Trapianto ortotopico di arto anteriore di ratto

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per dimostrare la fattibilità microchirurgica del trapianto di arto anteriore di ratto. Questo modello può fungere da importante piattaforma traslazionale per la ricerca VCA.

Abstract

L'allotrapianto composito vascolarizzato (VCA) comporta il trapianto di più tipi di tessuto, tra cui pelle, muscoli, ossa e nervi, offrendo un'opzione ricostruttiva promettente per i pazienti con gravi lesioni traumatiche o deturpazioni. Nonostante il suo potenziale trasformativo, la VCA ha incontrato sfide significative come il rigetto del trapianto, le complicanze dell'immunosoppressione cronica e le complessità del recupero neuromuscolare.

Utilizziamo un modello di arto anteriore di ratto come piattaforma economica e anatomicamente rilevante per affrontare queste sfide. L'arto anteriore del ratto rispecchia da vicino l'anatomia dell'arto umano, migliorando l'impatto traslazionale dei nostri risultati. Studi precedenti hanno convalidato questo modello per misurare in modo affidabile e riproducibile il recupero funzionale, affermandolo così come uno strumento chiave per valutare la traiettoria di rigetto degli innesti degli arti anteriori.

Inoltre, il modello offre una preziosa opportunità per esplorare approcci terapeutici innovativi e fungere da buona piattaforma traslazionale per nuove tecniche di conservazione. Attraverso ulteriori indagini su questo modello, miriamo ad approfondire la nostra comprensione dei meccanismi alla base del rigetto del trapianto e del recupero neuromuscolare. In definitiva, questo lavoro si sforza di spianare la strada al miglioramento dei risultati clinici della VCA, affrontando sia i limiti attuali che le sfide future nella medicina dei trapianti.

Introduzione

L'allotrapianto in composito vascolarizzato (VCA) è una procedura che cambia la vita per ricostruire gravi difetti tissutali. VCA si riferisce al trapianto di un tessuto composito costituito da pelle, muscoli, ossa, tessuto connettivo, vasi sanguigni e nervi. Un ulteriore perfezionamento ed esplorazione delle tecniche VCA porterebbe grandi benefici ai pazienti che soffrono di lesioni traumatiche o deturpazioni¹. Tuttavia, la sua applicazione più ampia è messa alla prova da ostacoli continui come il rigetto del trapianto, le complicanze dell'immunosoppressione a lungo termine, il recupero neuromuscolare e la logistica peri-trapianto.

Il modello di arto anteriore di ratto è emerso come la scelta preferita per gli studi VCA grazie al suo rapporto costo-efficacia e alla sua stretta somiglianza con le caratteristiche anatomiche e neuromuscolari umane ^2,3. Il nostro lavoro precedente ha dimostrato che questo modello fornisce un mezzo affidabile e riproducibile per valutare il recupero funzionale comportamentale⁴. In questo studio, presentiamo una guida dettagliata e passo dopo passo alle tecniche microchirurgiche essenziali necessarie per questo modello.

Poiché la ricerca VCA continua ad evolversi, il modello degli arti anteriori di ratto consentirà l'indagine meccanicistica del processo di rigetto, della rigenerazione nervosa e del recupero funzionale neuromuscolare. I ricercatori potrebbero esplorare nuove tecniche di conservazione, valutare l'efficacia dei metodi di perfusione meccanica e testare terapie immunomodulatorie emergenti, che potrebbero aiutare a ridurre l'attuale dipendenza dall'immunosoppressione a lungo termine.

Protocollo

Le procedure chirurgiche sono state eseguite secondo i protocolli approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali (RA18M74) della Johns Hopkins University secondo le linee guida stabilite dal National Institutes of Health e dall'American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care.

1. Procedura di donazione (Figura 1)

1. Condurre l'induzione dell'anestesia tramite inalazione di isoflurano a una concentrazione del 5% e mantenerla all'1% per tutta la procedura. Avviare la procedura dopo aver confermato il livello di anestesia accurato tramite il pizzico della punta.
2. Praticare un'incisione circonferenziale a circa 1 cm sopra il gomito. Dividere la pelle ed esporre il tessuto sottocutaneo superficiale sottostante senza danneggiarlo (Figura 1A).
3. Sezionare il tessuto sottocutaneo/fascia, cauterizzare tutti i vasi superficiali e sezionare. Successivamente, verranno esposti il deltoide, parte del grande pettorale e il tricipite brachiale.
4. Sezionare senza mezzi termini sotto il muscolo grande pettorale, rivelando i vasi brachiali, nonché il nervo mediano e ulnare (Figura 1B).
5. Cauterizzare la vena superficiale sul muscolo deltoide e sezionare prossimalmente, quindi sezionare il muscolo deltoide perpendicolarmente all'orientamento della fibra muscolare. Successivamente, seziona e seziona il pettorale maggiore e minore, rivelando l'arteria ascellare, la vena e il nervo. (Figura 1C).
6. Sezionare il nervo mediano, ulnare e radiale alla loro estremità prossimale (subito dopo la divisione), preservando quanta più lunghezza possibile.
7. Sezionare e liberare l'arteria brachiale e la vena.
8. Sezionare il bicipite brachiale, il tricipite brachiale e il muscolo gran dorsale. Assicurarsi che l'omero sia adeguatamente esposto al termine della dissezione.
9. Usa una pinza rongeur per sezionare l'osso distalmente alla tuberosità deltoidea dell'omero.
10. Controllare delicatamente il lume dell'arteria brachiale e della vena (Figura 1C). Lavare l'innesto con 6 mL di soluzione salina eparinizzata.
11. Montare la cuffia in poliimmide rispettivamente sull'arteria brachiale e sulla vena (Figura 1D).
12. Avvolgere l'innesto con una garza di cotone bagnata e conservarlo a 4 °C.
13. Eutanasia del ratto donatore tramite un'overdose di anestetico inalante (isoflurano). Una volta che non risponde completamente a un pizzico di dito del piede, eseguire una toracotomia e asportare il cuore.

2. Procedura del destinatario (Figura 2)

1. Condurre l'induzione dell'anestesia tramite inalazione di isoflurano a una concentrazione del 5% e mantenerla all'1% per tutta la procedura. Confermare lo stato dell'anestesia tramite un pizzico di punta.
2. Praticare un'incisione circonferenziale a circa 1-2 cm sopra il gomito.
3. Sezionare i vasi sottocutanei e cauterizzare i vasi più grandi per esporre il deltoide, parte del grande pettorale e il muscolo tricipite brachiale.
4. Eseguire una dissezione smussata sotto il muscolo grande pettorale per rivelare i vasi brachiali, nonché il nervo mediano e ulnare.
5. Sezionare il deltoide e parte del muscolo pettorale maggiore e minore alla loro estremità distale, esponendo i vasi brachiali, i nervi mediano e ulnare (Figura 2A).
6. Sezionare e sezionare il nervo mediano e ulnare alla loro estremità distale. Legare tutti i rami vascolari (Figura 2B).
7. Sezionare il bicipite brachiale, il tricipite brachiale e il muscolo gran dorsale per esporre l'omero. Cauterizzare attentamente qualsiasi sanguinamento dai muscoli sezionati.
8. Sezionare l'omero alla tuberosità deltoidea. Usa la cera d'ossa per sigillare la cavità del midollo.
9. Utilizzare un'asta intramidollare per ricollegare la cavità del midollo osseo del donatore e del ricevente, quindi utilizzare cera ossea per sigillare la connessione. Sutura il muscolo tricipite brachiale con una sutura assorbibile 6-0, creando così una piattaforma per l'anastomosi dei vasi.
10. Eseguire la neurorrafia epiperineuriale con sutura 10-0 interrotta del nervo radiale.
11. Eseguire l'anastomosi vascolare utilizzando una tecnica di cuffia senza sutura (Figura 2C).
12. Eseguire la neurorrafia epiperineuriale con suture 10-0 interrotte per ricollegare i nervi mediano e ulnare (Figura 2D).
13. Ricollegare il muscolo deltoide e il muscolo grande pettorale utilizzando suture interrotte.
14. Chiudere la ferita con sutura 4-0 non assorbibile.
15. Somministrare soluzione fisiologica calda e sterile al 2% del peso corporeo per via sottocutanea al termine dell'intervento chirurgico.
16. Osservare l'animale per almeno 4 ore sotto una lampada riscaldante per il recupero. Riportalo alla struttura di stabulazione degli animali una volta che è allerta, può stare in piedi, dimostrare un movimento coordinato e ottenere autonomamente acqua e cibo.

3. Gestione post-trapianto a lungo termine

1. Monitorare gli animali ogni giorno per rilevare la presenza di segni di dolore e angoscia come definito di seguito.
   1. Verificare la presenza di anoressia indicata dall'assenza di feci nella gabbia.
   2. Controlla se l'animale non beve acqua, portando alla disidratazione evidenziata dalla tenda della pelle.
   3. Controlla se l'animale è curvo, non disposto a muoversi, favorisce un arto o sorveglia il sito di incisione.
   4. Controlla se l'animale non riesce a pulirsi, riflettendosi in un pelo arruffato o sporco.
   5. Controlla se l'animale lecca/graffia eccessivamente. Verificare la presenza di arrossamento e gonfiore nel sito dell'incisione e l'automutilazione.
   6. Controlla il comportamento aggressivo, soprattutto quando tenti di prendere in braccio l'animale.
   7. Controlla se l'animale ansima, ha una respirazione affannosa e ha secrezioni nasali/oculari bruno-rossastre.
   8. Verificare la presenza di sepsi.
2. Rimuovere i punti di sutura a 14 giorni dall'operazione.
3. Somministrare una seconda dose di buprenorfina SR (dose nel ratto: 1,0 mg/kg SC) il giorno 2 postoperatorio (POD2; 48 ore dopo la dose iniziale).
4. Inizia una valutazione funzionale settimanale nella settimana 4 dopo il trapianto.
   1. Brevemente, in anestesia generale, fissare l'arto anteriore dell'animale in abduzione a 90°. Posizionare due elettrodi ad ago a 1 mm di distanza l'uno dall'altro nell'ascella vicino all'inserimento del grande pettorale sull'omero.
   2. Stimolare il nervo mediano prossimale per via percutanea a 10 V per indurre una contrazione tetanica massima dei flessori.
   3. Una volta che la flessione digitale completa forma una presa, posiziona un anello di metallo collegato a un misuratore di forza sul palmo e fissalo all'interno delle dita flesse. Quindi, tirare il misuratore di forza fino a perdere la presa, registrando la forza massima (in Newton).

Risultati

La sopravvivenza dell'innesto può essere monitorata e determinata attraverso l'osservazione macroscopica. Nella Figura 3 sono mostrate immagini rappresentative sia del follow-up a breve termine (POD7) che di quello a lungo termine (POD120). L'innesto potrebbe riprendersi senza segni apparenti di necrosi. I dati di sopravvivenza sono mostrati nella Figura 4. Sia i campioni di pelle che quelli muscolari vengono raccolti all'endpoint designato. Le immagini istologi...

Discussione

Il trapianto ortotopico di arto anteriore nei ratti è un modello comunemente usato nel trapianto ricostruttivo sperimentale in quanto non solo contiene tessuti compositi vascolarizzati, ma consente anche la valutazione del recupero funzionale. Una tecnica di sutura convenzionale per l'anastomosi vascolare è molto complessa e richiede competenze microchirurgiche avanzate che richiedono anni di formazione microchirurgica. Per ridurre notevolmente i tempi e i costi, in questo modello modifi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10-0 Micro sutura non sterile	AROSurgical	TK-107038
4-0 Suture nere in nylon Sharpoint		A1667N
4-0 Suture conica Sharpoint Polysyn		G214N
Siringhe da 5 ml	MDC	2045
6-0 seta	Fisher Scientific	NC9742105
ABB-22 V Double Micro Vessel	Se T	00480
B-1 V Morsetto per microvaso singolo	S& T	00462
BD Quincke Suture per aghi spinali		405073
Castroviejo Micro Needle Holders	F.S.T	12061-02
Misuratore di forza Chatilon DFE II	Ametek	DFE II serie
Cotton tiped	JH Supply negozio	100252
Forbici fini - Carburo di tungsteno	F.S.T	14569-09
Pinze	S & T	FRS-15 RM-8
Spugne di garza	Fisher Scientific	22-362178
Emostatici Halsted-Mosquito	FST	13009-12
Eparina	JHH Farmacia	NDC 63323-540-05
Catetere IV Radiopaco 24 G	suture	SMTH5053
Gioiellieri Pinze coagulanti bipolari, acciaio inossidabile	ASSI	103000BPS03
Forbici a molla Vannas con manico rotondo	FST	15400-12
Speciale Pinza	S & T	FRAS-15 RM-8
Dilatatori per vasi - Strumenti bilanciati	F.S.T	18602-15