Articolo metodologico

Modello animale di infezioni associate all'impianto nei topi

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DOI:

10.3791/68041

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27 giugno 2025

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1Department of Orthopedics, Centre for Leading Medicine and Advanced Technologies of IHM, The First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive un modello murino che impiega l'impianto dorsale sottocutaneo per studiare le infezioni associate all'impianto, consentendo un'indagine completa dei meccanismi fisiopatologici e supportando lo sviluppo di criteri diagnostici con strategie terapeutiche mirate.

Abstract

Le infezioni associate all'impianto rappresentano una sfida clinica significativa, in quanto si verificano quando microrganismi patogeni si infiltrano nel sito degli impianti medici, come protesi articolari, cateteri o pacemaker. Queste infezioni possono portare a gravi complicanze, tra cui il fallimento dell'impianto, il ricovero prolungato e la necessità di ulteriori interventi chirurgici. Per indagare su questi problemi critici, i modelli murini forniscono una piattaforma inestimabile per lo studio delle infezioni associate agli impianti e la valutazione delle strategie terapeutiche contro i biofilm batterici, fornendo informazioni che possono in ultima analisi migliorare i risultati clinici per i pazienti affetti da impianti infetti. I materiali comunemente impiegati in questi studi includono titanio, polietilene e acciaio inossidabile, che imitano da vicino quelli utilizzati nella pratica clinica. Il disegno sperimentale prevede generalmente una procedura chirurgica per impiantare il dispositivo, che viene spesso eseguita per via sottocutanea per simulare infezioni articolari o cutanee. Dopo l'impianto, un ceppo batterico che forma biofilm, come lo Staphylococcus aureus o l'Escherichia coli, viene inoculato nel sito per avviare l'infezione, stabilendo così un modello che rispecchia la fisiopatologia delle infezioni umane. I ricercatori hanno valutato rigorosamente l'efficacia di vari regimi antibiotici contro le infezioni da biofilm consolidate, impiegando metodi di somministrazione sia sistemici che localizzati. Le indagini si sono concentrate su nuovi agenti antimicrobici, composti che alterano il biofilm e approcci terapeutici innovativi volti ad aumentare la risposta immunitaria dell'ospite. La valutazione dell'efficacia comprende la quantificazione delle cariche batteriche sull'impianto e sul tessuto circostante, oltre a valutare le riduzioni dello spessore e della densità del biofilm dopo il trattamento. La sintomatologia clinica, compresi i cambiamenti nel gonfiore e nel dolore, funge da ulteriore indicatore del successo terapeutico. Inoltre, la sopravvivenza globale e i tassi di morbilità tra i soggetti murini forniscono informazioni critiche sulla sicurezza e l'efficacia dei trattamenti valutati. È imperativo che tutti gli studi aderiscano a rigorose linee guida etiche e garantiscano le necessarie approvazioni istituzionali, garantendo che i risultati possano essere replicati in modo affidabile in diversi laboratori. Questo rigore metodologico è essenziale per convalidare i risultati e far progredire la nostra comprensione dei trattamenti efficaci per le infezioni associate all'impianto.

Introduzione

I modelli animali di infezioni associate all'impianto sono strumenti essenziali che collegano la ricerca di base e le applicazioni cliniche 1,2. Questi risultati forniscono un supporto pratico per la ricerca scientifica e facilitano lo sviluppo e il perfezionamento di nuovi approcci terapeutici e diagnostici, migliorando in ultima analisi i risultati dei pazienti e la qualità della vita 3,4,5,6. Questi modelli offrono una piattaforma per l'osservazione a lungo termine, che aiuta a comprendere i cambiamenti fisiopatologici associati alle infezioni associate all'impianto 7,8. Ad esempio, osservando gli effetti dell'infezione sui tessuti e sulle ossa circostanti, i ricercatori possono chiarire come le infezioni portino a danni tissutali, osteolisi e altre complicanze, guidando così i miglioramenti nelle strategie di trattamento clinico.

Gli studi su modelli animali di successo forniscono dati fondamentali per gli studi clinici e aiutano a ottimizzare le strategie terapeutiche 9,10. Attraverso questi esperimenti, i ricercatori possono determinare il dosaggio, la durata del trattamento e la via di somministrazione più efficaci, che possono informare la ricerca clinica11,12. Inoltre, i modelli animali consentono la valutazione dei limiti del trattamento, consentendo gli aggiustamenti necessari prima di passare agli studi sull'uomo. I modelli animali di infezioni associate all'impianto, note anche come infezioni associate al dispositivo, sono preziosi per studiare i meccanismi, i metodi di rilevamento e gli approcci terapeutici per queste infezioni13,14. Le infezioni da impianto si verificano spesso in campi come l'ortopedia e l'odontoiatria, dove dispositivi come le protesi articolari o le fissazioni delle fratture sono comunemente usati 15,16,17,18. A causa della presenza di impianti, le infezioni sono difficili da sradicare e spesso portano a infiammazioni croniche e danni ai tessuti, ostacolando potenzialmente il recupero del paziente e rendendo necessaria la rimozione dell'impianto per ulteriori trattamenti.

Lo scopo della creazione di modelli animali è quello di simulare l'insorgenza e la progressione delle infezioni associate all'impianto in condizioni controllate, consentendo l'esplorazione approfondita dei processi fisiopatologici, lo sviluppo di nuovi metodi diagnostici e la valutazione di potenziali strategie terapeutiche 19,20,21,22,23 . Un modello animale ideale dovrebbe imitare da vicino le caratteristiche patologiche e le risposte immunitarie osservate nelle infezioni umane, con una riproducibilità costante negli esperimenti 24,25,26. Gli animali comunemente usati includono ratti, topi e conigli, ogni modello è adattato a specifici obiettivi di ricerca, come la scelta del tipo di impianto, i ceppi batterici e i metodi di infezione. Con questi modelli, i ricercatori possono monitorare la diffusione dell'infezione, le risposte immunitarie e i comportamenti di colonizzazione dei patogeni, inclusa la formazione di biofilm sull'impianto 11,23,27. Inoltre, questi modelli sono fondamentali per testare l'efficacia delle terapie antimicrobiche, come antibiotici, rivestimenti antimicrobici e terapia fotodinamica, nel controllo dell'infezione 4,12,28. L'applicazione di nuovi metodi diagnostici e tecnologie di imaging all'interno di modelli animali migliora anche il potenziale per la diagnosi precoce e la gestione efficace delle infezioni associate all'impianto in contesti clinici.

L'obiettivo a lungo termine è quello di stabilire un modello animale che replichi accuratamente i microambienti fisici e fisiologici delle infezioni associate all'impianto nell'uomo. Sebbene questo sforzo comporti un'elevata complessità, costi sostanziali e sfide continue, lo sviluppo di un modello animale altamente realistico per le infezioni associate all'impianto fornisce una piattaforma di test critica in fase iniziale per agenti e strategie terapeutiche. In questo studio, sono stati costruiti un modello di infezione associata all'impianto di topo e un modello di infezione sottocutanea di topo. Confrontando gli indicatori pertinenti, è stato esplorato il grado di corrispondenza tra il modello animale e le infezioni cliniche periprotesiche.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sugli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto di salute e medicina, Hefei Comprehensive National Science Center (numero di approvazione: IHM-AP-2024-080). Tutti i topi utilizzati erano topi maschi C57BL/6J di grado specifico privo di patogeni (SPF), di età pari a 6 settimane, con peso corporeo di 20-30 g. Gli animali sono stati alloggiati in cinque topi per gabbia e hanno avuto libero accesso a cibo e acqua. L'ambiente è stato mantenuto a 22-26 °C con un'umidità relativa del 50-60% in un ciclo luce/buio di 12 ore (Luce: 7:00-19:00; Buio: 19:00-7:00). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione batterica per l'infezione sottocutanea da biofilm implantare

  1. Rimuovere un'ansa (10 μL) di coltura di Staphylococcus aureus (S. aureus, ATCC 43300) dalla provetta madre a -80 °C. Strisciare la sospensione su una piastra di agar sanguigno utilizzando la tecnica della piastra a strisce. Incubare a 37 °C per 24 ore in condizioni aerobiche senza agitare.
    NOTA: Sono consentiti metodi a piastre striate a tre o quattro settori, a condizione che i settori iniziale e terminale rimangano non confluenti. La striatura intersettoriale richiede l'uso di un nuovo circuito di inoculazione. Devono essere eseguite striature parallele ed equidistanti per facilitare la distribuzione microbica uniforme. Il rigoroso rispetto dei protocolli asettici è obbligatorio per prevenire la contaminazione incrociata.
  2. Esaminare la morfologia delle tipiche colonie di S. aureus e la presenza di chiare zone emolitiche.
    NOTA: La morfologia tipica della colonia include una pigmentazione giallo-dorata, una forma rotonda e una superficie liscia. Una zona chiara di almeno 2 mm di diametro è considerata positiva per β-emolisi.
  3. Eseguire la colorazione di Gram e l'analisi della spettrometria di massa microbica per confermare l'identità di S. aureus .
    NOTA: L'identificazione del ceppo deve essere condotta dagli investigatori utilizzando criteri di selezione stabiliti.
  4. Selezionare una colonia tipica indipendente (come descritto nel passaggio 1.2). Inoculare in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL contenente 5 mL di brodo di soia triptico sterile (TSB). Incubare a 37 °C per 12 ore agitando a 200 giri/min.
  5. Diluire la sospensione batterica dal passaggio 1.4 con TSB in rapporto 1:50. Incubare a 37 °C agitando a 200 giri/min.
  6. Monitorare e registrare la densità ottica (OD) a 600 nm utilizzando uno spettrofotometro per identificare la fase di crescita logaritmica.
  7. Stabilire una correlazione tra i valori OD600 e le unità formanti colonie per millilitro (CFU/mL) utilizzando il metodo della piastra di diffusione (fare riferimento ai passaggi 4.1.7-4.1.10).
    NOTA: In questo esperimento, l'OD600 ideale è 0,700-0,750, corrispondente a circa 4 × 105 CFU/mL. La determinazione della relazione tra OD600 e CFU/mL garantisce l'accuratezza sperimentale.
  8. Diluire 3 mL di sospensione batterica (dal passaggio 1.7, 4 × 105 CFU/mL) con 3 mL di soluzione salina sterile con tampone con fosfato (PBS) a freddo. Centrifugare a 3.000 × g per 10 minuti a 4 °C e risospendere il pellet. Concentrazione batterica finale: 2 × 105 CFU/mL.
    NOTA: Il rapporto 1:1 bilancia l'efficace diluizione delle impurità del terreno di coltura con il mantenimento dell'integrità cellulare e della stabilità osmotica. Garantisce un lavaggio efficiente riducendo al minimo i danni alle celle dovuti allo stress osmotico e favorisce la formazione uniforme di pellet cellulari durante la centrifugazione, che è fondamentale per il processo a valle.
  9. Ripetere il passaggio 1.8 in duplicato.
  10. Risospendere il pellet batterico in PBS per ulteriori esperimenti.

2. Preparazione del topo e dell'impianto

  1. Dividere casualmente 20 topi wild-type C57BL/6J in due gruppi (10 topi/gruppo): il gruppo di infezione associata all'impianto e il gruppo di ascesso sottocutaneo29.
    NOTA: Ogni gruppo deve essere alloggiato in due gabbie ventilate individualmente (IVC), con cinque topi per gabbia.
  2. Applicare i segni della coda su ciascun mouse per l'identificazione.
  3. Sterilizzare le piastre circolari in titanio (TA1, 1 cm di diametro, 0,5 mm di spessore) mediante sterilizzazione in autoclave a 121 °C, 0,1 MPa per 30 min.

3. Chirurgia animale

  1. Mettere i topi in una camera di induzione del gas isoflurano (2%) con anestetici gassosi animali generali per circa 5 minuti per indurre l'anestesia (seguendo protocolli approvati istituzionalmente).
  2. Monitorare la respirazione per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia.
    NOTA: La respirazione deve essere regolare e più lenta rispetto a quando si è svegli e non deve cambiare in risposta a stimoli nocivi, come procedure chirurgiche o pizzicamento delle dita dei piedi.
  3. Mantenere l'anestesia con il sistema di erogazione del cono nasale utilizzando l'inalazione continua di isoflurano al 2% e un flusso di ossigeno di 2 L/min (Figura 1A).
    NOTA: Eseguire tutte le procedure in anestesia per prevenire le difficoltà indotte dallo stress e garantire il rispetto delle normative sul benessere degli animali.
  4. Trasferire i topi anestetizzati nella zona di preparazione della cabina di biosicurezza.
    NOTA: Dividere la cabina di biosicurezza in tre scomparti: preparazione, disinfezione e zona operativa. Posizionare tappetini sterili monouso all'interno di ogni scomparto. Eseguire tutte le procedure all'interno dell'armadio per mantenere le condizioni asettiche.
  5. Radere i peli sulla schiena (3 cm × 4 cm di area) e applicare la crema depilatoria per circa 1 minuto.
  6. Disinfettare la pelle con una soluzione di iodio ed etanolo al 75% tre volte (Figura 1B).
  7. Praticare un'incisione di circa 1 cm nella regione dorsale utilizzando lame chirurgiche sterili. Inserire gli impianti sterili in titanio (preparati al punto 2.3) nella tasca sottocutanea (Figura 1D).
    NOTA: Sollevare la pelle distale dell'incisione utilizzando una pinza sterile per formare la tasca sottocutanea.
  8. Iniettare 100 μL di sospensione batterica di S. aureus (2 × 105 CFU/mL) direttamente sulla superficie in titanio utilizzando una siringa sterile da 1 mL (Figura 1E).
  9. Disinfettare la pelle con etanolo al 75% e applicare 3-0 punti di sutura non assorbibili per chiudere l'incisione (Figura 1F).
  10. Per il gruppo di ascessi sottocutanei, creare, disinfettare e suturare l'incisione direttamente senza inserire alcun impianto.
  11. Iniettare 100 μL di sospensione di S. aureus (2 × 105 CFU/mL) attraverso l'incisione utilizzando una siringa sterile da 1 mL.
    NOTA: L'iniezione continua a bassa velocità è stata mantenuta durante tutta la somministrazione per mitigare il rapido accumulo di liquidi e prevenire la fuoriuscita di sospensioni batteriche.
  12. Monitorare la funzione respiratoria fino alla ripresa della respirazione spontanea prima di trasferire gli animali in nuovi IVC.
  13. Somministrare meloxicam (0,02 ml/10 g/die) per via sottocutanea per tre giorni consecutivi per gestire il dolore post-operatorio.
  14. Assicurati che tutti i topi possano sopportare tutto il peso sugli arti, muoversi senza restrizioni e accedere liberamente a cibo e acqua.
    NOTA: Alloggiare tutti i topi trattati in nuovi IVC per prevenire la contaminazione incrociata con topi non trattati o vecchi IVC.

4. Osservazioni e valutazione postoperatoria

  1. Valutazione delle infezioni nel tessuto periferico
    1. Osservare quotidianamente le condizioni dell'incisione dorsale su ciascun topo e registrare le osservazioni nei giorni 1, 3, 5, 7, 10 e 14.
      NOTA: Monitorare la dislocazione dell'impianto; se rilevato, recuperare prontamente l'impianto per la successiva analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM).
    2. Eutanasia dei topi tramite asfissia da CO2 seguita da lussazione cervicale nei giorni 3, 7 e 14. Raccogliere le protesi e il tessuto periferico per ulteriori analisi (Figura 2).
    3. Radere i peli dorsali e disinfettare la pelle con iodoforo ed etanolo al 75% tre volte prima della raccolta dei tessuti.
      NOTA: La rasatura dei peli dorsali e la disinfezione della superficie della ferita riducono al minimo la contaminazione da batteri superficiali.
    4. Asportare la pelle, il tessuto sottocutaneo e il muscolo entro un margine di 0,5 cm attorno all'impianto o alla ferita utilizzando forbici chirurgiche sterili.
      NOTA: Raccogli campioni di tessuto senza restrizioni di dimensioni per massimizzare la resa. Pesare e omogeneizzare ogni campione con una massa uguale di PBS sterile per mantenere costanti le unità g/mL. Dividere ogni campione di tessuto longitudinalmente ed equamente in segmenti prossimali e distali per la quantificazione batterica (prossimale) e la valutazione istopatologica (distale).
    5. Posizionare il tessuto raccolto in provette sterili. Aggiungere una massa uguale di PBS sterile e tre perle di macinazione sterili in acciaio a ciascun tubo.
    6. Omogeneizzare i tessuti in tre cicli (70 Hz, 60 s di tempo di macinazione, 20 s di pausa), quindi vorticare per 5 min.
    7. Eseguire diluizioni seriali dell'omogenato (dal passaggio 4.1.6) con PBS da 101 a 105.
    8. Far cadere 15 μl di ciascun omogeneizzato diluito su aree designate delle piastre di agar sanguigno.
    9. Incubare le piastre a 37 °C senza agitare per 24 ore.
      NOTA: Dividere ogni piastra di agar sanguigno in sei settori uguali e applicare diluizioni seriali alle rispettive aree.
    10. Registra le colonie batteriche utilizzando una fotocamera digitale e contale manualmente.
  2. Osservazione di S. aureus sulle protesi
    1. Nei giorni 3, 7 e 14, prelevare le protesi utilizzando forbici e pinzette sterili.
    2. Immergere gli impianti in glutaraldeide al 2,5% a 4 °C per 48 ore per il fissaggio.
    3. Sciacquare tre volte gli impianti con PBS sterile, quindi disidratarli utilizzando soluzioni di etanolo (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) per 10 minuti ciascuna.
    4. Liofilizzare gli impianti in un liofilizzatore a -85 °C con pressione del vuoto mantenuta al di sotto di 20 Pa.
    5. Montare gli impianti su uno stadio campione utilizzando nastro conduttivo e rivestirli con uno strato d'oro da 10 nm.
    6. Osservare i campioni sotto SEM ad alto vuoto e 1,5 kV. Regolare l'ingrandimento ad almeno 2500×, se necessario.
  3. Analisi patologica del tessuto periferico
    1. Nei giorni 3, 7 e 14, raccogliere il tessuto periferico o gli organi principali utilizzando forbici sterili dopo aver disinfettato la pelle.
    2. Immergere il tessuto raccolto in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 48 ore per il fissaggio.
    3. Disidratare il tessuto immergendolo in soluzioni di etanolo graduato (50%, 70%, 80%, 90%, 100%) per 15 minuti ciascuna.
    4. Incorporare il tessuto disidratato nella paraffina e sezionarlo in fette da 4 μm utilizzando un microtomo.
    5. Colorare le sezioni con ematossilina ed eosina (H&E) o Giemsa utilizzando i protocolli standard30.
    6. Osservare le fette colorate utilizzando il sistema di analisi quantitativa delle cellule tissutali.

Risultati

Un modello di infezione sottocutanea associata all'impianto di topo è stato stabilito tramite la metodologia descritta in questo studio (Figura 1). Tutti i topi erano in buone condizioni entro 3 ore dall'operazione chirurgica, mentre la loro dieta, il sonno e l'attività sono tornati alla normalità lo stesso giorno.

Dopo l'intervento, abbiamo continuato a osservare le aree della ferita sul retro dei due gruppi e abbiamo scoperto che l'intervallo di ascessi sottocutanei nel gruppo di infezione associato all'impianto era maggiore di quello nel gruppo di ascessi sottocutanei fino alla fine dell'esperimento (Figura 3). Rispetto al gruppo con ascesso sottocutaneo, il gruppo con infezione associata all'impianto ha sviluppato una rottura il giorno 3, che si è verificata 4 giorni prima. Il giorno 10, entrambi i gruppi di topi hanno mostrato segni di recupero della ferita, con il gruppo con ascesso sottocutaneo che ha mostrato un recupero più pronunciato il giorno 14. Al contrario, la ferita non è ancora guarita nel gruppo di infezione associato all'impianto, in cui alcuni topi avevano perso fogli di titanio entro 14 giorni, indicando un grado più grave di infezione.

Per distinguere più visivamente la differenza nell'estensione dell'infezione tra i due gruppi, abbiamo raccolto il tessuto dal sito di infezione in ciascun topo. Le diluizioni di omogeneizzati tissutali del sito di infezione di entrambi i gruppi sono state analizzate per la carica batterica su piastre di agar sanguigno (Figura 4A). Sorprendentemente, la quantità di tessuto infetto nel gruppo di infezione associata all'impianto non ha avuto alcuna tendenza a diminuire nei giorni 7 e 14, mentre la quantità di batteri tissutali infetti nel gruppo con ascesso sottocutaneo è diminuita successivamente nei giorni 3, 7 e 14 (Figura 4B). Le osservazioni SEM dei fogli di titanio rimossi dai topi nel gruppo di infezione associato all'impianto hanno ulteriormente confermato i risultati di cui sopra, vale a dire che c'era un graduale aumento della conta batterica sui fogli di titanio nei topi per un periodo di 14 giorni (Figura 5). La colorazione di Giemsa ha anche rivelato che la conta batterica dei tessuti infetti nel gruppo con ascesso sottocutaneo era significativamente più bassa il giorno 7 rispetto a quella del giorno 3 e ulteriormente diminuita il giorno 14, durante il quale non c'era alcun segno di diminuzione della conta batterica nel gruppo di infezione associata all'impianto (Figura 6). Pertanto, il modello di infezione associata all'impianto ha mostrato un'infezione più grave e persistente rispetto al modello di ascesso sottocutaneo con una dose di infezione equivalente.

Ulteriori analisi dell'intensità dell'infiltrazione delle cellule infiammatorie nei tessuti infetti dei topi tramite colorazione H&E hanno rivelato che il gruppo con ascesso sottocutaneo ha mostrato un grado inferiore di infiltrazione cellulare infiammatoria il giorno 7 rispetto a quello del giorno 3 e una notevole diminuzione il giorno 14 (Figura 7). L'infiltrazione di cellule infiammatorie nel gruppo di infezione associato all'impianto ha continuato ad essere elevata per tutto il periodo di 14 giorni. Infine, l'analisi istopatologica degli organi principali nel gruppo di infezione associato all'impianto ha rivelato che tutti gli organi principali erano essenzialmente normali utilizzando il nostro metodo di modellazione e che non vi era alcuna manifestazione evidente di lesioni nell'esito rispetto ai topi normali (Figura 8). Questi risultati hanno suggerito che il nostro metodo di modellazione è altamente sicuro e affidabile ed è adatto per lo studio delle infezioni associate all'impianto.

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Figura 1: Protocollo del modello di infezione associato all'impianto. (A) L'anestesia è stata mantenuta utilizzando un sistema di anestesia per inalazione con erogazione nasale a cono; Riquadro: Anestesia di induzione tramite una camera di induzione a gas. (B) La preparazione della pelle è stata eseguita mediante rasatura e disinfezione del sito chirurgico. (C) È stata praticata un'incisione dorsale trasversale utilizzando una lama sterile. (D) Un impianto sterile in titanio è stato inserito per via sottocutanea attraverso l'incisione. (E) La sospensione batterica (2 × 105 CFU/mL) è stata applicata sulla superficie del titanio per indurre l'infezione. (F) Il sito di incisione è stato sterilizzato e suturato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Schema del raggruppamento sperimentale, della raccolta dei campioni e delle procedure di analisi. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

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Figura 3: Immagini rappresentative dei siti di incisione in entrambi i modelli nei giorni 1, 3, 5, 7, 10 e 14. Barra della scala: 1 cm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Analisi della carica batterica da tessuto periferico. (A) Immagini rappresentative di colonie batteriche da colture su piastra diffuse nei giorni 3, 7 e 14. Fila superiore: modello di ascesso sottocutaneo; Riga inferiore: Modello di infezione associata all'impianto. (B) Variazioni quantitative della carica batterica nel tempo in entrambi i gruppi. (C) Schema del metodo di diluizione seriale utilizzato per la quantificazione batterica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) della superficie dell'impianto in titanio nei giorni 3, 7 e 14. Le sfere gialle indicano S. aureus; Lo sfondo blu rappresenta la superficie in titanio. Barra della scala: 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Colorazione Giemsa del tessuto periferico nei giorni 3, 7 e 14 in entrambi i modelli. Le frecce rosse indicano le colonie batteriche. Barra della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) del tessuto periferico nei giorni 3, 7 e 14 in entrambi i modelli. Barra della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Colorazione H&E degli organi principali il giorno 14 nel modello di infezione associata all'impianto e nei topi di controllo sani. Barra della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Come per tutti i modelli animali, le divergenze immunologiche intrinseche tra le risposte murine e umane31 richiedono un'interpretazione cauta dei risultati relativi alla traduzione clinica. Il modello di infezione dell'impianto rappresenta una simulazione controllata che non riassume completamente la complessità degli scenari clinici. Inoltre, l'eterogeneità clinica dei biomateriali (ad esempio, la varianza della composizione) può modulare significativamente la patogenesi batterica, un parametro standardizzato in questo contesto sperimentale32.

Sebbene il modello murino offra vantaggi pratici per le indagini preliminari, i suoi limiti traslazionali devono essere riconosciuti. L'incorporazione di animali anziani (18 mesi) o geneticamente obesi ricapitolerebbe meglio le condizioni metaboliche e immunologiche dei pazienti più vulnerabili alle infezioni associate all'impianto33,34. Inoltre, i paradigmi di carico meccanico controllato potrebbero colmare il divario tra i modelli di impianto statici e l'ambiente articolare dinamico35.

L'attuale modello di infezioni sottocutanee associate all'impianto, pur dimostrando l'utilità nello studio della formazione precoce del biofilm, presenta diverse sfide tecniche che meritano di essere discusse. Per quanto riguarda la variabilità del tasso di infezione, lo spettro osservato dalla clearance spontanea alla disseminazione incontrollata riflette probabilmente l'eterogeneità delle risposte immunitarie dell'ospite. Per affrontare questo problema, il pretrattamento immunosoppressivo (ad esempio, desametasone o ciclofosfamide) potrebbe simulare meglio la caratteristica dell'immunità compromessa dei tipici pazienti con infezione associata all'impianto36, in particolare quelli con diabete o età avanzata. Inoltre, l'implementazione di condizioni ischemiche locali durante l'intervento chirurgico attraverso una breve occlusione vascolare può promuovere una colonizzazione batterica più consistente creando un microambiente ipossico transitorio favorevole all'aderenza microbica.

Le sfide tecniche nella visualizzazione del biofilm, in particolare la rottura di delicate matrici extracellulari durante l'elaborazione SEM convenzionale, richiedono perfezionamenti metodologici. L'adozione di tecniche di essiccazione dei punti critici rappresenta un'alternativa superiore alla liofilizzazione standard per la conservazione strutturale. Approcci complementari come la microscopia confocale con colorazione fluorescente con lectina consentono la caratterizzazione tridimensionale del biofilm senza gli artefatti introdotti dai protocolli di disidratazione37.

I vantaggi della valutazione dell'infezione associata all'impianto sono la semplicità della procedura, l'alto tasso di successo e l'ampia applicabilità. Comparativamente parlando, il metodo di infezione sottocutanea da MRSA costruito da Ching-Wen Tseng et al. è più semplice ma non applicabile ai modelli di infezione associati all'impianto38. I modelli murini di infezione dell'articolazione periprotesica costruiti da39 e il modello di infezione associata all'impianto spinale costruito da Benjamin V. Kelley et al. sono più vicini a situazioni cliniche reali40. Tuttavia, la procedura di inserimento dell'impianto richiede più pratica per un ricercatore alle prime armi. Questo metodo di modellazione è altamente sicuro e affidabile, consente un'indagine completa dei meccanismi fisiopatologici e supporta lo sviluppo di criteri diagnostici con strategie terapeutiche mirate.

Guardando al futuro, questo sistema modello offre interessanti opportunità per l'innovazione tecnologica. L'integrazione del tracciamento batterico bioluminescente (tramite ceppi lux-tagged) consentirebbe il monitoraggio longitudinale della progressione dell'infezione negli animali vivi41. La piattaforma è particolarmente adatta per la valutazione di nuove strategie antimicrobiche, compresi i rivestimenti implantari funzionalizzati con antibiotici. Approcci di manipolazione genetica, come il knockout mirato delle vie di segnalazione immunitaria (ad esempio, il deficit di MyD88), potrebbero fornire importanti informazioni sui determinanti dell'ospite della persistenza del biofilm. Questi progressi metodologici promettono di migliorare sia l'affidabilità dei modelli preclinici di infezione associati all'impianto sia il loro valore predittivo per la traduzione clinica.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (82102586 a Z.S., 82272512 a C.Z., 82472463 a C.Z.), del Programma di ricerca sanitaria provinciale di Anhui (AHWJ2024Aa20445 a Z.S., AHWJ2024Aa10144 a C.Z.), della Fondazione di scienze naturali della provincia di Anhui, del Distinguishing Youth Project (2108085J40 a C.Z.), il programma di ricerca e sviluppo chiave della provincia di Anhui-specializzazione in traduzione per la ricerca medica clinica (da 202304295107020020 a C.Z.), la China Postdoctoral Science Foundation (da 2020M671893 a Z.S.), i fondi per la ricerca di base per le università centrali della Cina (da WK9110000155 a Z.S., da YD9110002053 a C.Z.), il progetto di compilazione della ricerca scientifica provinciale di Anhui (da 2022AH051251 a Z.S., 2022AH010076 a C.Z.), e i fondi di ricerca del Centre for Leading Medicine and Advanced Technologies di IHM (2023IHM01070 a C.Z., 2023IHM01074 a C.Z.). Siamo anche grati per il supporto del Core Facility Center for Medical Sciences, il primo ospedale affiliato dell'USTC (Anhui Provincial Hospital). Questo lavoro è stato parzialmente svolto presso il Centro Strumenti per le Scienze Fisiche, Università di Scienza e Tecnologia della Cina. Siamo anche grati per il supporto del Laboratorio di Biosicurezza di Livello 2 della Core Facility, Institute of Health and Medicine, Hefei Comprehensive National Science Center.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di tetrossido di osmio all'1%Qualsiasi marca
Soluzione di glutaraldeide al 2,5%Qualsiasi marca
Soluzione di paraformaldeide al 4%Qualsiasi marca
75% etanoloQualsiasi marca
Sistema automatizzato di colorazione di GramBIOMERIEUXPrevi Color Gram
Armadio di biosicurezzaThermo Fisher Scientifico1500
Piastra di agar sanguignoSHIGOUYIKLCP002
Crema depilatoriaVeet
LiofilizzatoreEYELAFDU-2110
IsofluranoRingpuIsoflurano
Centrifuga a bassa temperatura e ad alta velocitàSCILOGEXCF1524R
Analisi della spettrometria di massa microbica BIOMERIEUXVITEK MS
Suture non assorbibili con aghiShanghai JinhuanF308
Sezionamento Paraffi  sistemaLeica
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)BiosharpBL302A
Microscopio elettronico a scansioneHITACHISU8010
Macchina per anestesia per piccoli animaliRWDR500
SpettrofotometroJINGHUA721
Tert-butanoloQualsiasi marca
Sistema panoramico di analisi quantitativa delle cellule tissutali TGTessutoGnosticaTISSUEFAXS PLUS
Omogeneizzatore tissutaleIKAT10 basic ULTRA-TURRAX
Brodo di soia triptico (TSB)Distretto di SolarbioLA0110
Incubatore oscillante verticale a porta singolaSakeziEsci-1020

Riferimenti

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