Method Article

Generazione e caratterizzazione di astrociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane prive di ribonucleoproteina messaggero X fragile

DOI:

10.3791/68081

⸱

June 6th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Centre for High Impact Neuroscience and Translational Applications, TCG Centres for Research and Education in Science and Technology, 2Centre for Brain Development and Repair, 3National Centre for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research, 4Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descriviamo un protocollo che facilita la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in astrociti funzionali specifici per il proencefalo. Ciò consente di studiare il ruolo delle cellule gliali nella patogenesi dei disturbi dello sviluppo neurologico, come la sindrome dell'X fragile, e di modellare altri disturbi cerebrali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sindrome dell'X fragile (FXS), una delle principali cause ereditarie del disturbo dello spettro autistico e della disabilità intellettiva, è stata ampiamente studiata utilizzando modelli di roditori. Più recentemente, sono stati utilizzati anche sistemi modello derivati da cellule staminali umane per ottenere informazioni meccanicistiche sulla fisiopatologia della FXS. Tuttavia, questi studi si sono concentrati quasi esclusivamente sui neuroni. Inoltre, nonostante la crescente evidenza di un ruolo chiave della glia nella funzione neuronale nella salute e nella malattia, si sa poco su come gli astrociti umani siano influenzati dalla FXS.

Pertanto, in questo studio, abbiamo sviluppato con successo un protocollo che cattura le tappe spaziotemporali chiave dello sviluppo cerebrale e si allinea anche con il processo di gliogenesi. Insieme, questo offre un quadro utile per studiare i disturbi del neurosviluppo. In primo luogo, abbiamo modellato le cellule staminali pluripotenti indotte umane nel lignaggio neuroectodermico con doppio soppressore delle madri contro l'inibizione decapopentaplegica (SMAD) e piccole molecole. Successivamente, abbiamo utilizzato specifici fattori di crescita e citochine per generare cellule progenitrici astrocitiche (APC) di controllo (CTRL) e FXS derivate da pazienti. Il trattamento delle APC con fattore neurotrofico ciliare, una citochina differenziante, ha regolato e guidato le cellule progenitrici verso la maturazione astrocitica, producendo astrociti che esprimono proteine acide fibrillari gliali specifiche per il prosencefalo.

Abbiamo scoperto che questi astrociti sono funzionali, come evidenziato dalle loro risposte di calcio all'applicazione di ATP, e mostrano un metabolismo glicolitico e mitocondriale disregolato nella FXS. Nel loro insieme, questi risultati forniscono un'utile piattaforma sperimentale di origine umana per lo studio delle conseguenze cellulo-autonome e non-cellulo-autonome delle alterazioni della funzione astrocitaria causate da disturbi del neurosviluppo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La sindrome dell'X fragile (FXS), una forma ereditaria comune di disabilità intellettiva e disturbo dello spettro autistico (ASD), è causata dalla mancanza di ribonucleoproteina messaggero dell'X fragile (FMRP) prodotta dal gene della ribonucleoproteina 1 del messaggero dell'X fragile (FMR1) (OMIM: #300624, https://www.omim.org/entry/300624). L'FMRP svolge un ruolo nella regolazione della traduzione dell'mRNA, nella formazione e nel trasporto dei granuli di mRNA e nella regolazione dell'espressione genica1 mediata dai microRNA. Pertanto, la perdita di FMRP influisce non solo sullo sviluppo del cervello, ma anche sulla funzione cerebrale adulta. Sia i livelli di trascrizione dell'mRNA di FMR1 che l'immunocolorazione per FMRP nel cervello hanno mostrato un'elevata espressione neuronale, insieme a un'espressione significativa anche nelle cellule gliali2. Tuttavia, la stragrande maggioranza degli studi precedenti su modelli animali di FXS si è concentrata principalmente sui neuroni e sulle aberrazioni nella loro funzione. Di conseguenza, si sa poco sul ruolo della glia in FXS3. Tradizionalmente considerate come cellule di "supporto passivo"4, si stanno accumulando prove che gli astrociti sono fondamentali nella mediazione di un'ampia gamma di funzioni neuronali 5,6, tra cui la promozione della sinaptogenesi7, il perfezionamento dei circuiti neurali in via di sviluppo8 e il riciclaggio dei neurotrasmettitori9. Parallelamente, vi è una crescente evidenza del ruolo degli astrociti nella patogenesi della malattia e molte condizioni neurologiche sono state associate alla disfunzione astrocitaria10.

Mentre gran parte del lavoro precedente che utilizzava modelli animali di FXS si concentrava sull'identificazione e la convalida di vari bersagli molecolari nei neuroni per il trattamento di FXS, questi risultati preclinici non hanno sempre portato a risultati clinici di successo. Inoltre, le battute d'arresto nei recenti studi clinici sottolineano anche la necessità di sistemi modello basati sull'uomo. I modelli di disturbi neurologici basati su cellule cerebrali derivate da cellule staminali umane offrono una potente strategia per colmare questo divario tra le intuizioni meccanicistiche degli studi sugli animali e il successo limitato con i risultati clinici per i pazienti. Tuttavia, solo una manciata di questi studi si è concentrata sugli astrociti e anche su astrociti di origine spinale. Questo, a sua volta, è rilevante alla luce degli studi che dimostrano che la struttura e la funzione degli astrociti variano tra le regioni del cervello11,12. Pertanto, una migliore comprensione dei cambiamenti indotti dalla malattia negli astrociti umani deve anche tenere conto di queste differenze specifiche della regione del cervello negli astrociti. Tuttavia, i modelli di disturbi dello sviluppo neurologico che utilizzano astrociti derivati da cellule staminali umane che sono specifici per il proencefalo rimangono relativamente poco esplorati13. Quindi, per iniziare a colmare queste lacune, descriviamo i protocolli per la generazione di astrociti specifici per il proencefalo da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da pazienti portatori di mutazioni FXS; Inoltre, dimostriamo che gli astrociti sono funzionali e mostrano un metabolismo alterato.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti con cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) (Tabella 1) sono stati eseguiti dopo aver ottenuto le appropriate approvazioni normative istituzionali. La Figura 1A rappresenta il protocollo di differenziazione completo delle hiPSC verso astrociti maturi specifici del proencefalo.

1. Manutenzione ed espansione delle hiPSC

  1. Un giorno prima di placcare le iPSC, rivestire una piastra a 6 pozzetti con Matrigel diluito 1:60 (una matrice extracellulare [ECM]) in Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) e conservare a 2-8 °C.
    NOTA: Evitare di conservare le piastre rivestite con Matrigel per >5 giorni a 2-8 °C, poiché ciò potrebbe causare la degradazione delle proteine nella MEC nel tempo. Per evitare l'essiccazione della piastra, rivestire un minimo di 1 mL di Matrigel diluito 1:60 per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e distribuirla uniformemente sulla piastra. Se si utilizza lo stesso giorno, conservare la piastra in un'incubatrice umidificata a 37 °C e 5% di CO2 per 1 ora.
  2. Il giorno della coltura delle hiPSC, rimuovere il materiale di rivestimento e aggiungere 1 mL di terreno completo Essential 8 (terreno basale E8 con integratore Essential 8) insieme all'inibitore ROCK a una concentrazione finale pari a 1x e conservare la piastra in un incubatore a 37 °C e CO2 al 5% prima di aggiungere le hiPSC.
  3. Risospendere le hiPSC in terreno E8 completo insieme all'inibitore ROCK a una concentrazione finale pari a 1x per una migliore aderenza delle colonie.
    NOTA: Non preparare grandi quantità di terreno di coltura. Preparare solo per 3-4 giorni al massimo e conservare a 2-8 °C.
  4. Il giorno successivo, reintegrare l'intero terreno E8 senza l'inibitore ROCK fino a quando le cellule non sono confluenti all'80% (circa 4-5 giorni).
  5. Quando raggiungono l'80% di confluenza, staccano le colonie enzimaticamente.
    1. Per far passare le iPSC, rimuovere il terreno esaurito dalla piastra e aggiungere 1 mL per pozzetto di miscela preriscaldata (37 °C) di collagenasi (2 mg/mL) e dispasi (1 mg/mL) in un rapporto di 1:1 e incubare a 37 °C per più di 20-30 minuti per consentire alle colonie di iPSC di sollevarsi.
      NOTA: Non lasciare le stoviglie a 37 °C per più di 20-30 min; Oltre questo periodo, le colonie si disintegreranno e le cellule moriranno.
  6. Quando le colonie iniziano a sollevarsi, estrarre le piastre dall'incubatrice e neutralizzare l'attività enzimatica aggiungendo 2 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS).
  7. Raschiare le colonie con DPBS e raccogliere la sospensione in una provetta conica da 15 mL utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL a foro largo.
  8. Triturare delicatamente la sospensione 2-3 volte per rompere le colonie utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml e lasciare che le colonie si stabilizzino.
    NOTA: Non trasformare le colonie in singole cellule; Ciò può comportare la mancata adesione delle cellule al piatto e causare una maggiore morte cellulare. Inoltre, non lasciarli come grandi colonie; Questo porterà a colonie più differenziate in seguito.
  9. Una volta che le colonie si sono stabilizzate (circa dopo 2 minuti), aspirare la miscela enzimatica DPBS lasciando circa 1 mL nella provetta.
  10. Aggiungere 2 ml di DPBS alla provetta, mescolare le colonie picchiettando e lasciarle depositare. Ripeti l'operazione 2 volte per rimuovere tutto l'enzima residuo dalle colonie. Rimuovere quanto più surnatante possibile dopo il 2° lavaggio, risospendere le colonie in 1 mL di E8 Medium completo e impiattare in un piatto appena preparato come indicato nei passaggi 1.2-1.3.
  11. In alternativa, crioconservare una parte delle colonie utilizzando il 10% di dimetilsolfossido (DMSO) come soluzione crioprotettiva per l'espansione e l'uso futuri.
    1. Preparare il terreno di crioconservazione appena miscelando il 90% di terreno E8 completo e il 10% di DMSO come soluzione crioprotettiva e posizionarlo a 2-8 °C fino all'uso.
  12. Per la crioconservazione, seguire i passaggi 1.5-1.10.
  13. Durante il passaggio 1.10, dopo il 2° lavaggio, lasciare che le colonie si depositino e rimuovere il surnatante. Alle colonie, aggiungere 1 mL di terreno di crioconservazione a freddo appena preparato e trasferire in crioviali.
    NOTA: Dopo aver aggiunto il terreno di crioconservazione alle colonie, trasferire rapidamente il contenuto nei crioviali. Il ritardo può comportare un tasso di rianimazione inferiore, poiché il DMSO è un crioprotettore che può danneggiare le cellule.
  14. Spostare immediatamente i crioviali in una crioscatola e conservarli in un congelatore a -80 °C per una notte.
  15. Il giorno successivo, sposta tutti i crioviali in un serbatoio di azoto liquido (serbatoio LN2 ) per un uso futuro.
    NOTA: le hiPSC devono essere regolarmente cariotipizzate utilizzando il G-banding (Figura S1 supplementare) per eventuali anomalie, caratterizzate utilizzando l'immunocitochimica per la pluripotenza (Figura 1B) e testate per il micoplasma.
    1. Per caratterizzare le hiPSC utilizzando l'immunocitochimica, placcare le colonie su vetrini coprioggetto da 13 mm rivestiti in Matrigel e autoclavati in scala 1:60. Una volta che sono confluenti al 40%, lavare le cellule con PBS-T (PBS-0,1% Tween 20), fissare con paraformaldeide al 4% per 10 minuti, permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 10 minuti e bloccare con albumina sierica bovina (BSA) al 3% in PBS per 1 ora per prevenire il legame non specifico.
    2. Dopo il blocco, incubare le colture con anticorpi primari per 1 ora e quindi lavare 3 volte con PBS-T per 5 minuti ciascuna, seguite dai corrispondenti anticorpi secondari (Tabella dei materiali) al buio per 1 ora.
    3. Monta i vetrini coprioggetti su vetrini con mezzo di montaggio e acquisisci immagini mediante scansione laser confocale a 405 nm, 488 nm, 561 nm e 633 nm. Cattura immagini a 512 x 512 pixel; impostare la dimensione del passo Z a 0,5 μm con 1 unità di diametro arioso del foro stenopeico.

2. Generazione e caratterizzazione di cellule progenitrici astrocitiche (APCs)

  1. Sollevare enzimaticamente le hiPSC come indicato nei passaggi 1.5-1.10 e piastrelarle su un piatto di coltura in sospensione non aderente (100 mm) con terreno chimicamente definito14 contenente il 50% di terreno di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM), il 50% di miscela di nutrienti F-12 di Ham (F12), 5 mg/mL di BSA, l'1% di concentrato lipidico chimicamente definito (CD-Lipid), 450 μM di monotioglicerolo, 7 μg/mL di insulina, 15 μg/mL di transferrina, Penicillina-streptomicina all'1% integrata con mitogeni di patterning del proencefalo N-acetil cisteina (1 mM), LDN 193189 (0,1 μM) e SB431542 (10 μM) per 7 giorni.
    NOTA: Gli inibitori di piccole molecole SB431542 e LDN-193189 (LDN) sono inibitori delle proteine morfogenetiche ossee e delle vie di segnalazione beta del fattore di crescita trasformante.
    Da questo momento in poi, il mezzo è stato rifornito una volta ogni 2 giorni o seguendo il protocollo lunedì/mercoledì/venerdì.
  2. Posizionare la sospensione cellulare su un agitatore orbitale a 40 giri/min per 7 giorni in condizioni normossiche per favorire lo sviluppo delle corticosfere (Figura 1A).
  3. Il giorno 8, trasferire le corticosfere in un terreno di proliferazione cellulare contenente DMEM/F12 avanzato con l'1% di antibiotico-antimicotico, l'1% di integratore di N2, l'1% di sostituto della glutammina, lo 0,1% di integratore di B27 e 2,5 ng/mL di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) per 7 giorni.
  4. Indurre le sfere per la specificazione gliale sottoponendole a un terreno di arricchimento gliale contenente DMEM/F12 avanzato con l'1% di antibiotico-antimicotico, l'1% di N2, l'1% di sostituto della glutammina, lo 0,1% di integratore di B27, 20 ng/mL di fattore di crescita epidermico (EGF), bFGF-H (20 ng/mL di bFGF-5 mg/mL di eparina) per 2 settimane per ottenere gliosfere precoci (Figura 1A).
  5. Per la maturazione delle gliosfere precoci, sostituire bFGF-H con 20 ng/mL di fattore inibitorio della leucemia (LIF) e mantenere le sfere per 4 settimane.
  6. Dopo 4 settimane nel terreno di maturazione, mantenere le sfere nel terreno di arricchimento gliale per periodi prolungati. Per prevenire l'aggregazione e la perdita di vitalità, ogni 2 settimane, tritare meccanicamente le gliosfere utilizzando una lama industriale sterile e sostituire l'intero terreno con DNasi I per rimuovere i frammenti di DNA generati dal taglio.
  7. Dissociare le gliosfere in monostrati di APC utilizzando un kit di dissociazione con papaina e dissociare su un piatto aderente trattato con coltura cellulare con diluizione 1:80 del rivestimento Matrigel.
  8. Propagare le APC nel terreno di arricchimento gliale fino all'80% di confluenza e farle passare enzimaticamente utilizzando il terreno di distacco cellulare enzimatico (vedi Tabella dei Materiali).
  9. Al passaggio:
    1. Rimuovere il terreno esaurito e raccoglierlo in un tubo conico. Alle cellule, aggiungere il terreno di distacco cellulare enzimatico e attendere 1-2 minuti. Una volta che le cellule iniziano a staccarsi, aggiungere il terreno esaurito per neutralizzare l'attività enzimatica.
    2. Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 800 x ɡ per 2 min.
    3. Aspirare il surnatante, risospendere le cellule in un terreno di arricchimento gliale e impiattare circa 1 x 106 cellule/pozzetto su una piastra a 6 pozzetti rivestita di Matrigel 1:80.
  10. Per la crioconservazione:
    1. Risospendere le cellule in una miscela fredda di 90% di terreno di proliferazione corticosfera (senza bFGF) e 10% di crioprotettore. Trasferire le cellule risospese in crioviali.
    2. Spostare immediatamente i crioviali in una crioscatola e conservarli in congelatore a -80 °C per una notte.
    3. Il giorno successivo, sposta tutti i crioviali in un serbatoio di azoto liquido (serbatoio LN2 ) per un uso futuro.
      NOTA: Gli APC sono stati crioconservati utilizzando il 10% di DMSO fino al passaggio numero 6.
  11. Caratterizzare le APC dissociate mediante immunocolorazione (come menzionato nei passaggi 1.15.1-1.15.3) con marcatori di vimentina e fattore nucleare IA (NFIA) (Figura 1C, D) (vedere la tabella dei materiali per le diluizioni).
  12. Per confermare la specificità regionale del proencefalo delle APC derivate da hiPSC, testare le cellule per un marcatore del proencefalo come la scatola a forchetta umana G1 (hFOXG1) (positivo) e il marcatore del rombencefalo come l'omeobox B4 umano (hHOXB4) (negativo) utilizzando la qPCR in tempo reale (Figura 1E, F).
    NOTA: Le sequenze di primer utilizzate per questi esperimenti sono state elencate nella Tabella Supplementare S1.

3. Generazione e caratterizzazione di una popolazione omogenea di astrociti prosencefalo-specifici

  1. Differenziazione degli astrociti dalle APC
    1. Utilizzare il mezzo di differenziazione astrocitaria (ADM) per 14 giorni per differenziare le APC in astrociti. Il terreno di differenziazione astrocitaria contiene Neurobasal, 1% antibiotico-antimicotico, 1% sostituto della glutammina, 1% integratore di N2, 0,2% integratore di B27, 1% mezzo di aminoacidi non essenziali (NEAA) e 10 ng/mL di fattore neurotrofico ciliare (CNTF).
    2. Confermare l'identità astrocitaria utilizzando l'immunocolorazione (come menzionato nei passaggi 1.15.1-1.15.3.) con la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e i marcatori di espressione S100β (Figura 2A, B).
  2. Sintesi proteica de novo in APC e astrociti
    1. Mantenere le APC del prosencefalo derivate da hiPSC e gli astrociti su vetrini coprioggetti sterili autoclavati da 13 mm e immunocolorarli come indicato nei passaggi 1.15.1-1.15.3.
    2. Per la sintesi proteica de novo , utilizzare il metodo FUNCAT (fluorescente non canonical amminoacid tagging), spiegato brevemente nei passaggi 3.2.3-3.2.6 (Figura 3A).
    3. Per garantire la carenza di metionina, rimuovere il terreno di coltura dalle colture e sostituirlo con un terreno privo di metionina e cisteina mescolato con 1 mM di L-azidoomoalanina (AHA) per 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
    4. Lavare le colture con PBS-T, fissare con paraformaldeide al 4% per 10 minuti, permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 10 minuti e bloccare con BSA al 3% in PBS per 1 ora per evitare il legame non specifico.
    5. Incubare le colture al buio per 1 ora a temperatura ambiente con la miscela di reazione chimica delle cellule Click e Alkyne Alexa Fluor 647, seguita da anticorpi primari per 1 ora e anticorpi secondari corrispondenti (Tabella dei materiali) per 1 ora (Figura 3B).
    6. Monta i vetrini coprioggetti su vetrini con supporto di montaggio e utilizzali per ulteriori analisi delle immagini.
      1. Acquisisci immagini mediante scansione laser confocale a 405 nm, 488 nm, 561 nm e 633 nm.
      2. Cattura immagini a 512 x 512 pixel; impostare la dimensione del passo Z a 0,5 μm con 1 unità di diametro arioso del foro stenopeico.
      3. Mantenere i parametri di microscopia e imaging a un'impostazione costante tra i tipi di cellule. Cattura immagini per ogni replica biologica nella stessa sessione.
      4. Esegui misurazioni dell'intensità utilizzando qualsiasi software di analisi delle immagini standard (ad es. Fiji o Imaris). In Imaris, utilizzare il modulo SURFACES per produrre misurazioni volumetriche dei corpi cellulari positivi per il segnale fluorescente FUNCAT (Non-Canonical Amino Acid Tagging) con Vimentina (APC) e GFAP (astrociti) che limitano l'intervallo di voxel (250-350) per rimuovere i detriti.
        NOTA: Mantenere i parametri in tutte le repliche biologiche per entrambi i tipi di cellule.
  3. Onde di calcio oscillatorie indotte da adenosina 5′-trifosfato (ATP)
    1. Piastra gli astrociti su una piastra con fondo di vetro (35 mm) a 5 × 103 cellule/piastra per misurare la risposta cellulare all'ATP.
    2. Lasciare che le cellule aderiscano al fondo di vetro per 24 ore, lavarle 3 volte con HBSS (20 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucosio, 1 mM MgCl2, pH = 7,3) senza calcio e incubare in terreno di coltura con colorante metrico Fura-2AM con rapporto 5 μM e Pluronics F127 0,02% per 1 ora a temperatura ambiente.
      NOTA: Fura-2AM è una sostanza chimica sensibile alla luce e alla temperatura; conservare a -20 °C.
    3. Dopo l'incubazione, lavare 2x con terreno di coltura e sostituire con 2 mM di Ca2+ contenente HBSS e visualizzare le cellule a una velocità di 2 FPS utilizzando un obiettivo a olio 60x (1,35 NA) in un microscopio invertito a compensazione della deriva della messa a fuoco.
    4. Registrare le risposte di calcio indotte da ATP mediante l'applicazione di ATP in bagno alla concentrazione finale di 5 mM a 25° s (Figura 4A).
    5. Disegna le regioni di interesse attorno a ciascuna cella utilizzando Fiji/ImageJ e calcola il rapporto F340/F380 in tutti i punti temporali (Figura 4B).
  4. Saggi metabolici cellulari
    NOTA: Il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) delle cellule vive sono stati misurati secondo il protocollo del produttore (vedere la Tabella dei materiali).
    1. Un giorno prima del saggio, lasciare che gli astrociti aderiscano alla micropiastra (1,5 × 104 densità di semina) in terreno CNTF e incubare a 37 °C con il 5% di CO2.
    2. Per il test dello stress da glicolisi:
      1. Sostituire il terreno di coltura cellulare con un terreno di base integrato con 2 mM di glutammina (pH regolato a 7,4) e incubare in una camera non CO2 a 37 °C per 1 ora.
        NOTA: Il pH deve essere regolato a bagnomaria a 37 °C.
      2. Inserire la piastra della cartuccia nello strumento per calibrare il sensore. Dopo la calibrazione, sostituire la piastra della cartuccia con la piastra di coltura cellulare a una concentrazione finale dei seguenti componenti del kit: 10 mM di glucosio, 1 μM di oligomicina e 50 mM di 2-desossiglucosio (2-DG) (Figura 5A).
      3. Al termine del test, lisare le cellule e stimare il contenuto proteico totale.
    3. Per il test di stress dei mitocondri:
      1. Sostituire il terreno CNTF con un terreno basico integrato con 2 mM di glutammina, 1 mM di piruvato, 10 mM di glucosio (pH regolato a 7,4) a bagnomaria a 37 °C.
      2. Incubare la piastra in una camera non contenente CO2 a 37 °C per 1 ora. Nel frattempo, inserire la piastra della cartuccia nello strumento per calibrare il sensore.
      3. Dopo la calibrazione, sostituire la piastra della cartuccia con la piastra di coltura cellulare con una concentrazione finale dei seguenti componenti del kit: 1,5 μM di oligomicina, 1 μM di cianuro di carbonile-4 (trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP) e 0,5 μM di rotenone/antimicina A (Figura 5C).
      4. Al termine del test, lisare le cellule e stimare il contenuto proteico totale.

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Results

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Le colonie di cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) sono state mantenute utilizzando un terreno definito disponibile in commercio e immunocolorate per i marcatori di pluripotenza, Oct4 e Nanog (Figura 1B). Le APC FXS e CTRL hanno mostrato proporzioni comparabili altamente arricchite di cellule immunopositive per vimentina e NFIA (Figura 1C, D). Abbiamo scoperto che le APC derivate da hiPSC sane e F...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, descriviamo un metodo per generare astrociti umani derivati da iPSC che fungono da piattaforma di analisi per caratterizzare i cambiamenti funzionali indotti da FXS. Questi astrociti sono funzionalmente vitali in coltura e mostrano varie proprietà, come evidenziato da una serie di misurazioni effettuate nel presente studio. Un passaggio critico in questo protocollo è la conversione iniziale delle iPSC in corticosfere utilizzando il metodo del lifting enzimatico. In questa fase, è fo...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il Prof. Sumantra Chattarji per i fondi intramurali. Ringraziamo il Prof. Gaiti Hasan per l'accesso alla configurazione di imaging del calcio, al Central Imaging and Flow Facility-National Centre for Biological Sciences, a Padmanabh Singh e Prangya Hota per la correzione di bozze e i suggerimenti, e al team di Labmate Asia per l'assistenza nell'esecuzione dei saggi Seahorse XF.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-TiogliceroloSigma-AldrichM6145
Accutasi  soluzioneSigma-AldrichA6964Terreno di distacco cellulare enzimatico 
Adenosina 5′-trifosfato sale di magnesioSigma-AldrichA9187
Advanced DMEM/F-12ThermoFisher Scientific12634010
antibiotico-antimicotico (100x)ThermoFisher Scientific 15240062
B-27 Supplement (50x), senza sieroThermoFisher Scientific17504044
Albuminasierica bovinaSigma-AldrichA9418
Concentrato lipidico chimicamente definitoThermoFisher Scientific11905031
Collagenasi, tipo IV, polvereThermoFisher Scientific17104019
Desossiribonucleasi IWorthington Biochemical CorporationLK003170
DimetilsolfossidoSigma-AldrichD2650
Dispase II, polvereThermoFisher Scientific17105041
DPBS, senza calcio, senza magnesioThermoFisher Scientific14190144
Essential 8 MediumThermoFisher ScientificA1517001
FXS1, FXS2 Istituto Coriell di ricerca medica GM07072, GM05848cellule del paziente FXS
GlutaMAX IntegratoreThermoFisher Scientific35050061sostituto della glutammina
Ham's F-12 Nutrient MixThermoFisher Scientific11765054
Cellule di controllo sane Centro medico Cedars-Sinai ND30625cellule di controllo sane 
Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suinaSigma-AldrichH3149
IMDMThermoFisher Scientific12440053
Insulina, Roche umana11376497001
LDN 193189 Stratech ScientificS2618-SEL
Fattore inibitorio della leucemia umanoSigma-AldrichL5283
Matrigel  Matrice della membrana basale con fattore di crescita ridotto (GFR)Corning354230
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)ThermoFisher Scientific11140050
Proteina ricombinante FGF-basica di topo (FGF-2/bFGF)Peprotech450-33
Contenitore di congelamento Mr. FrostyIntegratore ThermoFisher Scientific5100-0001cryobox
N-2 (100x)ThermoFisher Scientific17502048
N-acetil-L-cisteinaSigma-AldrichA9165
Terreno neurobasaleThermoFisher Scientific21103049
Nunc Biobanche e colture cellulari Provette criogenicheThermoFisher Scientific377267
Nunc Piastra a 6 pozzetti trattata per colture cellulariThermoFisher Scientific140675
Sistema di dissociazione della papainaWorthington Biochemical CorporationLK003150
Penicillina-StreptomicinaThermoFisher Scientific15140122
Proteina CNTF umana ricombinante, CF R& D Systems257-NT-010
Proteina EGF umana ricombinante, CFR& D Systems236-EG-01M
Integratore RevitaCell (100x)ThermoFisher Scientific A2644501
SB431542Tocris1614
Seahorse XFe24 Analyzer Agilent Technologies
Seahorse XF Cell MitoAgilent Technologies103015-100
Kit per test da sforzo per glicolisi Seahorse XFAgilent Technologies103020-100
Piastre per colture tissutali - 100 cmBiostar LifetechTCD000100
TransferrinRoche10652202001
Rasoio VWR LameVWR International55411-050<
strong>Anticorpi 
Anticorpo primarioAziendaNumero di catalogoDiluizione
Oct4 (C-10)Santa Cruz Biotechnologysc-5279Diluizione: 1:250
Anticorpo secondario: IgG anti-topo di capra, Alexa Fluor 568
NanogR & D SystemsAF1997Diluizione: 1:100
Anticorpo secondario: Donkey anti-Goat IgG, Alexa Fluor 488
VimentinAbcamAb5733Diluizione: 1:500
Anticorpo secondario: Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488
NFIAAbcamAb1851Diluizione: 1:500
Anticorpo secondario: Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568
GFAP-cy3SigmaC9205Diluizione: 1:500
Anticorpo secondario: NA
GFAPDAKOZ0334Diluizione: 1:500
Anticorpo secondario: IgG anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 568
S100βDAKOIR504Diluizione: 1:500
Anticorpo secondario: IgG anti-coniglio di capra, anticorpo anti-nuclei Alexa Fluor 488
, clone 235-1Merck MilliporeMAB1281Diluizione: 1:1000
Anticorpo secondario: IgG1 anti-topo di capra, anticorpi secondari Alexa Fluor 5555
; Diluizione
Capra anti-Topo IgG, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110041:1000
Asino anti-Capra IgG, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110551:1000
Capra anti-pollo IgY, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110391:1000
IgG anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 568Thermo Fisher Scientific A110111:1000
IgG anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 488Thermo Fisher Scientific A110341:1000
Capra anti-Topo IgG1, Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific A211271:1000
Kit per test da sforzo

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Molecular of fragile X syndrome: A twenty-year perspective. Annu Rev Pathol. 7, 219-245 (2012).
  2. Wang, H., et al. Developmentally-programmed FMRP expression in oligodendrocytes: A potential role of FMRP in regulating translation in oligodendroglia progenitors. Hum Mol Genet. 13 (1), 79-89 (2004).
  3. Pacey, L. K. K., Doering, L. C. Developmental expression of FMRP in the astrocyte lineage: Implications for fragile X syndrome. Glia. 55 (15), 1601-1609 (2007).
  4. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  5. Allen, N. J., Barres, B. A. Neuroscience: Glia - more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
  6. Khakh, B. S., McCarthy, K. D. Astrocyte calcium signaling: From observations to functions and the challenges therein. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (4), a020404(2015).
  7. Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
  8. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  9. Rothstein, J. D., et al. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate. Neuron. 16 (3), 675-686 (1996).
  10. Almad, A., Maragakis, N. J. A stocked toolbox for understanding the role of astrocytes in disease. Nat Rev Neurol. 14 (6), 351-362 (2018).
  11. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: An underappreciated topic in neurobiology. Curr Opin Neurobiol. 20 (5), 588-594 (2010).
  12. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14 (5), 311-321 (2013).
  13. Bradley, R. A., et al. Regionally specified human pluripotent stem cell-derived astrocytes exhibit different molecular signatures and functional properties. Development. 146 (13), dev170910(2019).
  14. Das Sharma, S., et al. Astrocytes mediate cell non-autonomous correction of aberrant firing in human FXS neurons. Cell Rep. 42 (4), 112344(2023).
  15. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  16. Hu, X., et al. The JAK/STAT signaling pathway: from bench to clinic. Sig Transduct Target Ther. 6, 402(2021).
  17. Baser, A., et al. Onset of differentiation is post-transcriptionally controlled in adult neural stem cells. Nature. 566 (7742), 100-104 (2019).
  18. Pal, R., Bhattacharya, A. Modelling protein synthesis as a biomarker in fragile x syndrome patient-derived cells. Brain Sci. 9 (3), 1-12 (2019).
  19. Gross, C., Bassell, G. J. Excess protein synthesis in FXS patient lymphoblastoid cells can be rescued with a p110β-selective inhibitor. J Mol Med. 18 (3), 336-345 (2012).
  20. Kumari, D., et al. Identification of fragile X syndrome specific molecular markers in human fibroblasts: A useful model to test the efficacy of therapeutic drugs. Hum Mutat. 35 (12), 1485-1494 (2014).
  21. Jacquemont, S., et al. Protein synthesis levels are increased in a subset of individuals with fragile X syndrome. Hum Mol Genet. 27 (12), 2039-2051 (2018).
  22. Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24 (39), 8606-8620 (2004).
  23. Schmunk, G., Boubion, B. J., Smith, I. F., Parker, I., Gargus, J. J. Shared functional defect in IP3R-mediated calcium signaling in diverse monogenic autism syndromes. Transl Psychiatry. 5 (9), e643-e710 (2015).
  24. Peteri, U. K., et al. Generation of the human pluripotent stem-cell-derived astrocyte model with forebrain identity. Brain Sci. 11 (2), 209(2021).
  25. Alvarez-Mora, M. I., et al. Impaired mitochondrial function and dynamics in the pathogenesis of FXTAS. Mol Neurobiol. 54 (9), 6896-6902 (2017).
  26. Giulivi, C., et al. Mitochondrial dysfunction in autism. JAMA. 304 (21), 2389-2396 (2010).
  27. Anitha, A., et al. Brain region-specific altered expression and association of mitochondria-related genes in autism. Mol Autism. 3 (1), 12(2012).
  28. Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Front Neurosci. 11, 737(2018).
  29. Yao, J., et al. Mitochondrial bioenergetic deficit precedes Alzheimer's pathology in female mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (34), 14670-14675 (2009).
  30. Sonntag, K. C., et al. Late-onset Alzheimer's disease is associated with inherent changes in bioenergetics profiles. Sci Rep. 7 (1), 14038(2017).

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