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Articolo metodologico

Cellule simili a isole derivate dal trapianto di cellule duttali nei ratti

463 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/68066

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1 agosto 2025

 , 
1Department of Physiology, Ankara Medipol University Faculty of Medicine

In questo articolo

Sommario

Le cellule simili a isole, derivate da cellule duttali, dimostrano un potenziale per il trattamento del diabete abbassando i livelli di glucosio nel sangue e aumentando la produzione di insulina nei ratti diabetici. Ciononostante, permangono sfide nel garantire una sufficiente funzione cellulare, difesa immunologica e sicurezza. Sono necessarie ulteriori indagini per migliorare la capacità terapeutica di queste sostanze.

Abstract

L'uso di cellule simili a isole derivate da cellule duttali è emerso come un potenziale approccio per il trattamento del diabete di tipo 1. I pazienti diabetici hanno una sintesi di insulina insufficiente nei loro corpi a causa della distruzione autoimmune delle cellule beta pancreatiche responsabili della produzione di insulina. In questo quadro, l'obiettivo del trapianto di cellule insulari è quello di ripristinare la capacità dei pazienti di produrre insulina. Tuttavia, ostacoli come l'acquisizione insufficiente di cellule insulari dal pancreas del donatore e le reazioni immunitarie ostacolano l'ampia applicazione di questo metodo terapeutico. In circostanze specifiche, le cellule duttali pancreatiche possiedono la capacità di trasformarsi in cellule che producono insulina. Queste cellule potrebbero essere coltivate in un ambiente controllato e convertite in cellule simili a isole che hanno la capacità di rilasciare insulina, rendendole adatte al trapianto. Questa strategia innovativa offre il potenziale per arrestare la progressione del diabete di tipo 1 e ridurre la dipendenza dalle iniezioni di insulina. In questo studio, cellule simili a isole derivate da cellule duttali sono state trapiantate nel fegato attraverso la vena porta del fegato in ratti diabetici indotti da streptozotocina. Dopo il trapianto, abbiamo notato riduzioni sostanziali dei livelli di glucosio nel sangue dei ratti a partire dal giorno 5, che sono continuate per 15 giorni. Inoltre, un test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (IPGTT) ha dimostrato che i ratti diabetici che hanno ricevuto i trapianti di cellule simili alle isole hanno prodotto significativamente più insulina rispetto al gruppo di controllo. Questi risultati suggeriscono che le cellule simili a isole derivate da cellule duttali possono essere un approccio terapeutico promettente per il diabete. Gli ostacoli principali in questo campo di studio includono il raggiungimento di una sufficiente capacità funzionale per le cellule, la loro protezione dal sistema immunitario e la garanzia della loro sicurezza per l'applicazione terapeutica. Gli studi futuri hanno il potenziale per produrre intuizioni cruciali per ottimizzare l'uso di queste cellule in contesti terapeutici, con particolare attenzione al miglioramento dell'efficacia e della sicurezza.

Introduzione

Il diabete di tipo 1 è una malattia autoimmune persistente caratterizzata dalla distruzione delle cellule beta del pancreas che producono insulina. I trattamenti attuali includono principalmente la terapia insulinica a lungo termine che, sebbene abbia successo nel controllare i livelli di glucosio nel sangue, non fornisce una cura per la condizione né ne arrestal'avanzamento. La ricerca di terapie alternative per il diabete di tipo 1 è motivata dalla necessità di alternative più efficaci rispetto all'attuale enfasi sul trattamento insulinico. La ricerca in corso è stata stimolata da ciò, concentrandosi su trattamenti alternativi come il trapianto di cellule insulari, che cerca di ripristinare la capacità intrinseca del corpo di produrre insulina. Tuttavia, il fatto che le cellule delle isole del donatore siano difficili da reperire e che ci sia la possibilità di rigetto immunologico ha reso difficile l'uso diffuso di questo trattamento. Di conseguenza, la comunità scientifica è diventata sempre più interessata alla ricerca di fonti alternative di cellule che producono insulina 1,2,3.

Questo metodo cerca di sfruttare il potenziale di rigenerazione di queste cellule per stabilire un apporto sostenibile di cellule secernenti insulina4. Indagini in vitro hanno dimostrato la capacità di queste cellule duttali di essere trasformate in cellule beta-simili funzionali in grado di secrezione di insulina in risposta alla stimolazione del glucosio5. Questa linea di indagine è particolarmente vitale, considerando i risultati sfavorevoli legati al trapianto di isole madri convenzionali a causa delle intricate risposte immunitarie coinvolte. Numerosi studi indicano che le cellule di derivazione duttale non solo hanno la capacità intrinseca di generare insulina, ma possono anche dimostrare caratteristiche che potrebbero promuovere la tolleranza immunitaria, mitigando così alcune sfide associate alle tecniche di trapianto tradizionali 5,6,7,8. Queste cellule possono essere coltivate al di fuori del corpo, convertite in cellule simili a isole in grado di rilasciare insulina e successivamente impiantate in individui con diabete. Le indagini precliniche, che comprendevano esperimenti con ratti diabetici indotti da streptozotocina, hanno dimostrato che il trapianto di queste cellule può ridurre efficacemente i livelli di glucosio nel sangue e aumentare la secrezione di insulina9.

Il nostro approccio si è concentrato sull'accelerazione del processo di differenziazione e sul miglioramento della funzionalità delle cellule produttrici di insulina aumentando il terreno di coltura cellulare standard con insulina-transferrina-selenio (ITS)10,11,12, isoxazolo 9 (ISX-9)13,14 e GLP-115. Questi fattori sono essenziali per facilitare la differenziazione pancreatica e migliorare la secrezione di insulina. L'integrazione di questi componenti mirava a ottenere cellule funzionali simili a isole in modo più efficiente, garantendo la loro capacità di produrre e rilasciare insulina in risposta alla stimolazione del glucosio 9,10,11,12,13,14.

Nel trapianto di isole, il rigetto immunitario costituisce un ostacolo significativo al raggiungimento di risultati positivi. Le isole trapiantate allogeniche sono vulnerabili all'attacco immunitario e richiedono terapie immunosoppressive per evitare il rigetto16,17. Il coinvolgimento delle cellule duttali pancreatiche nel rigetto immunitario durante il trapianto di isole mobili rappresenta un campo di studio in via di sviluppo. Si pensa che le cellule duttali possano avere proprietà che potrebbero ridurre il rigetto immunitario, il che renderebbe le isole trapiantate più propense a sopravvivere e funzionare correttamente. Ilieva et al. hanno dimostrato che le isole co-coltivate con cellule duttali mostravano una ridotta necrosi centrale e apoptosi, indicando un effetto protettivo contro il danno immuno-mediato. Questo effetto può essere mediato da fattori come il fattore di crescita insulino-simile 2 (IGF-2) secreto dalle cellule duttali, come notato da Marín-Cañas et al. (2019)18. L'effetto protettivo è essenziale, poiché il rigetto immunitario rappresenta una sfida considerevole per il successo del trapianto di isole, soprattutto nel diabete di tipo 1. Le cellule duttali negli innesti di isole sono state associate a un aumento della funzione e della sopravvivenza del trapianto, probabilmente attribuibile alla loro capacità di secernere fattori immunomodulatori che mitigano la risposta immunitaria19.

Nonostante i promettenti progressi, è necessario risolvere alcuni ostacoli per garantire l'efficacia operativa e la sicurezza di queste terapie cellulari per uso clinico. È essenziale verificare che le cellule indotte mostrino proprietà funzionali paragonabili alle cellule beta native e stabilire tecniche efficaci per proteggere queste cellule dagli attacchi del sistema immunitario per garantire la loro sopravvivenza e funzionalità prolungate20,21. Con il progredire di questo dominio di ricerca, la conoscenza completa e la risoluzione di questi ostacoli saranno essenziali per sfruttare la promessa delle cellule produttrici di insulina derivate da cellule duttali nel trattamento del diabete di tipo 1 22,23,24.

Questo studio mira a valutare l'efficienza in vivo di cellule insulari derivate da cellule duttali, sviluppate in condizioni ottimali, per il ripristino del controllo glicemico in un modello di ratto diabetico indotto da streptozotocina.

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Protocollo

Questo studio ha aderito alle raccomandazioni ARRIVE, garantendo che la progettazione, l'esecuzione e la rendicontazione della ricerca soddisfacessero elevati standard per il benessere degli animali e l'integrità sperimentale (https://arriveguidelines.org). L'Università Medipol di Ankara ha ottenuto l'approvazione del comitato etico (AMUHADYEK-12- 09.05.2025) e l'autorizzazione istituzionale. Tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le normative applicabili. Tutte le misure sono state emanate per ridurre al minimo la sofferenza degli animali e per impiegare il numero minimo di animali necessario per raggiungere gli obiettivi scientifici.

1. Preparazione delle soluzioni

  1. Soluzione enzimatica: Preparare una soluzione di collagenasi con 50 mg di Clostridium histolyticum collagenasi di tipo V in polvere. Preparare una soluzione da 50 mL combinando collagenasi con HBSS (contenente Ca-Mg) per ottenere una concentrazione di 1 mg/mL. Utilizzare 7 mL di soluzione per campione e mettere il resto in congelatore a -20 °C.
    NOTA: La concentrazione raccomandata di collagenasi è di 1 mg/1 mL. Prima di essere aspirata nelle siringhe, la collagenasi deve essere miscelata con la soluzione HBSS pre-preparata a una concentrazione di 1 mg/mL.
  2. Soluzione di lavaggio 1: prelevare 62,5 ml da 500 ml di HBSS senza rosso fenolo. Aggiungere 50 ml di FBS all'HBSS rimanente con molta attenzione. Aggiungere 5 ml di penicillina/streptomicina (P/S), 5 ml di L-glutammina (L-Gln) e 2,5 ml di 1 M HEPES. Portare il volume a 500 ml.
    NOTA: Con l'aggiunta di rosso fenolo, il volume finale è costituito da 88% HBSS, 10% FBS, 1% P/S e 1% l-Gln. Per prevenire la formazione di schiuma e garantire l'accuratezza, incorporare attentamente il siero fetale bovino passo dopo passo.
  3. Terreno di coltura per cellule e soluzione di lavaggio 2: prelevare 62,5 mL da 500 mL di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI w/L-Gln). Prestare attenzione per evitare che l'FBS formi schiuma durante l'aggiunta graduale di 50 ml all'RPMI rimanente. Aggiungere 2,5 ml di HEPES 1 M, 5 ml di P/S e 5 ml di L-Gln. Assicurarsi che il volume totale sia di 500 ml. Conservare a 4 °C.
  4. Soluzioni a gradiente di densità: Preparare le soluzioni di densità finale diluendo la soluzione di densità da 1100 mg/mL con la soluzione HBSS per ottenere un intervallo di densità intermedio di 1062-1096 mg/mL. Per garantire l'accuratezza, verificare con un densitometro la densità di ciascuna soluzione preparata. Utilizzare la soluzione di concentrazione 1077 come riferimento. Una volta ottenute le concentrazioni desiderate (1062-1096 mg/mL), trasferire le soluzioni in contenitori ermetici e conservare in un luogo buio a 4 °C per mantenerne la stabilità.
  5. Preparare una soluzione di blu di tripano allo 0,4%. Lo sviluppo cellulare è promosso dalla soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), che ha un pH di 7,4.
  6. Terreno di coltura cellulare: Combinare 43,4 ml di Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) e Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM-basso glucosio). Aggiungere il 10% di siero fetale di vitello (FCS), l'1% di insulina-transferrina-selenio (ITS), l'1% di L-glutammina (L-Gln), l'1% di penicillina-streptomicina (P/S) e 0,2 mL di 1 M HEPES. Portare il volume finale a 100 ml. Conservare a 4 °C.
  7. Terreno di differenziazione per colture cellulari: aggiungere 43,4 mL di RPMI con 43,4 mL di DMEM-basso glucosio. Aggiungere il 10% di FCS, l'1% di insulina-transferrina-selenio (ITS), l'1% di L-Gln, l'1% di P/S e 0,2 mL di 1 M HEPES nella miscela. Inoltre, aggiungere 1 μL di Isoxazolo 9 (ISX-9) diluito in 4 mL di etanolo al mezzo di differenziazione. Infine, aggiungere 24 μl di una soluzione di peptide 1 simile al glucagone (GLP-1) a una concentrazione di 50 nM nel terreno di coltura cellulare.
    NOTA: ISX-9 e GLP-1 vengono aggiunti solo durante i cambi di coltura; Sono pre-preparati. Per qualsiasi materiale culturale è necessaria una preparazione fresca.
  8. Soluzione di ditizone (DTZ): Sciogliere 100 mg di ditizone in 20 mL di dimetilsolfossido (DMSO) e mescolare bene. Aggiungere 30 ml di HBSS alla soluzione risultante e mescolare fino ad ottenere una miscela omogenea. Filtrare la soluzione con filtri da 0,2 o 0,4 μm. Aggiungere 50 mL di HBSS alla soluzione filtrata. Etichettare la soluzione con la data di preparazione. Una volta che i solidi sono completamente scomposti, far passare la soluzione attraverso un dispositivo di filtraggio da 0,4 μm. Mettere la soluzione filtrata in provette da 2 mL e utilizzarle subito, dopo che si sono scongelate. Conservare la soluzione preparata a -20 °C.
  9. Soluzione di Krebs: in un contenitore da 250 mL, aggiungere 1,68 g di cloruro di sodio (per 115 mM), 0,50 g di bicarbonato di sodio (per 24 mM), 0,09 g di cloruro di potassio (per renderlo 5 mM), 0,05 g di cloruro di magnesio (per 1 mM), 0,09 g di cloruro di calcio (per 2,5 mM) e 0,25 g di albumina sierica bovina (per lo 0,1%). Aggiungere 6,25 mL di 1 M HEPES. Regolare il volume a 250 ml aggiungendo acqua deionizzata e mescolare fino a quando tutto è amalgamato. Regolare il pH in un intervallo compreso tra 7,3 e 7,5, utilizzando 1 M di NaOH o 1 M di HCl. Filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm. Conservare le soluzioni a temperatura ambiente. In bagnomaria a 37 °C, aggiungere le soluzioni quando sono pronte per essere utilizzate.
  10. Soluzione ad alta concentrazione di glucosio: Misurare e aggiungere 149,1 mg di D-(+)-glucosio in una provetta. Aggiungere 50 mL di soluzione di Krebs alla provetta e mescolare accuratamente agitando. Filtrare attraverso un filtro da 0,22 μm.
  11. Soluzione a bassa concentrazione di glucosio: Combinare 1 mL di soluzione ad alta concentrazione di glucosio da 16,7 mM con 9 mL di soluzione di Krebs.

2. Isolamento del pancreas dai ratti

  1. Inizia con una coorte di tre ratti da laboratorio Wistar Albino (3 mesi/maschio) di peso compreso tra 220 g e 280 g. Anestetizzare gli animali utilizzando una combinazione di ketamina (35-50 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg). Controllare la profondità dell'anestesia in base alla mancanza della risposta di ritiro del pedale. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per evitare che si secchino.
  2. Iniziare il processo chirurgico con un'incisione addominale di 3-4 cm lungo la linea alba con le forbici. (Figura 1A). Eseguire una delicata manipolazione del fegato esercitando una leggera pressione fisica con le dita sulla gabbia toracica per sollevare il diaframma. Esteriorizzare il fegato e posizionarlo su una garza sterile per stabilità.
  3. Preparare una soluzione standardizzata di collagenasi alla dose di 28 mg/g di peso corporeo e aspirare 7 ml (circa 7 g) nella siringa per ratti di peso compreso tra 250 e 300 g. Modifica il volume della soluzione in base al peso corporeo di ciascun animale.
  4. Incidere il dotto pancreatico. Usando le forbici vascolari sottili, taglia il dotto vicino al fegato. Utilizzare posizioni anatomiche rispetto al pancreas e alla vascolarizzazione circostante per identificare il condotto. Usa segnali di posizione come i vasi sanguigni vicini e le caratteristiche dei tessuti per garantire la precisione. Fai un taglio perfetto in questo punto per l'occlusione.
    NOTA: L'incisione era minima, troppo piccola per essere misurata con precisione, ma sufficientemente larga da consentire l'inserimento del catetere. L'incisione consente un posizionamento fluido ed efficiente del catetere, garantendo un trauma minimo al tessuto circostante.
  5. Inserire un catetere con una racchetta integrata all'interno dell'apertura duttale generata (Figura 1B). Dopo il corretto posizionamento, fissare il catetere utilizzando una pinza chirurgica (ad es. micro pinze) per evitare lo spostamento.
  6. Somministrare la soluzione enzimatica di collagenasi per infusione controllata attraverso una depressione graduale e intenzionale dello stantuffo.
  7. Dopo il gonfiaggio, utilizzare strumenti chirurgici di precisione per separare accuratamente il tessuto pancreatico dalle strutture circostanti. Eseguire l'escissione rapidamente e con manovre precise e delicate per ridurre al minimo il danno tissutale. Immediatamente dopo la rimozione, posizionare il pancreas in una provetta da 50 ml su ghiaccio per fermare qualsiasi attività enzimatica.
  8. L'intero processo dovrebbe richiedere circa 60 secondi per un pancreas25. Inoltre, fino a quando tutto il pancreas non si è ingorgato, tenere la collagenasi e il pancreas rimosso sul ghiaccio.

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Figura 1: Processamento pancreatico. (A) Il clampaggio dell'apertura del dotto pancreatico nel duodeno e (B) il gonfiaggio della collagenasi di tipo 5 produce un'immagine del pancreas. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3 Isolamento di cellule duttali dal tessuto pancreatico

  1. Dopo l'estrazione chirurgica, incubare il pancreas in un bagno d'acqua a 37 °C per 12 minuti.
  2. Aggiungere 25 ml di soluzione di lavaggio 1 al tubo per neutralizzare l'attività della collagenasi. Agitare manualmente il tubo per favorire la rottura del tessuto pancreatico. Eseguire tutte le procedure successive in un campo sterile con flusso laminare.
  3. Mantieni tutti i media in ghiaccio. Centrifugare i campioni a 4 °C, a 100 x g per 1 min, e impostare il freno al massimo. Scartare il surnatante. Al pellet della cella, aggiungere 25 mL di soluzione di lavaggio 1 e risospendere la miscela.
  4. Eseguire nuovamente la centrifugazione e scartare il surnatante. Al pellet, aggiungere 25 mL di soluzione di lavaggio 1 e ririspendere. Filtrare il tessuto pancreatico lavorato attraverso una rete d'acciaio da 425 μm per eliminare eventuali frammenti di tessuto vascolare o non digerito residui.
  5. Dopo la filtrazione, portare il volume a 25 ml con la soluzione di lavaggio 1. Eseguire la centrifugazione 1 volta a 100 x g per 1 minuto a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
  6. Trasferire il pellet in una nuova provetta utilizzando una pipetta di plastica sterile dopo aver aggiunto 50 ml di terreno RPMI. Centrifugare nuovamente il campione a 100 x g per 1 minuto a 4 °C. Scartare il surnatante e conservare il pellet per ulteriori analisi.
    NOTA: Tutte le fasi rimanenti sono state eseguite all'interno di cappe a flusso laminare in condizioni sterili adatte per esperimenti di coltura cellulare.
  7. Aggiungere 10 mL di soluzione di densità 1.077 al pellet acquisito dopo l'ultimo, seguito da una leggera disgregazione e omogeneizzazione del pellet picchiettando il bordo della provetta con un dito.
    NOTA: L'intervallo di densità per isolare le cellule insulari dal tessuto pancreatico circostante è di circa 1,077, in contrasto con la densità del mezzo, che è di circa 1,00126. Di conseguenza, abbiamo impiegato la soluzione di densità 1.077 per questo obiettivo.
  8. Aggiungere 10 mL di RPMI e centrifugare a 600 x g per 12 minuti a 4 °C con i freni spenti. Questa procedura ha stabilito una divisione basata sulla densità all'interno delle provette, con conseguente accumulo di cellule insulari in uno strato proprio sotto lo strato RPMI, posizionato direttamente sotto lo strato RPMI.
  9. Rimuovere entrambe le cellule insulari e l'RPMI è stato eliminato. L'obiettivo di questa fase era quello di purificare le cellule insulari per migliorare la loro rimozione dai tessuti pancreatici, ottenendo un processo di isolamento delle cellule duttali più puro.
  10. Rimuovere il tessuto pancreatico in eccesso in una nuova provetta da 50 ml utilizzando una pipetta. Aggiungere 10 mL di soluzione a densità 1,096 al pellet di tessuto.
  11. Quindi, aggiungere lentamente 10 mL di gradiente di soluzione a densità 1,062 con una siringa. Prestare attenzione a mantenere una distribuzione omogenea dei componenti. Crea una sfumatura impilando le soluzioni in ordine dalla più densa alla meno densa.
  12. Aggiungere 10 ml di RPMI in cima. Provette da centrifuga a 600 x g per 12 min a 4 °C senza freni. Dopo la rotazione, si osservano diversi strati di densità. Le cellule duttali si trovano nello strato intermedio, al di sotto dello strato RPMI.
  13. Rimuovere con cautela le cellule duttali utilizzando una pipetta Pasteur usa e getta e metterle in una provetta separata da 50 ml. Aggiungere 25 ml di soluzione di lavaggio 2 e mescolare delicatamente la sospensione picchiettando il tubo con un dito.
  14. Centrifugare il tubo a 100 x g per 1 minuto ed eliminare il surnatante. Eseguire altri due cicli di centrifugazione con il pellet. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 2 ml di soluzione di lavaggio 2 al pellet27.

4. Isolamento e coltura di cellule duttali

  1. Inoculare le cellule raccolte in un pallone T25 e aggiungere 5 ml di liquidi di coltura cellulare preriscaldati. Mantenere l'incubatrice al 5% di CO2e 37 °C.
    NOTA: Mantenere stabili le temperature fisiologiche è importante per il funzionamento della coltura cellulare, quindi tutte le soluzioni sono state riscaldate a circa 37 °C prima di essere utilizzate.
  2. Dopo 24 ore, aspirare con cura il terreno. Sciacquare due volte le celle con la soluzione di lavaggio 2. Aggiungere un terreno di coltura cellulare fresco e rimettere il pallone nell'incubatore. Quelle cellule che aderivano alla superficie del pallone erano chiamate cellule duttali.
  3. Sostituire il terreno di coltura ogni 3 giorni. Se il colore del terreno cambia molto rapidamente, significa che sta perdendo sostanze nutritive e sta diventando più acido, il che indica che il terreno dovrebbe essere cambiato più frequentemente.
  4. Passa le celle una volta che le celle nei palloni raggiungono l'80% di confluenza. Lavare con 1-2 ml di PBS 2x ed eliminare eventuali terreni in eccesso.
  5. Aggiungere 2 mL di soluzione di dissociazione enzimatica (senza rosso fenolo) per avviare il processo di degradazione enzimatica e separare le cellule dalla superficie del pallone.
  6. Incubare per 2-3 minuti e valutare il distacco delle cellule al microscopio 10x. Se le cellule rimangono parzialmente attaccate, incubare nuovamente a 37 °C per altri 2 minuti.
  7. Dopo che le cellule sono state completamente staccate dalla superficie del pallone, interrompere la digestione enzimatica aggiungendo circa 8 mL di terreno di crescita cellulare, che è 4 volte il volume della soluzione di dissociazione enzimatica. Picchiettare delicatamente le pareti del pallone.
    NOTA: Il picchiettamento, che può aiutare le cellule a separarsi, riduce il tempo di incubazione complessivo e impedisce agli enzimi di danneggiare la membrana cellulare, assicurando che ciò avvenga dopo un contatto a lungo termine con la soluzione di dissociazione enzimatica.
  8. Dopo aver aggiunto i terreni di coltura cellulare, trasferire la sospensione cellulare in provette da 15 mL e centrifugare a 150 x g per 10 minuti a 25 °C con un'impostazione di decelerazione lieve (velocità 9 break) per pellettare le cellule.
  9. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 6-8 mL di soluzione di lavaggio 2. Ripetere la centrifugazione come sopra. Scartare il surnatante. La procedura è stata ripetuta per garantire la completa eliminazione della soluzione di dissociazione enzimatica.
  10. Utilizzando un pipettaggio delicato, risospendere il pellet in 5 mL di terreno di coltura cellulare fresco per ottenere una sospensione cellulare uniforme. A questo punto, eseguire il conteggio delle cellule.
  11. Miscelare 10 μl della sospensione cellulare con 10 μl di blu di tripano e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
  12. Seminare 1 × 106 celle per matraccio T25 utilizzando la sospensione contata.
    NOTA: A questo punto, la maggior parte delle cellule era stata identificata come cellule duttali. Un buon numero di cellule è stato seminato in ogni piatto in base al conteggio delle cellule che è stato fatto. Sulla base di ciò che abbiamo visto negli esperimenti, le cellule sono state distribuite in due diversi flaconi T25 una volta raggiunto il miglior livello di confluenza in un pallone. Questo è stato fatto per mantenere alta l'efficienza della proliferazione. Siamo stati in grado di separare con successo le cellule duttali dal tessuto del pancreas di ratto utilizzando questo metodo. Dopo essere state separate con successo, le cellule sono state preparate per ulteriori esperimenti secondo il piano di studio.
  13. Continuare la coltura fino al passaggio 4. Passaggio delle cellule quando necessario per mantenere le condizioni di crescita ottimali.
    NOTA: Dal passaggio 4 in poi, c'è stato un notevole aumento del numero di celle tra il giorno 3 e il giorno 9. Poiché le cellule tendono ad essere meno in grado di dividersi dopo più cicli, questo metodo ha fatto in modo che ci fossero abbastanza cellule vitali. Una volta che le cellule duttali sono cresciute abbastanza, hanno iniziato a trasformarsi in cellule simili a isole. Sulla base di ciò che abbiamo scoperto, le cellule tra gli stadi 3 e 6 hanno i tassi di proliferazione più rapidi. Il passaggio 4 mostra un aumento particolarmente evidente del numero di cellule duttali. Tuttavia, dopo il passaggio 6, c'è stato un declino della capacità proliferativa. Il protocollo è stato ottimizzato sulla base di questi risultati per ottenere il giusto numero di cellule mantenendo la loro vitalità e utilità28.

5. Differenziazione di cellule duttali in ammassi simili a isole

  1. Passaggio di raccolta di 4 cellule duttali utilizzando la procedura di passaggio standard. Lavare due volte con 1-2 ml di PBS per rimuovere il terreno residuo e le cellule non attaccate.
  2. Aggiungere 2 mL di soluzione di dissociazione enzimatica (senza rosso fenolo) al pallone. Incubare a 37 °C per 2-3 minuti e monitorare al microscopio 10x.
  3. Se le cellule rimangono attaccate, incubare per altri 2 minuti. Arrestare la reazione enzimatica aggiungendo 8 mL di terreno di coltura cellulare.
  4. Trasferire la sospensione in una provetta da 15 mL e centrifugare a 150 × g per 10 minuti a 25 °C, impostando 9 per accelerare e rallentare.
  5. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 6-8 mL di soluzione di lavaggio 2. Centrifugare ed eliminare il surnatante.
  6. Risospendere il pellet finale in 5 mL di terreno fresco. Contare le celle come descritto in precedenza.
  7. Seminare 1 × 105 celle per pozzetto in una piastra a sei pozzetti, aggiungendo 3 mL di terreno per pozzetto. Incubare a 37 °C, 5% CO2.
  8. Sostituire il mezzo ogni 3 giorni durante i primi 7 giorni. Regolare la frequenza se il colore del mezzo cambia rapidamente.
  9. Passare gradualmente al mezzo di differenziazione dopo 7 giorni. Continuare la coltura per un totale di 15 giorni (7 giorni di crescita + 8 giorni di differenziazione). Cambiare il mezzo ogni 2 giorni durante la differenziazione.
  10. Il giorno 8, inizia la fase di differenziazione. Dopo 4 giorni, lavare le celle due volte con PBS e aggiungere 500 μL di soluzione di dissociazione enzimatica.
  11. Incubare 2-3 minuti, interrompendo la reazione aggiungendo 2 ml di terreno di coltura. Centrifugare a 150 x g per 10 min a 25 °C. Risospendere e riseminare 1 x 105 cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti.
  12. Il 15° giorno, eseguire un'analisi microscopica completa per caratterizzare e confermare chiaramente la formazione di aggregati cellulari simili a isole24.

6. Quantificazione della concentrazione di zinco in cellule duttali differenziate mediante Ditizone

  1. Scongelare ed equilibrare la soluzione DTZ da una conservazione a -20 °C. Aggiungere 3-4 gocce di soluzione DTZ a ciascun pozzetto delle celle differenziate di 15 giorni. Osservare al microscopio. Identificare le cellule produttrici di insulina mediante colorazione rossa28 (Figura 2).

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Figura 2: Immagini al microscopio di cellule duttali simili a isole. Immagini al giorno (A) 11 della cultura (20x), (B) giorno 13 della cultura (20x), (C, D) giorno 15 della cultura (20x). Le cellule sono state visualizzate dopo la colorazione con ditizone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Test per la stimolazione del glucosio

  1. Seminare 1 x 104 grappoli simili a isolotti per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti con 1 mL di terreno di differenziazione per pozzetto.
  2. Il giorno 15, stimola le cellule con il glucosio. Rimuovere il terreno esistente e aggiungere 1 mL di soluzione a basso contenuto di glucosio (1,67 mM). Incubare 1 ora a 37 °C.
  3. Raccogliere il terreno e trasferirlo in provette da 2 mL. Aggiungere 1 mL di soluzione ad alto contenuto di glucosio (16,7 mM). Incubare 1 ora. Raccogliere il terreno per l'analisi. Raccogliere il terreno di coltura cellulare ogni intervallo di 1 ora tra l'aggiunta di diverse soluzioni di glucosio.
  4. Eseguire l'insulina ELISA seguendo le istruzioni del produttore. Una volta rimossa dalla busta di alluminio, lasciare che la micropiastra si equilibri a temperatura ambiente prima di iniziare la procedura ELISA.
  5. Aggiungere 10 μl di reagente ai pozzetti del campione, del controllo e dello standard. Aggiungere 75 μl di soluzione coniugata di lavoro. Sela la piastra e incubare per 2 ore a temperatura ambiente agitando (700-900 giri/min).
  6. Lavare i pozzetti 6 volte con 350 μL di tampone di lavaggio. Aggiungere 100 μL di substrato di 3,3′,5,5,5,5-Tetrametilbenzidina (TMB) per pozzetto. Sigillare le piastre e incubare 15 minuti al buio agitando (700-900 giri/min) a temperatura ambiente.
  7. Aggiungere 100 μl di soluzione di arresto per pozzetto e mescolare agitando delicatamente la piastra per arrestare il processo. Rimuovere le bolle e leggere l'assorbanza a 450 nm. Misurare per 30 minuti dopo l'aggiunta della soluzione di arresto27.

8. Trapianto di isole e cellule duttali simili a isole

  1. Anestetizzare i ratti usando ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Sanificare e drappeggiare il sito chirurgico. Praticare un'incisione della linea mediana di 2-3 cm.
  2. Spostare l'intestino ed esporre la vena porta usando i divaricatori. Eseguire la venotomia e inserire un catetere preriempito di soluzione fisiologica (Figura 3A).
  3. Infondere 100-500 μL di sospensione cellulare nella vena porta. Rimuovere il catetere e chiudere la venotomia con punti di sutura o adesivo. Chiudere l'addome e monitorare il recupero, fornendo analgesia secondo necessità (Figura 3B).

figure-protocol-3
Figura 3: Trapianto di isole e cellule simili a isole. (A) Intracatetere endovenose sterili utilizzate per trapiantare isole e cellule simili a isole. (B) Trapianto di isole e cellule simili a isole, in una siringa sterile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

9. Ratti diabetici indotti da streptozotocina (STZ)

  1. Ratti veloci 12 h. Somministrare 45 mg/kg di STZ per via intraperitoneale, disciolto in tampone citrato freddo (pH 4,5).
    NOTA: Il digiuno per 12 ore prima dell'iniezione di STZ migliora l'espressione di GLUT2, che facilita il trasporto del glucosio nelle cellule beta pancreatiche. Questo processo aumenta l'assorbimento di STZ nelle cellule, con conseguente maggiore danno alle cellule beta. Questo meccanismo facilita la progressione di iperglicemie più significative e migliora l'efficacia del modello di diabete.
  2. Confermare il diabete 48-72 ore dopo l'iniezione con glicemia >250 mg/dL. Classificare i ratti che di solito raggiungevano valori di glucosio nel sangue superiori a 250 mg/dL come diabetici e incorporarli nell'esperimento29.

10. Preparazione di isole e cellule simili a isole per il trapianto

  1. Raccogliere le cellule dopo il trattamento con la soluzione di dissociazione enzimatica per 1 minuto. Raschiare le celle che aderiscono alla superficie. Sostituire con terreno fresco e raccogliere le cellule.
  2. Centrifugare a 300 x g per 5 min. Risospendere il pellet in 100-150 μL di soluzione fisiologica. Eseguire il conteggio delle cellule e regolare il conteggio delle cellule a 1000 IEQ o 800 isole per ratto o 1 x 105 cellule simili a isole per ratto.

11. Trapianto di vena porta

  1. Anestetizzare gli animali mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
  2. Igienizzare la regione addominale dell'animale con una soluzione sterile (betadina o etanolo al 70%). Avvolgere l'area chirurgica con un telo sterile.
  3. Praticare un'incisione sulla linea mediana, lunga circa 2-3 cm, per accedere alla cavità addominale.
  4. Sposta l'intestino per rivelare il fegato. Fissare i lobi sinistro e destro del fegato con divaricatori sterili. Esporre la superficie ventrale del fegato per localizzare la vena porta.
  5. Pre-sciacquare il catetere in polietilene (PE-10 o PE-50) con soluzione salina e riempirlo completamente. Utilizzare una pinza microchirurgica per tenere un ramo della vena porta, in genere il ramo laterale sinistro o destro.
  6. Eseguire una venotomia minore (circa 1-2 mm). Inserire con cautela il catetere nel sito della venotomia. Per evitare lo spostamento, utilizzare materiale di sutura o pinze per ancorare il catetere, in genere utilizzando un filo di sutura 6-0.
  7. Verificare il posizionamento accurato del catetere somministrando gradualmente soluzioni saline sterili. Il catetere ha erogato gradualmente la cellula insulare preparata e la sospensione di cellule simili a isole nella vena porta. Il volume totale è di 100-500 μl.
  8. Al termine dell'infusione, rimuovere il catetere e utilizzare adesivo in tessuto sterile o suture riassorbibili per sigillare il sito della venotomia.
  9. Eseguire la gestione dell'emorragia. Riposizionare tutti i tessuti che circondano il fegato e suturare i muscoli addominali utilizzando un filo riassorbibile. Fissare la pelle con punti di sutura o clip.
  10. Tenere l'animale sotto sorveglianza in un ambiente caldo. Fornire analgesici adeguati per la gestione del dolore durante l'emergenza dall'anestesia (ad es. buprenorfina 0,1 mg/kg). Osservare gli animali per 48 ore. Esaminare per indicazioni di infezione, edema nel sito chirurgico o emorragia30.

12. Monitoraggio della glicemia

  1. Valutare i livelli iniziali di glucosio nel sangue. Tieni con cura il topo e usa una lancetta per creare un piccolo taglio sulla punta della coda. Rimuovere delicatamente la goccia iniziale di sangue utilizzando un batuffolo di cotone sterile.
  2. Applicare la seconda goccia di sangue sulla striscia reattiva del glucosio e documentare il livello di glucosio basale31.

13. Test di tolleranza al glucosio intraperitoneale

NOTA: I ratti vengono sottoposti al test di tolleranza al glucosio intraperitoneale (IPGTT) per valutare l'efficienza di eliminazione del glucosio nel sangue. Questo test offre informazioni sul metabolismo del glucosio, sulla sensibilità all'insulina e sulle possibili condizioni diabetiche. Il test di tolleranza al glucosio intraperitoneale è stato eseguito il giorno 15 dopo il trapianto. Il razionale principale per l'attuazione di una durata di digiuno designata prima dell'IPGTT è stabilizzare i livelli basali di glucosio e garantire uno stato metabolico costante. Il periodo di digiuno facilita l'esaurimento delle riserve di glicogeno epatico, consentendo una valutazione più affidabile della risposta alla tolleranza al glucosio. Il digiuno per 6 ore riduce gli effetti postprandiali, mentre il digiuno notturno (circa 12-16 ore) può avere implicazioni distinte, influenzando potenzialmente la sensibilità all'insulina e il metabolismo del glucosio.

  1. Sottoporre i ratti a un periodo di digiuno di 6 ore, con accesso all'acqua consentito solo durante la notte, assicurandosi che la durata del digiuno non superi le 12 ore. Garantire un periodo di digiuno uniforme per tutti i soggetti per ridurre la variabilità nelle misurazioni del glucosio.
  2. Prima di somministrare il glucosio, pesare i ratti. Per preparare una soluzione sterile, sciogliere 20 g di glucosio in 100 ml di soluzione fisiologica sterile.
    NOTA: Il dosaggio standard è generalmente di 2 g di glucosio/kg di peso corporeo (2 g/kg). Il volume totale dato è determinato dal peso corporeo dell'animale.
  3. Valutare i livelli di glucosio nel sangue di base. Tieni il topo e usa una lancetta per fare una piccola incisione sulla punta della coda. Rimuovere delicatamente la prima goccia di sangue utilizzando un batuffolo di cotone sterile.
  4. Applicare la seconda goccia di sangue sulla striscia reattiva del glucosio e registrare il livello di glucosio basale.
  5. In base al peso corporeo del ratto, somministrare la quantità appropriata di soluzione di glucosio a una velocità di 2 g/kg.
  6. Prima della somministrazione intraperitoneale (IP) della soluzione di glucosio, maneggiare delicatamente il ratto. Iniettare il glucosio nella cavità peritoneale, non nel tessuto sottocutaneo o in qualsiasi organo, e assicurarsi che la somministrazione sia corretta.
  7. Dopo l'iniezione di glucosio, raccogliere campioni di sangue a intervalli specificati per monitorare i livelli di glucosio. Gli intervalli di tempo tipici sono 15, 30, 60, 90 e 120 minuti dopo l'iniezione.
  8. Ad ogni punto, raccogli il sangue tagliando la vena della coda. Prima di ogni prelievo di sangue, assicurarsi che la coda sia pulita con un tampone imbevuto di alcol.
  9. In ogni momento designato, misurare i livelli di glucosio e documentare utilizzando un glucometro.
  10. Durante il test, monitorare i ratti per eventuali segni di disagio o reazioni avverse. Per ridurre al minimo lo stress per gli animali tra una misurazione e l'altra, mantenere un ambiente caldo e silenzioso.
  11. Dopo l'ultima misurazione della glicemia, pulire le ferite della coda e confortare gli animali29.

14. Analisi dell'insulina tramite ELISA dopo prelievo di sangue

NOTA: I passaggi di questo protocollo riguardano il prelievo di sangue dall'aorta addominale di un ratto e quindi l'utilizzo del metodo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) per testare l'insulina.

  1. Anestetizzare il ratto prima della raccolta del sangue come descritto in precedenza. Posizionare il ratto anestetizzato in posizione supina su una piattaforma chirurgica sterile.
  2. Radere la zona addominale e disinfettare l'area utilizzando una soluzione di etanolo o iodio al 70% per garantire la sterilità.
  3. Praticare un'incisione sulla linea mediana con un bisturi per penetrare nella pelle e negli strati muscolari ed esporre la cavità addominale.
  4. Ritrarre l'intestino per accedere all'aorta addominale situata adiacente alla colonna vertebrale. Utilizzare una siringa eparinizzata per inserire l'ago nell'aorta addominale con una leggera angolazione.
  5. Raccogliere il sangue (di solito 1-3 ml, a seconda delle dimensioni del ratto) nella siringa. Applicare un'aspirazione graduale e costante per evitare il collasso vascolare o l'emolisi del sangue.
  6. Metti il sangue raccolto in una provetta da centrifuga e tienilo in ghiaccio.
  7. Se l'animale deve essere soppresso dopo la procedura, eseguire l'eutanasia in conformità con le linee guida etiche istituzionali.
  8. Centrifugare il sangue raccolto a 300 x g per 10-15 minuti a 4 °C per garantire la separazione del plasma o del siero. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e conservarlo a -80 °C per la successiva analisi dell'insulina.
    NOTA: È importante evitare l'emolisi durante il prelievo di sangue in quanto ciò può influire sull'accuratezza dei risultati ELISA (Figura 4)29.

figure-protocol-4
Figura 4: Campioni di sangue sono stati prelevati dalla vena caudale dei ratti in provette di sangue per l'analisi dell'insulina alla conclusione dell'esperimento il giorno 15 dopo il trapianto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

15. Misurazione dell'insulina mediante ELISA

  1. Preparare il kit ELISA per insulina secondo le istruzioni del produttore. Lasciare che tutti i reagenti, gli standard e i campioni raggiungano la temperatura ambiente prima di iniziare il saggio.
  2. Determinare il numero richiesto di pozzetti sulla piastra ELISA per standard, controlli e campioni di siero di ratto.
  3. Preparare i campioni di siero di ratto per l'analisi diluendoli come indicato nel protocollo del kit ELISA, ad es. diluizione 1:10 in PBS.
  4. Preparare gli standard di insulina mediante diluizione seriale per generare una curva standard, ad esempio compresa tra 0 e 10 ng/mL.
  5. Erogare campioni di siero di ratto diluito (solitamente 50-100 μl per pozzetto) negli appositi indicati della piastra ELISA. Erogare la soluzione di anticorpi di rilevamento fornita con il kit in ciascun pozzetto per garantire una distribuzione uniforme.
  6. Incubare la piastra per il tempo specificato (in genere 1-2 ore) a temperatura ambiente o secondo le istruzioni fornite.
  7. Dopo l'incubazione, assicurarsi che i pozzetti siano lavati con l'apposito tampone di lavaggio, in genere PBS contenente lo 0,05% di Tween-20, per rimuovere le sostanze non legate. Eseguire la fase di lavaggio da 3 a 5 volte secondo le istruzioni del kit, assicurandosi che il liquido residuo venga completamente rimosso dopo ogni lavaggio.
  8. Mettere la soluzione di substrato in ogni pozzetto. Il substrato interagirà con l'anticorpo legato all'enzima, provocando un cambiamento di colore; L'intensità del colore è correlata alla quantità di insulina presente nel campione. Incubare la piastra al buio per la durata indicata dal kit, tipicamente variabile dai 15 ai 30 min.
  9. Aggiungere la soluzione di arresto a ciascun pozzetto per terminare la reazione colorimetrica. Il cambiamento di colore si stabilizzerà dopo l'aggiunta della soluzione di arresto, che è tipicamente gialla.
  10. Misurare immediatamente la densità ottica (OD) di ciascun pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato su 450 nm (o come specificato dal kit).
  11. Genera una curva standard tracciando le concentrazioni note degli standard di insulina rispetto ai corrispondenti valori di densità ottica (OD).
  12. Calcolare la concentrazione di insulina nei campioni di siero di ratto utilizzando la curva standard e i corrispondenti valori OD. I livelli di insulina devono essere riportati in ng/mL o in altre unità appropriate29.

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Risultati

Analisi al microscopio ottico

Durante gli esami del 14° giorno delle cellule duttali, l'analisi al microscopio ottico ha rivelato che le cellule si raggruppavano e formavano una struttura simile a un'isola. Questo cambiamento strutturale indica che dopo un certo periodo, le cellule duttali cambiano le loro caratteristiche morfologiche entrando in un ordine organizzativo e acquisendo un aspetto simile a un'isola. La tendenza delle cellule a raggrupparsi è probabilmen...

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Discussione

Lo studio della capacità funzionale di cellule insulari provenienti da diverse fonti ha suscitato un notevole interesse nella ricerca sul diabete. La ricerca iniziale mostra che queste cellule possono rilasciare insulina quando i livelli di glucosio sono aumentati, il che suggerisce che potrebbero essere in grado di imitare le funzioni delle isole pancreatiche naturali. I ricercatori hanno utilizzato la colorazione con ditizone per verificare la somiglianza fenotipica delle cellule simili a isole con le isole pancreatich...

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Dichiarazioni

Nessun potenziale conflitto di interessi è stato segnalato dall'autore o dagli autori.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il team di laboratorio per i loro contributi allo studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cloruro di sodio allo 0,9%Sahar PharmaPer la rimozione del pancreas e il trapianto di cellule
Pipetta sierologica da 10 ml - sterileCorning4488Per l'isolamento
Piastra a 24 pozzettiCorning353047Per GSIS 
Pipetta sierologica da 25 mL - sterileCorning4489Per isolamento
70% etanolo ISOLAB64-17-5Per la disinfezione dei ratti
betadine Baticonol  1186Per la disinfezione dei ratti
Biocholl 1077SigmaL6715-BCPer la purificazione del pancreas
Biocoll, Densità 1,10 g/mLSigmaL6155-BCPer la purificazione del pancreas
Misuratori di glucosio nel sangue e strisce reattive per il glucosioOn Call PlusPer la misurazione della glicemia
BSASigmaA9418Per la preparazione di krebs
CaCl2Sigma57647902Per la preparazione di Krebs
Composizione del catetere: Catetere in polietilene (intracatetere endovenoso)  Bicakcilar24G  e 14Gper pancreas e fegato
CentrifugaThermoST1R PlusPer isolamento 
Collagenasi di tipo V, ≥ 1 unità FALGPA/mg solido,
>125 CDU/mg solido 		SigmaC9263- 1GPer la digestione del pancreas
D-(+)-glucosio Sigma50-99-7Per GSIS e IPGTT
Dithizone (DTZ)SigmaD5130Per la determinazione di isolotti
DMSOSigmaD8779Per risolvere a DTZ
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM— basso glucosio) Gibco11885084Per colture cellulari
Provetta EppendorfISOLABPer il lavaggio cellulare
Provetta Falcon (50 mL)ISOLABLB. IS.078.02.009Per l'isolamento
del siero fetale bovino (FBS)SigmaN4637Per l'isolamento e la coltura del pancreas
Ago sottile e materiale di sutura (taglia 6-0 o 7-0)PROLENE Blue 18" Ago P-1 | 8697GPer la rimozione del
peptide glucagone-simile al trapianto di pancreas e cellule (GLP-1) Aladinorp174144Per la
coltura cellulare Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS con Ca-Mg) CapricornHBSS-1APer la preparazione enzimatica
HBSS senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenoloBIOCHROM  L2015Per l'isolamento del pancreas
HEPESLonzaPer colture cellulari
Insulina ElisaAlpco80-INSRT-E01Per insulina elisa
insulina-transferrina-selenio (ITS)GibcoITS -GPer colture cellulari
Isoxazolo 9 (ISX-9) AladinoI304735-10mgPer colture cellulari
KClSigma329820207Per la preparazione di krebs
Ketamina HCl 200 mg/mLNexGenPer l'anestesia dei ratti
Cabine a flusso laminareLabor IldamBSC-1100IIA2-XPer l'isolamento e il periodo di coltura
LancetteAyset28 GPer la misurazione della glicemia
L-glutammina Sigma59202cPer l'isolamento e la coltura del pancreas
MgCl2Sigma329759772Per la preparazione del lettore di micropiastre di Krebs
BioTek SynergyH1 Lettore multimodalePer l'agitatore per micropiastre elisa per insulina
VWR  444-0270Per insulina elisa
Microscopio microchirurgicoEMZ-200TR 3.9X Per la rimozione del pancreas e il trapianto di cellule
Forbici e pinze microchirurgicheAesculapPer la rimozione del pancreas e il trapianto di cellule
Inserto per colture cellulari sospese Millicell, polietilene tereftalato 8.0µ m MILLIPOREPIEP30R48 Per GSIS 
NaClSigma7647-14-5Per la preparazione di krebs
NaHCO3Sigma144-55-8Per la preparazione di krebs
Pasteur Pipetta 3 mlBIOSIGMAPer l'isolamento
di penicillina/streptomicina SigmaPer l'isolamento e la coltura del pancreas
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) BIOCHROM  L1815Per il passaggio
cellulare Divaricatore (per la stabilizzazione del fegato e dei tessuti connettivi)AesculapPer la rimozione del pancreas e il trapianto di cellule Roswell
Park Memorial Institute Medium (RPMI w/L-Gln)CapricornRPMI-APer l'isolamento e la coltura del pancreas
Dynarexpunta in cotone sterlePer la rimozione del pancreas e il
trapianto di celluleSiringa sterile (10 mL)Ayset32MM 22GPer reazione Collegenase
CronometroKenkoKK613DPer IPGTT
Streptozotocina (STZ) Sigma18883-66-4Per i ratti diabetici si verificano
Unità filtro driver siringa (GP-0.22 µ m-3 mm)MillexSLGP033RSPer la sterilizzazione di terreni di coltura cellulare
Pallone T25Thermo130189Per colture
Reagenti TrypLE ExpressGibcoPer il passaggio cellulare
bagnomaria Travaglio IldamALB128Per la reazione della collegenase
Xilazina 2% con soluzione iniettabileRompunPer anestesia dei ratti
con a

Riferimenti

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