 ng di DNA plasmidico e 1,25 U di DNA polimerasi ad alta fedeltà. Eseguire il termociclo nelle seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 98 °C per 2,75 minuti per denaturare completamente il modello; 32 cicli di amplificazione composti da 98 °C per 15 s (denaturazione), 60 °C per 30 s (ricottura di primer) e 72 °C per 60 s (estensione); allungamento finale a 72 °C per 7 min.
   3. Digerire il plasmide vettore con l'enzima appropriato per ottenere il vettore linearizzato. Purificare tutti i frammenti mediante elettroforesi su gel di agarosio e quantificarli utilizzando uno spettrofotometro.
      NOTA: Qui, il plasmide originale è stato digerito con MluI e SalI.
2. Mescolare delicatamente 50-100 ng del vettore linearizzato, del Frammento I e del Frammento II in un rapporto molare 1:3:3, insieme a 2x Cloning Mix. Incubare la miscela a 55 °C per 1 ora per facilitare la ricombinazione omologa attraverso il Gibson Assembly.
3. Inserire l'RNA guida che ha come bersaglio il sito AAVS1 nel sito BbsI del vettore pX458.
   NOTA: Eseguire la verifica della sequenza su tutti i plasmidi costruiti utilizzando il sequenziamento Sanger.
4. Mantenere le cellule staminali riprogrammate nel terreno, puntando a una densità cellulare di 2-5 × 10⁶ cellule/mL.
   NOTA: Le cellule staminali riprogrammate qui utilizzate sono state indotte da PBMC umane come descritto in uno studio precedente¹⁷. Il monitoraggio dello stato delle celle è essenziale, poiché lo stato delle cellule influisce in modo significativo sull'efficienza dell'elettroporazione. Vedere la tabella dei materiali per un confronto dei supporti.
5. Miscelare 2-5 × 10⁶ cellule, 2 μg di ciascun plasmide donatore (hM4Di-T2A-ZsGreen o hM3Dq-T2A-ZsGreen) e 2 μg di plasmide gRNA in 100 μL di tampone per elettroporazione e trasferire in una cuvetta per elettroporazione.
   NOTA: Assicurarsi che la miscela sia ben amalgamata e priva di bolle prima di procedere all'elettroporazione. Ottimizza i parametri di elettroporazione in base al tipo di cella per massimizzare l'efficienza della trasfezione, poiché dispositivi diversi possono richiedere regolazioni specifiche.
6. Impostare il Nucleofector sul programma B16 e avviare l'elettroporazione per facilitare la trasfezione efficiente delle iNSC target.
7. Aggiungere 1 mL di poli-D-lisina (PDL) da 50 μg/mL a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per almeno 2 ore. Rimuovere tutto il PDL dai pozzetti e aggiungere 1,5 mL di 5 μg/mL di laminina in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 2-4 ore. Utilizzare immediatamente la piastra rivestita o conservare a 2-8 °C per 1 settimana.
8. Trasferire le celle elettroporate in piastre a sei pozzetti rivestite con PDL e laminina. Distribuire circa 500.000 cellule per pozzetto in un volume di 2 mL di terreno di coltura per pozzetto.
9. Dopo 72 ore di elettroporazione, utilizzare un citometro a flusso per selezionare le cellule fluorescenti positive.
   1. Risospendere le cellule dissociate in DPBS e filtrarle attraverso un filtro cellulare da 70 μm.
   2. Configurare lo smistatore con il canale FITC per il rilevamento ZsGreen. Includere le iNSC non trattate come controlli negativi per definire la fluorescenza basale.
   3. Calibrare lo strumento utilizzando ugelli da 100 μm a una pressione della guaina di 20 psi. Implementare una modalità di ordinamento della purezza a quattro vie con conferma a cella singola.
10. Piastra singole cellule ZsGreen⁺ in piastre da 96 pozzetti prerivestite con PDL e laminina e aggiungi 200 μl di terreno di coltura per pozzetto per supportare la crescita iniziale. Conservare in terreno di coltura per 7-14 giorni
    NOTA: Monitorare quotidianamente i pozzetti per segni di crescita e fluorescenza che indichino un'integrazione riuscita ed etichettare i pozzetti positivi.
11. Isolare singoli cloni che presentano fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito dotato di un set di filtri GFP. Cloni dello schermo con ingrandimento 10x. Contrassegnare i pozzetti contenenti colonie monoclonali con segnale ZsGreen sostenuto e uniforme. Acquisisci immagini in campo chiaro e a fluorescenza per documentare la morfologia e l'intensità della fluorescenza.
    NOTA: Prima dell'imaging, sostituire il terreno fresco per ridurre la fluorescenza di fondo. Escludere le colonie con morfologia irregolare o autofluorescenza.
12. Espandi le celle positive su piastre rivestite a 48 pozzetti. Quindi diviso in due parti, una per la coltura e l'altra per la genotipizzazione.
13. Estrarre il DNA genomico da cloni candidati. Preparare le reazioni di PCR con due coppie di primer: una coppia per confermare l'inserimento del gene di interesse, l'altra per distinguere i cloni omozigoti ed eterozigoti. Eseguire il termociclo nelle seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 °C per 5 min; 38 cicli a 95 °C per 30 s, 60 °C per 30 s e 72 °C per 45 s; allungamento finale a 72 °C per 7 min. Risolvere i prodotti PCR su un gel di agarosio al 2%.
    NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i primer. Confermare l'inserimento del gene di interesse mediante una singola banda di 650 bp (primer 1). Identificare i cloni eterozigoti per la presenza di una singola banda di 630 bp e i cloni omozigoti per l'assenza di questa banda (primer 2).
14. Espandi le celle positive su piastre rivestite a sei pozzetti.
15. Digerire le cellule e lavarle in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) mediante centrifugazione a 250 × g per 3 minuti. Congelare le cellule in terreno di crioconservazione con il 10% di DMSO a una densità di 2,5 × 10⁶ cellule per fiala.

2. Trapiantate cellule precursori derivate da cellule staminali DREADD in topi modello PD

1. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di desipramina a una concentrazione di 5 mg/mL (10 mg/kg) a topi immunodeficienti 30 minuti prima dell'intervento chirurgico. Anestetizzare i topi con isoflurano al 2%.
2. Condurre iniezioni stereotassiche unilaterali di 3 μL di 6-idrossidopamina (6-OHDA, 5 μg/μL). Individua il corpo striato destro utilizzando le seguenti coordinate: anteroposteriore = 0,5 mm, laterale = 2,1 mm e verticale = -3,2 mm.
   NOTA: Il 6-OHDA deve essere sciolto in soluzione salina contenente lo 0,2% di acido ascorbico. Garantire un targeting preciso per ridurre al minimo la variabilità della gravità della lesione.
   ATTENZIONE: Il 6-OHDA è citotossico e produce specie reattive dell'ossigeno che inducono stress cellulare. Maneggiare con cura.
3. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di apomorfina (1 mg/kg, 0,5 mg/mL disciolto in soluzione fisiologica) per convalidare le lesioni 4 settimane dopo l'intervento. Selezionare topi lesionati che mostrano più di 100 rotazioni controlaterali entro un periodo di osservazione di 30 minuti per gli esperimenti successivi.
   NOTA: L'apomorfina è un agonista del recettore della dopamina, che attiva direttamente i recettori postsinaptici supersensibili nello striato denervato, sbilanciando l'attività bilaterale del circuito nigrostriatale. La rotazione indotta dall'apomorfina serve a valutare la gravità delle lesioni dopaminergiche unilaterali da 6-OHDA.
4. Cellule di semina e coltura in piastre rivestite a sei pozzetti (150.000 cellule per pozzetto). Incubare nel terreno di differenziazione di Fase 1 per 10 giorni, rinfrescando il terreno ogni 2 giorni. L'11° giorno, passare al terreno di differenziazione di Fase 2 e continuare l'incubazione fino al 13° giorno, cambiando il terreno ogni giorno.
   NOTA: Vedere la tabella dei materiali per un confronto del mezzo di differenziazione.
5. Raccogli le cellule nei giorni 10 e 13 di differenziazione, quindi mescolale con un rapporto di 1:7. Sospendere la miscela in un tampone di trapianto a una concentrazione di 100.000 cellule/μL.
   NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per un confronto del tampone di trapianto.
6. Somministrare un'iniezione stereotassica di un volume totale di 4 μl della sospensione cellulare preparata in un topo PD.
7. Eseguire il test del cilindro in vari momenti dopo il trapianto di cellule. Posizionare un bicchiere di vetro (diametro: 20 cm, altezza: 30 cm) su una superficie piana e non riflettente. Posiziona una telecamera dall'alto sopra il cilindro per catturare l'intero diametro.
   NOTA: Racchiudere il cilindro con tende nere per eliminare gli stimoli visivi esterni.
8. Posiziona ogni mouse al centro del cilindro e avvia la registrazione video simultanea (3 min/sessione). Dopo la sessione, rimetti il mouse nella sua gabbia di casa.
   NOTA: Acclimatare i topi alla sala prove per 30 minuti in condizioni di luce. Pulisci il cilindro con etanolo al 70% tra una prova e l'altra per eliminare i segnali olfattivi.
9. Valutare la capacità di movimento degli arti superiori dei topi per 3 minuti. Calcolare il numero di contatti con la parete effettuati dall'arto anteriore danneggiato rispetto al numero totale di contatti effettuati da entrambi gli arti anteriori.
10. Somministrare soluzione fisiologica o CNO alla dose di 1,2 mg/kg tramite iniezione intraperitoneale. Condurre il test del cilindro per valutare la modulazione comportamentale nel modello murino PD dopo la somministrazione di CNO
    NOTA: Attendere un periodo di recupero di circa 40 minuti prima di procedere con la valutazione.

3. Profilazione elettrofisiologica in vivo di cellule modulate chemiogeneticamente

1. Anestetizzare i topi mediante un'iniezione intraperitoneale di 250 mg/kg di pentobarbital. Estrarre il cervello e metterlo immediatamente nel liquido cerebrospinale artificiale a base di saccarosio ghiacciato (s-ACSF) per mantenere l'integrità cellulare. Usando un vibratomo, taglia il cervello in sezioni di 300-400 μm di spessore.
   NOTA: Lavora rapidamente per mantenere il cervello a basse temperature per preservare la funzione cellulare. Vedere la tabella dei materiali per l's-ACSF utilizzato nella preparazione di sezioni cerebrali fresche.
2. Trasferire i campioni in una camera riempita con ACSF bilanciata con il 95% di O₂ e il 5% di CO₂ a 34 °C, assicurandosi che questa temperatura sia mantenuta per tutta la durata dell'esperimento.
   NOTA: Vedere la tabella dei materiali per ACSF.
3. Caricare le pipette di vetro con soluzione intracellulare ghiacciata, con resistenza dell'elettrodo compresa tra 7 e 10 MΩ.
   NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per la soluzione intracellulare. Le pipette di vetro sono ricavate da capillari di vetro mediante un estrattore per micropipette¹⁸. Prima di iniziare gli esperimenti, verificare la presenza di eventuali perdite nelle pipette di vetro, assicurandosi che le punte siano sufficientemente affilate da penetrare nella membrana cellulare. Preparare rapidamente le pipette per ridurre al minimo le fluttuazioni di temperatura nella soluzione intracellulare.
4. Montare le fette in una camera di registrazione sommersa superfusa (2 mL/min) con ACSF ossigenato a 34 °C. Posizionamento di pipette mediante micromanipolatori motorizzati al microscopio a contrasto interferenzo-interferenza differenziale a infrarossi. Stabilire la configurazione dell'intera cellula applicando un'aspirazione delicata (resistenza > 1 GΩ) ai neuroni rattoppati all'interno delle regioni di innesto. Clamp celle a -70 mV utilizzando un amplificatore patch-clamp; acquisire sEPSC di base per 8 minuti a una frequenza di campionamento di 10 kHz (filtrata a 2 kHz) e monitorare continuamente la resistenza di accesso (target: <20 MΩ; scartare se >25 MΩ o fluttuante >10%).
   NOTA: Utilizzare una pressione appropriata quando si applica l'aspirazione per evitare spostamenti o rotture indesiderate delle cellule e regolare attentamente la posizione della pipetta per ottenere una buona tenuta. Se la qualità della sigillatura è scarsa, gettare la pipetta e riprovare.
5. Aggiungere 50 μM di CNO alla camera di registrazione subito dopo aver completato la misurazione di base e continuare a registrare i dati per altri 16 minuti osservando le variazioni di frequenza o ampiezza di sEPSC.
6. Eseguire una procedura di lavaggio sostituendo la soluzione di CNO con ACSF fresco per rimuovere efficacemente il CNO dalla camera di registrazione. Continuare a registrare i dati per il resto dell'esperimento per valutare l'eventuale recupero dell'attività sinaptica.

Results

La Figura 1 mostra le fasi chiave di questo approccio metodologico per cellule staminali umane riprogrammate ingegnerizzate che esprimono recettori DREADD eccitatori (hM3Dq) o inibitori (hM4Di) per valutare l'integrazione funzionale e la modulazione di precursori dopaminergici derivati in un modello murino di malattia di Parkinson (PD). La Figura 2 delinea la strategia di knock-in genico mediata da CRISPR/Cas9 per l'introduzione di costrutti non di fusione di hM...

Discussion

Questo protocollo ha utilizzato la tecnologia CRISPR per ingegnerizzare cellule staminali umane riprogrammate per esprimere recettori eccitatori hM3Dq e inibitori hM4Di. La modulazione dell'attività neuronale da parte di CNO è stata valutata attraverso il trapianto di cellule in modelli murini di malattia di Parkinson, accompagnata da valutazioni comportamentali e registrazioni elettrofisiologiche.

Il primo passo critico nella generazione di costrutti DREADD s...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Rapid Taq Master Mix	Vazyme	P222-01	utilizzato per l'analisi di genotipizzazione
2&volte; Mix di clonazione senza soluzione di continuità	Biomed Gene Tech.	CL117-01	utilizzato per la costruzione di plasmidi
6-OHDA	Sigma-Aldrich	H4381	utilizzato per stabilire il modello di topi PD
AAVS1-Pur-CAG-EGFP	Addgene	80945	utilizzato come controllo
AAVS1-Pur-CAG-hM4Di-mCherry	Addgene	80947	plasmide originale per la costruzione di hM4Di-T2A-ZsGreen
AAVS1-Pur-CAG-hM3Dq-mCherry	Addgene	80948	plasmide originale per la costruzione di hM3Dq-T2A-ZsGreen
AAVS1-CAG-hM4Di-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Plasmide donatore costruito basato su #80947
AAVS1-CAG-hM3Dq-T2A-ZsGreen	N/A	N/A	Plasmide da donatore costruito basato su #80948
Accutase	Invitrogen	A11105-01	Utilizzato per la digestione delle cellule
AMAXA Nucleofector	Lonza	AAD-1001S
Apomorphine	Sigma-Aldrich	A4393
Liquido cerebrospinale artificiale (ACSF)	N/A	N/A	125 mM di NaCl, 2,5 mM di KCl, 2 mM di CaCl2, 1,25 mM di NaH2PO4, 1 mM di MgSO4, 25 mM di glucosio e... 26 mM NaHCO3
Ascorbic	Integratore Sigma-Aldrich	1043003
B-27	Gibco	17504044
BDNF	Peprotech	450-02
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
CHIR99021	Yeasen	53003ES10
Clozapina-N-ossido	Enzo	BML-NS105
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Desipramina	Sigma-Aldrich	D3900
D-glucosio	Sigma-Aldrich	G5767
DMEM/F12	Gibco	11330-032
DMEM/F12	Gibco	11320-033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
FGF8	Peprotech	100-25
GDNF	Peprotech	450-10
GlutaMax	Gibco	35050-061
Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)	Gibco	14175095
Fattore inibitorio della leucemia umana (hrLIF)	Millipore	LIF1010
Liquido intracellulare ghiacciato	N/A	N/A	130 mM K-gluconato, 16 mM KCl, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 4 mM Na2-ATP, 0,4 mM Na3-GTP, 0,3% di neurobiotina
KnockOut Siero sostitutivo	Gibco	10828028
Laminin	Roche	11243217001
Estrattore per micropipette	Sutter Instrument Company	P-1000
N-2 Integratore	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888-022
Aminoacido non essenziale acidi (NEAA)	Gibco	11140-050
PBS	Gibco	10010023
pCLAMP 11 suite	di software Molecular Devices	N/A	Software di acquisizione e analisi dei dati per elettrofisiologia patch-clamp
Mezzo di differenziazione di fase 1	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% integratore di B-27, 1% integratore di N-2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 1 &; M SAG1 e 100 ng/mL FGF8
Mezzo di differenziazione di fase 2	N/A	N/A	96% DMEM/F12 (Gibco, 11320-033), 1% integratore di B-27, 1% integratore di N-2, 1% NEAA e 1% GlutaMax, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 ng/mL TGF-β III, 10 & micro; M DAPT, 0,2 mM di acido ascorbico e 0,5 mM di cAMP.
Bromidrato di poli-D-lisina (PDL)	Sigma-Aldrich	P7886
Primer per la genotipizzazione	N/A	N/A	Inserimento Avanti: TCTTCACTCGCTGGGTTCCCTT; Inversione di inserimento: CCTGTGGGAGGAAGAGAAGAGGT; Omozigosi Anteriore:CGTCTCCCTGGCTTTAGCCA; Omozigosi inversa: GATCCTCTCTGGCTCCATCG
pX458	Addgene	152199
SAG1	Enzo	ALX-270-426-M01
SB431542	Yeasen	53004ES50
liquido cerebrospinale artificiale a base di saccarosio (s-ACSF)			234 mM saccarosio, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 11 mM Dglucosio, 0,5 mM CaCl2 e 10 mM MgSO4
Coltura di cellule staminali media	N/A	N/A	48% DMEM/F12 (Gibco, 11330-032) e 48% Neurobasal, con l'aggiunta di 1% B27, 1% N2, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 10 ng/mL hrLIF, 2 µ M SB431542, e 3 µ M CHIR99021
TGF-β III	Peprotech	100-36E
Tampone per trapianto	N/A	N/A	Tampone HBSS con 5 g/L di D-glucosio, 100 ng/mL di BDNF, 100 ng/mL di GDNF e 0,2 mM di acido ascorbico
Vibratomo	Leica	VT1000 S
Patch-clamp a celle intere	Molecular Devices	MultiClamp700B