Prevenzione dell'allodinia e dell'iperalgesia mediante cannabidiolo in un modello di ratto di neuropatia periferica indotta da chemioterapia

Sommario

La co-somministrazione di CBD con paclitaxel previene lo sviluppo della neuropatia periferica indotta dalla chemioterapia nei ratti. Questo protocollo descrive la manipolazione dei cannabinoidi, l'induzione di un fenotipo allodinico nei ratti tramite somministrazione chemioterapica, la valutazione dell'allodinia meccanica e termica e l'utilizzo di videografie ad alta velocità per distinguere l'allodinia e l'iperalgesia.

Abstract

Questo studio dimostra l'utilità di un modello di neuropatia periferica indotta da chemioterapia (CIPN) nel ratto per valutare la capacità del cannabinoide non psicoattivo cannabidiolo (CBD) di modulare lo sviluppo di questa sindrome in vivo. Il metodo utilizza l'agente chemioterapico paclitaxel per generare un fenotipo allodinico negli animali. Questo studio descrive come maneggiare e solubilizzare il CBD, somministrare l'agente chemioterapico, valutare la sensibilità meccanica e al freddo e applicare la videografia ad alta velocità per misurare il comportamento nocifensivo negli animali. Utilizzando le procedure descritte, i dati supportano che il CBD impedisce lo sviluppo del fenotipo allodinico negli animali trattati. Non è stata osservata alcuna differenza negli animali trattati con CBD dal giorno 0 (basale pre-paclitaxel) al giorno 7 (post-sensibilizzazione) nella sensibilità meccanica o termica, mentre gli animali trattati con veicolo sono diventati significativamente più sensibili. Questa risposta al trattamento è duratura fino all'ultimo momento in cui sono stati raccolti i dati (7 settimane). L'aggiunta della videografia ad alta velocità consente una valutazione più granulare e imparziale di questo fenotipo comportamentale (ad esempio, classificazione di analgesia e anti-allodinia). Ciò dimostra sia l'utilità di questo modello per la caratterizzazione dei farmaci cannabinoidi che il ruolo potenziale del CBD nel mitigare il dolore neuropatico.

Introduzione

La neuropatia periferica indotta da chemioterapia (CIPN) è un tipo di neuropatia sensoriale. È un effetto collaterale comune del trattamento chemioterapico ed è particolarmente diffuso con taxani e farmaci a base di platino ^1,2. Alcuni sintomi della CIPN includono dolore cronico, intorpidimento, formicolio ed estrema sensibilità al tatto e alla temperatura ^1,2. Questi sintomi dolorosi non solo interferiscono con la vita quotidiana di un paziente, ma anche con il trattamento del cancro. Alcuni pazienti oncologici cercano una riduzione del dosaggio o un'interruzione completa della chemioterapia per essere in grado di gestire la diminuzione della qualità della vita associata a questa sindrome3^. Attualmente, i trattamenti comuni clinicamente utilizzati per la CIPN sono incompletamente efficaci nel sollievo sintomatico e includono gli oppioidi, che presentano un significativo potenziale di abuso⁴. Ad oggi non esiste una cura per la CIPN, quindi è essenziale trovare un'alternativa sicura ed efficace ^5,6.

Il cannabidiolo (CBD) ha precedentemente dimostrato di avere efficacia nel prevenire lo sviluppo di CIPN come modellato nei topi ^7,8. Ciò dimostra un percorso promettente per evitare i sintomi allodinici potenzialmente a lungo termine della CIPN per i pazienti senza la necessità di sollievo attraverso farmaci equivocamente efficaci o oppioidi potenzialmente dannosi. La maggior parte delle persone che usano il CBD, soprattutto per scopi terapeutici come la gestione delle convulsioni, sperimenta lievi effetti collaterali e il farmaco è generalmente ben tollerato⁹. La maggior parte degli effetti avversi sono dose-dipendenti e spesso migliorano man mano che il corpo si adatta.

In questo modello ampiamente utilizzato di CIPN¹⁰, ai ratti viene somministrato paclitaxel per indurre neuropatia, che ricapitola il fenotipo allodinico osservato in alcuni pazienti dopo l'intervento chemioterapico, come riportato in precedenza¹¹. L'obiettivo di questa induzione è quello di avere una piattaforma traslazionalmente rilevante per valutare questo tipo di neuropatia sensoriale in vivo, che sia adatta per i ricercatori che studiano meccanismi o interventi per questa sindrome. La sensibilità meccanica viene misurata utilizzando il test di von Frey e le sfide a basse temperature vengono utilizzate per misurare la sensibilità termica^10,11. Ciò consente di quantificare il potenziale profilattico del CBD nel mitigare la CIPN ai due endpoint clinicamente più importanti della qualità della vita per i pazienti. Un'ulteriore valutazione ha incluso l'analisi assistita da videografia ad alta velocità dei comportamenti nocifensivi^12,13. Questa analisi ampliata delle risposte comportamentali a stimoli innocui e nocivi consente di differenziare tra effetti allodinici e iperalgesici della somministrazione della chemioterapia, nonché la capacità del CBD di modulare questi effetti.

Questo protocollo descrive come indurre il fenotipo CIPN, valutare e quantificare l'ipersensibilità meccanica e termica nei ratti e applicare la videografia per una valutazione imparziale e più granulare dell'allodinia e dell'iperalgesia.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato e segue le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali della Temple University nell'ambito dei protocolli approvati per la ricerca sugli animali. In questo studio sono stati utilizzati ratti maschi adulti di Sprague-Dawley (250-300 g). I dettagli relativi ai reagenti e alle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione di cannabinoidi e agenti chemioterapici per l'induzione della CIPN

NOTA: La Figura 1 mostra il processo di solubilizzazione del cannabidiolo.

1. Assemblare i seguenti materiali per la solubilizzazione del CBD e la diluizione del paclitaxel.
   1. 100% etanolo (EtOH), Chremophor (olio di ricino etossilato), soluzione fisiologica normale, fiale di vetro ambrato (x2), provetta conica da 50 ml (x2), stock di polvere di CBD, stock clinico di paclitaxel (6 mg/mL).
2. Aggiungere un volume appropriato di EtOH a ciascuna provetta conica da 50 mL per una preparazione finale del solvente di EtOH 1:1:18: olio di ricino etossilato: soluzione fisiologica normale.
3. Aumentare la quantità appropriata di CBD per creare una concentrazione di 5 mg/kg per il numero di animali da testare.
4. Sciogliere il CBD in EtOH in una delle due provette coniche da 50 ml preparate.
5. Agitare la miscela CBD-EtOH ad alta velocità fino a quando il CBD non è completamente sciolto.
6. Aggiungere un volume equivalente di olio di ricino etossilato a ciascuna provetta conica da 50 mL.
7. Agitare ogni tubo ad alta velocità fino a quando l'olio di ricino etossilato è in soluzione con EtOH.
8. Aggiungere un volume appropriato di soluzione fisiologica normale a ciascuna provetta conica da 50 mL per ottenere un rapporto finale di 1:1:18.
9. Agitare fino a quando la soluzione salina è in soluzione.
10. Trasferisci la soluzione di controllo del veicolo e la soluzione di CBD in fiale di vetro ambrato.
11. Diluire la soluzione madre di paclitaxel 1:6 in soluzione fisiologica normale per portare la concentrazione finale a 1 mg/mL in flaconcini di ambra al volume appropriato per il numero di animali da testare.
12. Sigillare le fiale ambrate con tappi in gomma con colletto in alluminio.
    NOTA: Se preparati prima dell'inizio dell'esperimento, le fiale di veicolo, veicolo + CBD e paclitaxel possono essere conservate a 4-8 °C per un massimo di 7 giorni. Lasciare che i flaconcini refrigerati si equilibrino a temperatura ambiente prima dell'iniezione. Inoltre, tieni presente che è di fondamentale importanza conservare i reagenti cannabinoidi preparati nel vetro, se non per l'uso immediato, per evitare l'adesione al recipiente o la precipitazione della soluzione.

2. Fenotipo allodinico induttore nei ratti

1. Assemblare i materiali necessari per l'iniezione di paclitaxel come indicato di seguito:
   1. Soluzione madre preparata da 1 mg/mL di paclitaxel, siringhe monouso da 1 mL (x n ratti), aghi per siringa da 25 G (x n ratti), contenitore per rifiuti chemioterapici taglienti e bilancia per raccogliere i pesi degli animali.
2. Numera o etichetta i ratti con identificatori univoci.
   NOTA: Gli animali devono essersi acclimatati alla loro stabulazione per almeno 1 settimana prima dell'inizio dell'esperimento.
3. Raccogli i pesi di ogni animale.
4. Preparare siringhe con il volume appropriato di paclitaxel (tutti gli animali) e veicolo o CBD (per gruppo di trattamento). In questo caso, il volume di iniezione corrisponde a 1 μL/g di peso degli animali.
5. Iniettare paclitaxel e veicolo o paclitaxel e CBD per via interperitoneale.
   1. Per trattenere il ratto per l'iniezione, afferrare il ratto con il non dominante dalla parte posteriore, con l'indice che incontra il pollice intorno al collo e il medio che incontra il pollice sotto la spalla, usando l'anulare e il mignolo per afferrare il corpo.
   2. Stabilizza le zampe posteriori del ratto contro il corpo.
   3. Prestare attenzione a non applicare un livello di pressione scomodo sull'animale per evitare lesioni.
      NOTA: C'è sempre il rischio di morsi o graffi quando si maneggiano i ratti. Per mitigare questo rischio, lo sperimentatore può indossare DPI aggiuntivi sotto forma di guanti resistenti ai morsi.
   4. Mentre è trattenuto e stabilizzato manualmente, inclinare l'animale in modo che il suo addome sia facilmente accessibile alla siringa.
   5. Iniettare 1 mg/mL di paclitaxel nel quadrante inferiore destro dell'animale e gettare la siringa nel contenitore per oggetti taglienti dei rifiuti della chemioterapia.
   6. Iniettare il veicolo o il CBD a 1 μL/g di peso nel quadrante inferiore sinistro dell'animale e gettare la siringa nel normale contenitore per oggetti taglienti.
      NOTA: L'alternanza dei siti di iniezione mitiga il disagio dell'animale e la potenziale irritazione del sito di iniezione.
   7. Questo segna il primo giorno sperimentale. Ripetere questo processo nei giorni 2-4 per indurre il fenotipo allodinico. Seguire i protocolli istituzionali di manipolazione per le gabbie contaminate da chemioterapici durante questo periodo.
   8. Effettuare le misurazioni meccaniche e termiche dell'allodinia al basale il giorno 0, come descritto nel passaggio 3. Includere stimoli aggiuntivi nella generazione di base, come descritto nel passaggio 4. L'analisi dei valori del giorno 0 per questi stimoli sarà necessaria per generare punteggi del dolore.
   9. Ripetere il passaggio 2.5.8 fino a quando gli animali non dimostrano un valore di base stabile e ripetibile per evitare l'eterogeneità della risposta causata da una manipolazione insufficiente.
      NOTA: Non interrompere il processo di induzione del fenotipo allodinico. Se lo sperimentatore non è in grado di condurre iniezioni in 4 giorni consecutivi, programmi di dosaggio alternativi possono ottenere un'induzione simile del fenotipo. È anche possibile e forse raccomandato combinare l'iniezione di paclitaxel e veicolo o CBD in un'unica iniezione piuttosto che 2 regolando il volume del veicolo iniziale o della soluzione di CBD in modo appropriato per adattarsi alla diluizione del paclitaxel in queste miscele mantenendo una concentrazione finale di 5 mg/mL di CBD e una concentrazione di 1 mg/mL di paclitaxel. Prestare la dovuta attenzione quando si maneggiano oggetti taglienti per chemioterapia per evitare l'esposizione accidentale allo sperimentatore.

3. Valutazione della sensibilità meccanica e termica post-sensibilizzazione

NOTA: La Figura 2 mostra l'apparato schematico utilizzato per questo studio.

1. Assemblare i seguenti materiali per i saggi meccanici e di sensibilità al freddo:
   1. Filamenti Von Frey (4-100 g), ghiaccio secco, provetta conica da 15 mL, camere di isolamento, griglia a pavimento in filo metallico, pannello di vetro da 1/4 di pollice e cronometro.
2. Iniziare la valutazione il giorno 7 sperimentale (ad esempio, 3 giorni dopo l'iniezione finale di chemioterapico/condizione di trattamento).
3. Assemblare von Frey e le camere di isolamento termico.
   1. Posizionare le camere di isolamento per la sensibilità meccanica (6 camere separate da divisori in plastica) su una griglia metallica a pavimento 20 cm sopra il piano del banco.
   2. Posizionare le camere di isolamento per il test di sensibilità termica (camera singola) su una superficie di vetro da 1/4 di pollice a 20 cm sopra il piano del banco.
4. Collocare gli animali singolarmente in camere di isolamento per l'allodinia meccanica.
5. Lasciare acclimatare le camere di isolamento per 15 minuti prima dell'inizio del test.
6. Eseguire test manuali di von Frey per la sensibilità meccanica. Questo metodo descrive il test di von Frey manuale, ma il test di von Frey elettronico può essere sostituito dal test manuale¹⁴.
   1. Inizia con il filamento corrispondente al grammo di forza più basso (ad esempio, 4 g) e applica una pressione sulla superficie medio-plantare della zampa posteriore destra in modo tale che il filamento sia tenuto a forma di C per 6 s.
      NOTA: I ricercatori riportano poca differenza tra le zampe posteriori destre e sinistre, ma gli sperimentatori dovrebbero essere coerenti tra gli animali). Ripeti 5 prove per stimolo.
   2. Ripetere l'operazione per ogni animale da testare.
   3. Aumentare le dimensioni del filamento in sequenza e ripetere i passaggi 3.5.1-3.5.2 fino a quando non si osserva una risposta al dolore (ad esempio, ritiro della zampa) in almeno 2 dei 5 studi.
   4. Record del grammo di filamento di forza che ha evocato la risposta della zampa osservata.
   5. Testare nuovamente il filamento inferiore successivo per vedere se si osserva il ritiro della zampa. Se non si osserva alcuna risposta, il grammo di forza registrato è definitivo.
   6. Se l'animale risponde a questo passaggio, registra un nuovo grammo di filamento di forza e riprova il filamento inferiore successivo. Ripetere fino a quando i filamenti inferiori non suscitano più una risposta. I dati rappresentativi sono mostrati nella Figura 3A, C.
7. Condurre test di sensibilità al freddo.
   1. Rimuovere l'animale dalla camera di isolamento della sensibilità meccanica e posizionarlo in una camera di isolamento della sensibilità termica.
   2. Confezionare una provetta conica da 15 ml con ghiaccio secco in modo che il pellet finale si estenda dalla parte superiore della provetta.
   3. Metti il ghiaccio secco sul bicchiere prossimalmente alla zampa posteriore destra dell'animale.
   4. Con un cronometro, registra il tempo fino a quando l'animale dimostra il ritiro della zampa in risposta alla temperatura. I dati rappresentativi sono mostrati nella Figura 3B.
   5. Ricollocare il ratto nella sua gabbia domestica.
   6. Ripetere tutti i passaggi del punto 3.7 fino a quando tutti gli animali sono stati testati e sono tornati nella gabbia di casa.
      NOTA: È anche importante notare che il comportamento e il peso degli animali devono essere monitorati per eventuali segni di sofferenza in questa fase. Se gli animali sviluppano un comportamento di dolore di base o stanno perdendo peso corporeo durante un periodo di tempo prolungato, lo studio deve essere interrotto e gli animali devono essere soppressi secondo la corretta tecnica di manipolazione degli animali. Se gli animali non mostrano angoscia nel corso dell'esperimento, gli animali devono essere soppressi dopo l'ultimo giorno di test.

4. Valutazione della sensibilità meccanica tramite videografia ad alta velocità

1. Assemblare i seguenti materiali come indicato di seguito per il saggio di sensibilità meccanica e la videografia:
   1. Camere di isolamento, griglia a pavimento in filo metallico, batuffolo di cotone, pennello per il trucco, spilli, fotocamera ad alta velocità, luci a infrarossi, laptop con software di analisi compatibile.
2. Valutare in combinazione con il test di sensibilità meccanica precedentemente descritto¹¹o come test autonomo come descritto di seguito.
3. Assemblare le camere di isolamento per la sensibilità meccanica (camera singola) posizionandole su una griglia metallica a pavimento a 20 cm sopra il piano del banco.
4. Posizionare la fotocamera su un treppiede con un angolo di circa 45 gradi tra 1 e 2 piedi di distanza dalla camera di isolamento.
5. Posizionare le luci a infrarossi sui treppiedi per illuminare la camera per la sperimentazione e il successivo punteggio.
6. Posizionare gli animali singolarmente nella camera di isolamento per la valutazione dello stimolo meccanico.
7. Consentire l'acclimatazione alle camere di isolamento per 15 m prima dell'inizio del test.
8. Condurre test somatosensoriali per la sensibilità meccanica con diversi stimoli (Figura 4).
   1. Utilizzare un laptop con il software Photron FastCAM Analysis per registrare la camera di isolamento a 2000 fotogrammi/s per ogni stimolo (premere il pulsante corrispondente per avviare la registrazione).
   2. Utilizzare il batuffolo di cotone per stabilire un contatto delicato tra la punta del cotone e la zampa posteriore del ratto durante la registrazione e fermarsi dopo aver completato la registrazione.
   3. Usa il pennello per il trucco per strofinare la zampa posteriore da dietro in avanti e fermati dopo aver completato.
   4. Usa lo spillo per condurre punture di spillo a bassa e alta pressione sulla zampa posteriore del ratto. Per le punture a bassa pressione, toccare delicatamente il perno con la zampa posteriore, ritirarsi dopo il contatto durante la registrazione e fermarsi dopo il completamento.
   5. Per le punture di spillo ad alta pressione, premere bruscamente il perno nella zampa posteriore e ritirarlo dopo il contatto durante la registrazione e fermarsi dopo il completamento.
   6. Rimetti l'animale nella gabbia di casa.
   7. Ripetere l'operazione per ogni animale da testare.
9. Valutare manualmente il comportamento nocifensivo registrato via videografia ad alta velocità con video elaborati con il software FastCAM¹⁵, come dimostrato in Figura 5A,B.
   1. Misurare l'altezza della zampa (in cm) dal pavimento in rete al punto più alto dopo la stimolazione della zampa. Per farlo nel software, vai su Dimensioni > misure e seleziona Due punti.
      1. Riproduci il video durante l'intero movimento della zampa per determinare il momento in cui la zampa raggiunge il suo picco durante il movimento iniziale verso l'alto. Selezionare una regione della zampa chiaramente identificabile (ad esempio, il centro della superficie plantare, l'intersezione di un dito con la zampa, il tallone, ecc.) e impostarla come punto iniziale.
      2. Riavvolgi il video per individuare la posizione di quella regione prima della stimolazione e segna il secondo punto in quella posizione lungo l'asse y. Assicurarsi che la linea di misurazione rimanga parallela all'asse y e non angolata. L'altezza verrà visualizzata nell'angolo in alto a sinistra dello schermo15.
   2. Determina la velocità della zampa calcolando la distanza (in cm) dal sollevamento iniziale al punto più alto, divisa per il tempo (in secondi) tra questi due punti. Questa misurazione può essere eseguita nel software selezionando Dimensioni > Misure e scegliendo Due punti.
   3. Riproduci il video durante l'intero movimento della zampa per identificare i fotogrammi in cui la zampa inizia il suo primo movimento verso l'alto. Misura la velocità della zampa selezionando due punti in fotogrammi diversi all'interno di questo movimento e calcolando la distanza divisa per il numero di fotogrammi o il tempo trascorso tra il fotogramma iniziale e quello finale¹⁵.
   4. Valuta i video per il serraggio orbitale, lo scuotimento della zampa, la protezione della zampa e i comportamenti di salto. Ad esempio, se un animale dovesse mostrare uno di questi comportamenti durante l'applicazione dello stimolo, il suo punteggio di comportamento nocifensivo sarebbe 1.
      NOTA: Il restringimento orbitale è stato ottenuto quando gli occhi sono passati da completamente aperti a parzialmente o completamente chiusi durante l'applicazione dello stimolo. Lo scuotimento delle zampe è stato ottenuto quando è stato osservato un sussulto delle zampe ad alta frequenza durante l'applicazione dello stimolo. Il salto è stato segnato quando tre o più zampe erano fuori dal pavimento della griglia metallica durante l'applicazione dello stimolo.
   5. Utilizzare i dati di base degli stimoli per generare stime di distribuzione ed errore per questa coorte di animali, come descritto in precedenza¹⁵. In breve, registrare video di ciascun animale utilizzato negli studi in risposta al tocco statico, al tocco dinamico, alla puntura di spillo leggera e alla puntura di spillo pesante al basale pre-trattamento per catturare l'intera gamma di possibili caratteristiche comportamentali.
      1. Calcola la media e la deviazione standard di ciascuna caratteristica comportamentale (velocità, altezza, punteggio del dolore) per il gruppo attraverso tutti gli stimoli (tocco statico, batuffolo di cotone, puntura di spillo leggera, puntura di spillo pesante).
   6. Genera punteggi z dai dati grezzi osservati in ciascun video utilizzando le variabili generate nel passaggio 4.9.4 e le procedure precedentemente descritte¹⁶.
   7. Combina tutti gli z-score in un autovalore unidimensionale utilizzando l'analisi delle componenti principali utilizzando il software di analisi statistica¹⁷. Ciò consente di calcolare la combinazione di z-score trasformati dal set di dati tridimensionale come un singolo valore totale ponderato¹⁶.
   8. Tracciare i punteggi del dolore generati dalla PCA che comprendono queste molteplici dimensioni comportamentali per separare i comportamenti associati a stimoli nocivi e innocui (Figura 5C) utilizzando un software di analisi statistica.
      NOTA: I test meccanici assistiti da videografia ripetono i test di von Frey incorporando una maggiore dimensionalità. Nel contesto della CIPN, consente la descrizione e la distinzione tra antiallodinia e analgesia. Il punteggio video può essere condotto anche da parti indipendenti dallo sperimentatore che ha condotto il test sensoriale. Si tratta di uno strumento potente che può ridurre i pregiudizi degli sperimentatori e aumentare la profondità delle informazioni raccolte. È importante notare che questo metodo si basa su hardware, software e tecniche statistiche specializzate. Serve come supplemento al metodo più accessibile descritto nelle sezioni precedenti. Inoltre, va notato che la raccolta dei dati richiede molto tempo a causa delle dimensioni dei file generati dalla fotocamera e che lo spazio di archiviazione dei file può essere un fattore limitante. Questi fattori dovrebbero essere considerati all'inizio dell'esperimento.

Risultati

I risultati comportamentali suscitati da questo modello CIPN nei ratti sono altamente riproducibili e coerenti. La Figura 3A mostra i risultati della sensibilità meccanica alla sensibilizzazione al basale e post-paclitaxel negli animali di controllo e trattati con CBD. Al basale, i ratti Sprague-Dawley generalmente iniziano a mostrare un ritiro della zampa a 26-60 g di forza applicata dai filamenti di von Frey. Questo è osservabile in entrambi i gruppi di trattamento il giorno zero. Dopo la ...

Discussione

Il modello di ratto di neuropatia periferica indotta da chemioterapia ricapitola due dei problemi di qualità della vita più riportati per i pazienti che ricevono determinati tipi di chemioterapia nella sensibilità meccanica e termica. Con questo modello, metodi relativamente economici ed efficienti possono quantificare queste sensibilità attraverso il test del filamento von Frey e la sensibilità termica attraverso l'esposizione al ghiaccio secco. Questo metodo fornisce anche un ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cannabidiolo	Caymen Chemical	90080	Ann Arbor, MI
Chremophor	Millipore-Sigma	238470	St. Lous, MO
Etanolo	Millipore-Sigma	E7023	St. Lous, MO
Software di analisi FastCAM	Photon		https://photron.com, telecamera ad
alta velocità	Photron	AX 50
Luci a infrarossi	CMVision	Profilo IP65
Soluzione salina normale	, Millipore-Sigma,	S0817	St. Lous, MO
Paclitaxel	Temple University Hospital, Farmacia	N/A	, Philadelphia, PA,
Sprague-Dawley, ratti (250– 300 g)	Laboratori Taconic, Cranbury, NJ

open source , , ,