Articolo metodologico

Rilevamento e isolamento del cancro nelle biopsie prostatiche utilizzando l'istologia Raman stimolata e l'intelligenza artificiale

DOI:

10.3791/68083

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10 giugno 2025

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1Genecentrix Inc., 2Vancouver Prostate Center, University of British Columbia, 3Invenio Imaging, 4Dept. of Urology, NYU Langone Health, 5Dept. of Radiology, NYU Langone Health, 6Dept. of Biomedical Engineering, NYU Langone Health, 7Dept. of Urologic Sciences, University of British Columbia

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un protocollo standardizzato per rilevare il cancro alla prostata utilizzando l'istologia Raman stimolata (SRH) su campioni bioptici grazie ai vantaggi rispetto all'istopatologia tradizionale, concentrandosi sulla preparazione del campione, sull'imaging e sull'intelligenza artificiale per migliorare il rapporto cancro-tessuto. Inoltre, supporta la biobanca per la trascrittomica, i modelli di organoidi o xenotrapianti e l'identificazione dei margini chirurgici intraoperatori.

Abstract

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Il cancro alla prostata rimane uno dei tumori maligni più diffusi che colpiscono gli uomini in tutto il mondo, rendendo la diagnosi precoce e i progressi nella medicina di precisione cruciali per un intervento e un trattamento efficaci. Viene presentato un protocollo standardizzato per l'utilizzo dell'istologia Raman stimolata (SRH) con intelligenza artificiale (AI) integrata nel rilevamento del cancro alla prostata, offrendo progressi significativi rispetto ai metodi istopatologici convenzionali. L'SRH fornisce questi progressi migliorando l'efficienza attraverso l'imaging quasi in tempo reale e senza marcatura di tessuti freschi e non colorati, eliminando così i ritardi associati all'analisi bioptica tradizionale.

Utilizzando la microscopia a diffusione Raman stimolata (SRS) per rilevare le frequenze vibrazionali specifiche dei legami CH2 associati ai lipidi e dei legami CH3 legati a proteine e DNA, è possibile differenziare i tessuti cancerosi e benigni nelle biopsie prostatiche. Il modello di intelligenza artificiale migliora ulteriormente la precisione diagnostica, raggiungendo un'accuratezza del 98,6% nell'identificazione del cancro alla prostata. Il protocollo delinea i passaggi essenziali per la preparazione dei campioni, l'imaging e l'analisi dei dati, facilitando il miglioramento dei processi di biobanca e consentendo applicazioni a valle, come la trascrittomica e gli studi sugli xenotrapianti. Questo approccio accelera il flusso di lavoro diagnostico e si mostra promettente per le applicazioni intraoperatorie, aiutando potenzialmente i chirurghi a identificare i margini positivi intraoperatori. Inoltre, la capacità di eseguire nuovamente la scansione e regolare i rapporti cancro/tessuto consente un'analisi più personalizzata dei campioni bioptici, migliorando il rilevamento del tumore nei tessuti non trattati. Ulteriori ricerche e convalide sono necessarie per l'adozione diffusa della SRH nella pratica clinica.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il cancro alla prostata rimane uno dei principali tumori maligni che colpiscono gli uomini a livello globale, con la diagnosi precoce che è fondamentale per il successo dell'intervento e del trattamento. Storicamente, la diagnosi di cancro alla prostata si è basata in larga misura sulla valutazione istopatologica dei campioni bioptici prostatici, più comunemente attraverso la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)2. Sebbene efficaci, i metodi tradizionali di analisi della biopsia prostatica comportano in genere un periodo di attesa da diversi giorni a settimane, a seconda della città o del paese, a causa di fattori procedurali e logistici. Questi ritardi derivano da molteplici fasi ad alta intensità di lavoro, tra cui la fissazione della formalina, l'inclusione di paraffina, il sezionamento e la colorazione H&E. Pertanto, il tempo di elaborazione cumulativo, aggravato dall'elevato volume di campioni bioptici, può ritardare la diagnosi e la pianificazione del trattamento.

I recenti progressi nelle tecnologie di imaging, in particolare la microscopia a diffusione Raman stimolata (SRS), possono trasformare le pratiche diagnostiche fornendo un metodo di imaging robusto, privo di background e facilmente interpretabile 3,4. SRS utilizza due raggi laser, il raggio della pompa (ωp) e il raggio di Stokes (ωs), che interagiscono con il campione. Quando la differenza di frequenza (Δω = ωp −ωs) corrisponde a una specifica frequenza vibrazionale molecolare (Ω), il segnale viene amplificato a causa del guadagno o della perdita Raman stimolata. Questo processo migliora il contrasto delle vibrazioni molecolari, consentendo un imaging altamente sensibile dei tessuti 3,4. La SRS consente di rilevare le vibrazioni molecolari associate alle vibrazioni di stretching CH2 (2.845 cm-1), correlate ai lipidi, e alle vibrazioni di stretching CH3 (2.930 cm-1), legate alle proteine e al DNA4. Il rilevamento del segnale SRS comporta tipicamente uno schema di trasferimento della modulazione ad alta frequenza, che consente un isolamento preciso dei deboli segnali vibrazionali dal rumore di fondo.

La microscopia SRS è dotata di funzionalità di sezionamento ottico che consentono un imaging tridimensionale preciso senza la necessità di sezionamento fisico dei tessuti. Ciò si ottiene allineando e focalizzando la pompa e i raggi laser Stokes in un punto limitato dalla diffrazione all'interno del campione, dove vengono eccitate specifiche vibrazioni molecolari. La natura confocale della SRS, derivata dalla sua dipendenza quadratica dall'intensità dei laser, assicura che i segnali siano confinati al piano focale, escludendo i contributi fuori fuoco e fornendo informazioni chimiche altamente localizzate 5,6. Questo imaging a profondità risolta preserva l'integrità dei tessuti eliminando il taglio meccanico, riducendo i tempi di elaborazione e mantenendo il contesto biologico e molecolare del campione.

Basandosi sui principi della SRS, l'istologia Raman stimolata (SRH) utilizza questi dati vibrazionali molecolari per creare immagini pseudo-H&E di tessuto fresco e non colorato in tempo reale, fornendo così ai medici strumenti diagnostici più rapidi ed efficienti 7,8. Questa capacità di generare immagini di alta qualità ha reso la SRH uno strumento indispensabile per la ricerca e le potenziali applicazioni cliniche9. Recentemente, la valutazione del margine intraoperatorio utilizzando SRH ha fornito un feedback patologico quasi in tempo reale durante l'ablazione parziale della ghiandola e la prostatectomia radicale, consentendo aggiustamenti immediati del trattamento10,11.

L'imager SRH sfrutta le vibrazioni molecolari intrinseche per fornire informazioni sulla composizione dei tessuti. L'SRH può essere utilizzato per differenziare efficacemente i tessuti prostatici cancerosi da quelli benigni analizzando le proprietà vibrazionali di CH2 e CH3 7,12. L'imager SRH cattura queste vibrazioni e produce immagini pseudo-H&E che migliorano il contrasto nucleare, fungendo da rapida alternativa all'istopatologia convenzionale e fornendo immagini di alta qualità in 2-8 minuti, a seconda delle dimensioni del tessuto 7,8.

È stata valutata l'efficacia della SRH per l'esame patologico rapido delle biopsie prostatiche non trattate. I patologi sono stati addestrati a interpretare le immagini SRH da nuclei bioptici prostatici ottenuti ex vivo da campioni di prostatectomia8. Il metodo di scansione SRH è stato ottimizzato per consentire l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione in pochi minuti, riducendo significativamente il tempo necessario rispetto all'istopatologia tradizionale. I campioni bioptici contenenti un mix di istologia benigna e maligna sono serviti come set di formazione per i patologi, che hanno poi eseguito una valutazione in cieco di una serie separata di biopsie visualizzate da SRH ed elaborate mediante colorazione H&E per fungere da verità di base. I risultati hanno mostrato che l'accuratezza media del patologo nell'identificare il cancro alla prostata era del 95,7%, con una buona concordanza nel rilevare tumori clinicamente significativi, indicando che l'SRH può supportare efficacemente la diagnosi quasi in tempo reale8.

Negli studi successivi, l'intelligenza artificiale (AI) è stata integrata per migliorare ulteriormente l'accuratezza diagnostica, l'efficienza e la facilità di implementazione. Questo modello di intelligenza artificiale utilizza tecniche di deep learning per analizzare le caratteristiche vibrazionali e morfologiche acquisite dall'SRH, consentendo la classificazione automatizzata dei campioni di biopsia prostatica in regioni benigne, cancerose e non diagnostiche, semplificando significativamente il processo di valutazione patologica9. L'integrazione SRH-AI ha dimostrato un'accuratezza impressionante, raggiungendo il 96,5% nel rilevamento del cancro alla prostata, con tassi di sensibilità e specificità rispettivamente del 96,3% e del 96,6%9. Integrando l'intelligenza artificiale con l'SRH, è stato raggiunto un rendimento diagnostico che corrisponde a quello di patologi esperti.

Attraverso l'ampia valutazione della SRH con i patologi e lo sviluppo di un modello di intelligenza artificiale integrato nell'imager SRH, le capacità di questa tecnologia sono state notevolmente avanzate. Questo protocollo delinea i passaggi dettagliati per la preparazione dei campioni di biopsia prostatica, l'imaging utilizzando l'imager SRH e l'analisi dei dati con strumenti assistiti dall'intelligenza artificiale. Seguendo questi passaggi, ricercatori e medici possono sfruttare questa nuova tecnica per migliorare il rilevamento, la ricerca e il trattamento del cancro alla prostata.

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Protocollo

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Questo protocollo prevede l'uso di campioni umani e aderisce alle linee guida per la cura umana dell'Università della British Columbia. La ricerca è stata approvata dall'Institutional Review Board (IRB) con i seguenti numeri di approvazione etica: SRH: H23-00459, AI: H24-00585 e Biobank: H21-03722. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i soggetti umani prima della raccolta dei campioni. Tutte le procedure sono state condotte nel rispetto degli standard etici istituzionali e normativi per garantire la tutela e la riservatezza dei partecipanti.

1. Accendere l'imager SRH

  1. Accendere l'imager SRH (Figura 1A). Lasciare che il sistema si riscaldi per 30 minuti per garantire che il laser raggiunga la temperatura operativa ottimale per un imaging accurato.

2. Preparare la camera del fluido

  1. Collegare una siringa da 50 ml riempita con acqua sterilizzata alla valvola della siringa sul lato sinistro dell'interfaccia dell'imager SRH (Figura 1B). Assicurarsi che la siringa sia inserita saldamente per mantenere una corretta circolazione del fluido.

3. Accedi al sistema

  1. Una volta caricato il sistema, utilizzare il monitor touchscreen per inserire il nome utente e la password.
  2. Seleziona il nome utente appropriato e digita la password. Tocca Accedi.
  3. Accettare l'esclusione di responsabilità per riconoscere che lo studio è a scopo di ricerca se utilizzato al di fuori degli Stati Uniti o dell'Unione Europea.

4. Crea un nuovo studio

  1. Selezionare Crea nuovo studio dalle opzioni di visualizzazione: Crea nuovo studio, Continua studio esistente e Visualizza studio esistente.

5. Inserisci le informazioni sul caso

  1. Inserisci le informazioni rilevanti sul caso, tra cui cognome, nome, numero di cartella clinica, data di nascita, numero di accesso, ID dello studio, nome del medico, numero di stanza, posizione anatomica primaria e modulo di analisi.
  2. Salvare i campioni come John Doe (ad esempio).
  3. In Posizione anatomica primaria, selezionare Prostata (solo per uso di ricerca).
  4. Per Modalità analisi, scegliere Cancro alla prostata (solo per uso di ricerca) per utilizzare l'intelligenza artificiale integrata per il rilevamento del cancro alla prostata.

6. Finalizzare la creazione dello studio e riempire la camera del fluido

  1. Tocca Crea studio dopo aver inserito le informazioni sul caso.
  2. Quando richiesto dal sistema, toccare Riconosci per confermare che i dati verranno utilizzati solo a scopo di ricerca.
  3. Riempire la camera del fluido con acqua sterilizzata come indicato.
  4. Tocca Avanti quando richiesto, quindi seleziona Acquisisci dalle opzioni visualizzate.
  5. Toccare Carica nuovo campione per visualizzare Prepare Specimen & Load NIO Slide.

7. Preparazione del campione e del vetrino

  1. Recuperare il vetrino per biopsia prostatica. Utilizzare una pinza per tessuti con i denti per aprire con cautela il vetrino coprioggetti allegato. Tenendo aperti il vetrino e il vetrino coprioggetti, utilizzare la pinza per tessuti per posizionare saldamente la biopsia prostatica dal terreno RPMI nella scanalatura del vetrino. Chiudere delicatamente il vetrino coprioggetti e fissare il campione.
  2. Aprire il supporto per diapositive sull'interfaccia dell'imager SRH e inserire la diapositiva preparata nel supporto per diapositive, assicurandosi che sia allineata correttamente. Chiudere il coperchio dell'imager SRH. Quando il sistema rileva il coperchio chiuso, toccare Avanti per procedere.

8. Impostare i parametri di acquisizione delle immagini

  1. Impostare i seguenti parametri di imaging:
    1. Per il nome del campione: selezionare Biopsia 1 A per la prima biopsia.
    2. Per l'area di scansione: selezionare 0,4 mm x 6,1 mm, 3 regioni (solo per uso di ricerca) per eseguire la scansione dell'intera biopsia.
    3. Per la posizione di scansione: utilizzare l'immagine sullo schermo per regolare manualmente la posizione di scansione.
  2. Tocca Acquisisci immagine per procedere.
  3. Esaminare i dettagli dell'esempio visualizzati sullo schermo e confermare selezionando Procedi.

9. Acquisisci l'immagine SRH

  1. Consenti all'imager SRH di mettere a fuoco automaticamente e acquisire le immagini generando l'immagine SRH finale.
  2. Lasciare che l'imager esegua la scansione della biopsia in tre sezioni (scansione 1, scansione 2 e scansione 3) come mostrato nella Figura 2A.
  3. Lascia che l'imager combini le sezioni per formare un'immagine SRH completa (Figura 2B), producendo un'immagine pseudo-H&E per la valutazione.

10. Visualizzazione dell'immagine SRH

  1. Visualizza l'immagine SRH della biopsia prostatica fresca e non colorata. L'immagine imita la colorazione H&E utilizzando una combinazione di colori rosa/viola che evidenzia le vibrazioni molecolari CH2 (associate ai lipidi) e le vibrazioni molecolari CH3 (relative alle proteine e al DNA).

11. Interpretazione dell'IA dell'immagine SRH solo per uso di ricerca

  1. Applica la sovrapposizione AI facendo clic sull'icona (>>) sullo schermo. La sovrapposizione AI identifica le regioni tumorali in rosso, le regioni non tumorali in verde e le regioni non diagnostiche in viola (Figura 3A).
  2. Esamina il grafico a barre che quantifica la percentuale di tessuto tumorale, tessuto non tumorale e tessuto non diagnostico (Figura 3B).
  3. Torna all'immagine SRH originale senza la sovrapposizione AI facendo clic sull'icona (<<).

12. Zoom e navigazione dell'immagine SRH

  1. Utilizza le funzioni di zoom avanti e indietro sul touchscreen per esplorare in dettaglio le diverse regioni della biopsia.
  2. Utilizzare le icone di navigazione per spostarsi nell'immagine per un esame completo del campione bioptico.

13. Isolamento del tessuto selezionato

  1. Dopo la scansione iniziale, rimuovere con cautela la biopsia dal vetrino. Utilizzare una pinza per tessuti con i denti per sollevare il vetrino coprioggetti attaccato e rilasciare delicatamente la biopsia.
  2. Posizionare la biopsia su un Telfa inumidito imbevuto di soluzione salina per mantenere l'integrità dei tessuti durante il processo di rifinitura.
  3. Utilizzare una lama chirurgica per tagliare le aree non oncologiche identificate nella sovrapposizione generata dall'intelligenza artificiale dell'immagine SRH valutando visivamente la sovrapposizione per determinare le regioni ottimali per la rimozione. Concentrati sulla rimozione delle aree tipicamente situate alle estremità della biopsia per aumentare il rapporto cancro-tessuto. Assicurarsi che sia rimasta una quantità sufficiente di tessuto per la nuova scansione.

14. Ripetere la scansione della biopsia

  1. Ripetere la scansione della biopsia seguendo la stessa procedura descritta nei passaggi 9-11.
  2. Regolare l'area e la posizione della scansione per confermare un aumento del rapporto cancro/tessuto (visto nella Figura 3C-E). Esamina l'immagine SRH aggiornata e l'overlay AI per verificare le percentuali di regioni tumorali e non tumorali.
  3. Ripetere il ritaglio e ripetere la scansione fino a raggiungere il rapporto desiderato.

15. Biobanche e crioconservazione

  1. Rimuovere la biopsia dal vetrino utilizzando una pinza per tessuti con i denti . Posizionare la biopsia in un criotubo.
  2. Congelare la crioprovetta in azoto liquido per garantire una rapida conservazione del campione.
  3. Trasferire la crioprovetta in azoto liquido in un congelatore a -80 °C o in un impianto di stoccaggio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

16. Esporta i dati dell'immagine

  1. Tocca l'icona dell'aeroplano di carta per esportare i dati dell'immagine per l'archiviazione e ulteriori analisi.
  2. Per selezionare la posizione di esportazione, tocca l'opzione Seleziona posizione di esportazione e scegli tra USB (deidentificato), USB (completo) e iPhone (completo). Seleziona USB (Completo) e scegli un disco rigido esterno per l'esportazione dei dati.
  3. Per selezionare la serie di immagini da esportare, selezionare Intero studio per esportare tutte le serie di immagini SRH per il paziente anziché una serie specifica.
  4. Attendi che il sistema visualizzi Esportazione in corso e tocca Conferma una volta completata l'esportazione.

17. Spegnere il microscopio SRH

  1. Tocca Esci e segui le istruzioni di spegnimento visualizzate sullo schermo.
  2. Selezionare Procedi senza quando viene richiesto di archiviare i dati dell'immagine (se già esportata).
  3. Smaltire il campione secondo gli appositi protocolli di laboratorio.
  4. Toccare Avanti e svuotare la camera del fluido utilizzando la siringa collegata, come indicato.
  5. Tocca Avanti quando richiesto, quindi seleziona Sì dalle opzioni visualizzate.
  6. Rimuovere e smaltire la siringa.
  7. Toccare Spegni per spegnere completamente il microscopio SRH.

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Risultati

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L'applicazione della SRH integrata con l'intelligenza artificiale ha dimostrato la rapida rilevazione e caratterizzazione del cancro alla prostata all'interno di campioni bioptici in pochi minuti. La Figura 2A delinea la procedura di scansione in più fasi dell'imager SRH, in cui sono state eseguite tre scansioni distinte (scansione 1, scansione 2 e scansione 3) sul campione bioptico. Ogni scansione ha acquisito firme vibrazionali molecolari uniche corrispondenti al contenuto di lipidi, prote...

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Discussione

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Il protocollo SRH per il rilevamento del cancro alla prostata rappresenta un progresso significativo nell'imaging medico e nell'istopatologia. L'SRH consente l'imaging quasi in tempo reale e senza marcatura di tessuti freschi e non colorati, consentendo una rapida rilevazione del cancro di tessuti non trattati senza i ritardi associati ai metodi istopatologici tradizionali 3,4,5,6,7,8,9.

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Dichiarazioni

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C. Freudiger è un dipendente, azionista e direttore di Invenio Imaging e detiene brevetti sulla microscopia spettroscopica Raman stimolata con licenza indipendente. A. Ion-Margineanu è un azionista di Invenio Imaging.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Riconosciamo i contributi del team di ricerca del Vancouver Prostate Centre e della NYU Langone Health e il supporto tecnico fornito da Invenio Imaging. Questo lavoro è stato finanziato dal British Columbia Ministry of Health Innovation Hub.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Contenitore di azoto liquido da bancoTermo Scientifico11-670-4B
CitotuboGreiner Bio-One126279
Dumont #5 Pinze finiStrumenti per la scienza11254-20
Vetrino per biopsia prostatica NIOInvenio Imaging, Inc.AT0013
Soluzione RPMIThermo Fisher Scientifico11875093
Soluzione salinaBaxter
SRH Imager (sistema di imaging laser NIO)Invenio Imaging, Inc.
Lama chirurgicaFisher Scientifico501094395

Riferimenti

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  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).
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  3. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nat Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
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  9. Mannas, M. P., et al. Stimulated Raman histology interpretation by artificial intelligence provides near-real-time pathologic feedback for unprocessed prostate biopsies. J Urol. 211 (3), 384-391 (2024).
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