Effetti della shikonina sulla via di segnalazione HIF-1α/VEGF nei topi con danno polmonare acuto causato da sepsi

Sommario

Il protocollo mira a valutare l'efficacia della shikonin nell'alleviare il danno polmonare acuto causato dalla sepsi nei topi. Mirando alla via HIF-1α/VEGF, lo studio indaga come diverse dosi di shikonin influenzino i tassi di sopravvivenza, la patologia polmonare e l'espressione di marcatori infiammatori, evidenziando i suoi potenziali benefici terapeutici.

Abstract

La sepsi causa spesso lesioni polmonari acute (ALI), una complicanza ad alta mortalità. La via HIF-1α/VEGF svolge un ruolo chiave nella sepsi e la shikonina, un composto naturale con proprietà antinfiammatorie, può alleviare il danno polmonare prendendo di mira questa via. I topi Balb/c sono stati divisi casualmente in quattro gruppi: gruppo fittizio, gruppo modello, gruppo di trattamento a basso dosaggio e gruppo di trattamento ad alto dosaggio. Il gruppo fittizio è stato sottoposto a laparotomia senza legatura e puntura cecale (CLP), mentre il gruppo modello è stato sottoposto a CLP per indurre un danno polmonare acuto correlato alla sepsi. Dopo la modellazione, i gruppi di trattamento a basso dosaggio e ad alto dosaggio hanno ricevuto shikonin mediante sonda gastrica a dosi di 12,5 mg/kg e 50 mg/kg, rispettivamente, una volta al giorno per 14 giorni. È stato monitorato il tasso di sopravvivenza a 7 giorni dei topi. La colorazione con ematossilina ed eosina (HE) è stata utilizzata per valutare la patologia del tessuto polmonare, è stato misurato il rapporto peso umido/secco (W/D) del polmone ed è stato eseguito un Western blot per rilevare l'espressione di HIF-1α, VEGF, TNF-α e IL-6 nel tessuto polmonare. La shikonin ha migliorato significativamente il tasso di sopravvivenza dei topi settici, con l'effetto maggiore osservato nel gruppo ad alto dosaggio (p < 0,05). Rispetto al gruppo modello, il rapporto W/D polmonare e il danno tissutale nei gruppi trattati con shikonina sono stati significativamente ridotti in modo dose-dipendente. Inoltre, la shikonina ha significativamente ridotto l'espressione di HIF-1α, VEGF, TNF-α e IL-6, con il gruppo ad alto dosaggio che ha mostrato la riduzione più pronunciata (p < 0,05). La shikonin allevia il danno polmonare acuto nei topi settici, potenzialmente inibendo l'espressione di HIF-1α e riducendo la produzione di fattori infiammatori correlati.

Introduzione

La sepsi è una grave risposta infiammatoria sistemica innescata da un'infezione. ¹ Spesso porta a disfunzioni multiorgano e può diventare pericolosa per la vita con il progredire della condizione. ² Nonostante l'uso di terapie come la ventilazione meccanica e la terapia di supporto, i tassi di mortalità per ALI associata a sepsi rimangono elevati, raggiungendo il 30%-40%³. Questi trattamenti affrontano principalmente i sintomi piuttosto che le cause sottostanti, limitandone l'efficacia complessiva. Pertanto, l'identificazione di nuovi approcci terapeutici mirati alle cause del danno polmonare potrebbe migliorare significativamente gli esiti dei pazienti nella sepsi.

Studi recenti hanno identificato il fattore inducibile dall'ipossia-1α (HIF-1α) come un regolatore critico nella progressione dell'ALI ^4,5 indotta dalla sepsi. HIF-1α si accumula nel tessuto polmonare durante la sepsi, guidando l'espressione dei geni a valle che esacerbano l'infiammazione e il danno tissutale⁶. Questo processo contribuisce in modo significativo al peggioramento del danno polmonare. Pertanto, il targeting della via di segnalazione HIF-1α offre un approccio promettente per mitigare le risposte infiammatorie e ipossiche osservate nell'ALI indotta da sepsi.

Nella ricerca di trattamenti più efficaci, la medicina tradizionale cinese (MTC) ha fornito preziose intuizioni ^7,8. La shikonina è un composto antrachinonico estratto dal Lithospermum erythrorhizon⁷. Mostra notevoli effetti antinfiammatori⁹, antibatterici¹⁰ e antitumorali¹¹. La shikonina può alleviare il danno polmonare indotto dal lipopolisaccaride (LPS), suggerendo il suo potenziale ruolo terapeutico nelle condizioni polmonari¹². Allo stesso tempo, alcuni studi hanno anche proposto che la shikonina possa alleviare il danno ossidativo causato dalla sepsi regolando il sistema macrofagico mononucleare, bilanciando le risposte pro-infiammatorie e anti-infiammatorie. Tuttavia, i meccanismi alla base degli effetti protettivi della shikonina nell'ALI indotta dalla sepsi non sono completamente compresi. Ciò rappresenta una lacuna critica nella ricerca attuale.

In questo studio, miriamo a esplorare gli effetti protettivi della shikonina in un modello murino di ALI indotta da sepsi utilizzando la legatura e la puntura cecale (CLP). La tecnologia CLP svolge un ruolo importante nella ricerca sulla sepsi in quanto può simulare complesse risposte infiammatorie sistemiche e disfunzioni multiorgano, rendendola adatta per valutare l'efficacia di nuove strategie di trattamento. La tecnologia CLP è relativamente più rilevante dal punto di vista clinico rispetto ai tradizionali metodi di iniezione di LPS: simula la risposta infiammatoria sistemica causata dalla traslocazione del microbiota intestinale, che è più vicina al processo patologico della sepsi clinica. Può essere classificato e controllato: regolando la lunghezza della legatura e la dimensione della perforazione, è possibile controllare la gravità della malattia ed è adatto per l'intero studio della sepsi. Inoltre, può simulare cambiamenti dinamici simili nella disfunzione multiorgano e nella risposta alle citochine. Studiando il ruolo della shikonina nella modulazione della via di segnalazione HIF-1α/VEGF, speriamo di fornire informazioni su nuove strategie terapeutiche che affrontino i meccanismi alla base del danno polmonare correlato alla sepsi, migliorando potenzialmente i risultati clinici.

Protocollo

Il protocollo ha ottenuto l'approvazione dal Centro Sperimentale per gli Animali dell'Università di Medicina di Wenzhou. Nel presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6 (5-6 mesi; 20-25 g). I dettagli dei principali reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione del modello murino di sepsi

1. Topi domestici a una temperatura costante di 25 °C, 50% di umidità e un ciclo luce/buio di 12 ore.
2. Dopo un periodo di acclimatazione di 7 giorni, dividere casualmente i topi in quattro gruppi: gruppo fittizio, gruppo modello, gruppo di trattamento a basso dosaggio e gruppo di trattamento ad alto dosaggio, con 20 topi in ciascun gruppo.
3. Sulla base dei riferimenti di uno studio precedente¹³, trattare il gruppo a basso dosaggio con una concentrazione di 12,5 mg/kg di porporina per 14 giorni e il gruppo ad alto dosaggio con una concentrazione di 50 mg/kg per 14 giorni. Per il gruppo di chirurgia fittizia, eseguire la laparotomia, la trazione cecale, la riduzione e la chiusura senza legatura o puntura e trattare con la stessa dose di soluzione fisiologica per 14 giorni. Le fasi sperimentali per il gruppo di sepsi sono le seguenti.
4. Dopo il digiuno notturno (l'acqua era consentita), anestetizzare i topi con pentobarbital di sodio (40-80 mg/kg) in condizioni sterili durante tutto il processo. Applicare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
5. Controllare una corretta anestesia in quanto rallentamento della frequenza respiratoria, diminuzione della tensione muscolare e assenza di risposta evidente allo stress quando si bloccano leggermente gli arti inferiori con una pinza emostatica.
6. Eseguire la disinfezione con etanolo al 75%, 3x. Praticare un'incisione longitudinale di circa 1 cm nella posizione centro-sinistra dell'addome del topo e tagliare la pelle, la fascia e i muscoli a strati per esporre la cavità addominale.
7. Usando una pinza oftalmica a punta smussata con entrambe le mani, esplorare delicatamente la cavità addominale, individuare e liberare il cieco del topo e legarlo a una distanza di circa 1 cm dall'estremità del cieco.
8. Utilizzare un ago da 21 G per perforare e legare l'estremità del cieco, spremere delicatamente una piccola quantità di contenuto intestinale dal sito di puntura utilizzando una pinza oftalmica a punta smussata e quindi recuperarla nel cieco.
9. Eseguire la rianimazione con liquidi sottocutanei con 1 mL di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Notiamo che l'animale che ha subito un intervento chirurgico non viene restituito alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso.
10. Dopo 7 giorni di modellazione CLP, somministrare un'anestesia eccessiva per l'eutanasia.
    NOTA: A causa dei possibili effetti irritanti della porporina sulla pelle, sul tratto respiratorio e sul tratto digestivo, nonché della sua elevata tossicità per gli organismi acquatici, l'inquinamento ambientale, utilizzare la protezione personale durante l'esperimento.

2. Valutazione di modelli animali

1. Osservazione della sopravvivenza dei topi
   1. Eseguire la movimentazione degli animali come descritto sopra. Registra il tasso di mortalità entro 1 settimana dalla modellazione per l'analisi statistica. Alcuni topi muoiono senza sepsi prima dell'eutanasia, mentre i topi modello CLP hanno un certo tasso di mortalità (Tabella 1).
   2. Misurazione del rapporto tra peso umido e secco del polmone
      1. Dopo 24 ore di modellazione, anestetizzare nuovamente i topi secondo i passaggi 1.4-1.5.
      2. Praticare un'incisione longitudinale di circa 1 cm sul lato sinistro della linea mediana della clavicola del topo e rimuovere la pelle, la fascia e gli strati muscolari per esporre la cavità toracica con forbici chirurgiche e pinze.
      3. Rimuovere il polmone sinistro e drenare il liquido superficiale. Misurare il peso umido e poi asciugarlo in forno a 80 °C per 72 ore a peso costante per ottenere il peso secco.
      4. Calcola il contenuto di acqua polmonare come:
         Contenuto di acqua polmonare = (Peso umido - Peso secco) / Peso umido x 100%.
   3. Confronto istopatologico dei tessuti polmonari
      1. In un momento specificato, prelevare il polmone sinistro come descritto sopra al punto 2.2. Fissare il polmone in formaldeide neutra al 10%, incorporarlo nella paraffina e sezionarlo a uno spessore di 5 μm.
      2. Decerare il polmone in xilene, 2 volte, per 5-10 minuti ogni volta. Eseguire la reidratazione in serie con etanolo al 100%, 95%, 85% e 75%, per 3 minuti per gradiente. Immergere in acqua distillata per 2 minuti.
      3. Colorare con circa 100 ml di soluzione di ematossilina per 10 minuti, quindi risciacquare con acqua distillata per rimuovere il colore fluttuante.
      4. Aggiungere circa 70 mL della soluzione di differenziazione e immergere per 30 s. Quindi, immergere in acqua del rubinetto 2 volte, ogni volta per 3-5 minuti.
      5. Aggiungere circa 100 ml di soluzione di colorante eosina goccia per 2 minuti. Versare la soluzione colorante in eccesso e disidratare rapidamente come descritto di seguito.
      6. Eseguire la disidratazione, la trasparenza e la sigillatura come descritto di seguito.
         1. Immergere i campioni in etanolo a gradiente: etanolo (I) al 75%, 85%, 95% e 100% per 2-3 secondi ciascuno. Immergere in etanolo (II) al 100% per 1 minuto e immergere nello xilene 2 volte per 1 minuto ogni volta. Utilizzando una cannuccia o un contagocce, sgocciolare la gomma neutra sulla superficie delle fette di tessuto e distribuirla uniformemente il più possibile per evitare la formazione di bolle. Sigillare e osservare al microscopio a 400x.
      7. Selezionare 10 campi casuali per sezione polmonare. Chiedi a un patologo di valutare i cambiamenti patologici come l'edema alveolare, l'emorragia e l'infiltrazione dei neutrofili da 0 (normale) a 4 (danno grave). Utilizzare il punteggio totale per la valutazione.
   4. Western blotting
      1. Estrarre le proteine nucleari dal tessuto polmonare secondo le istruzioni del kit di estrazione delle proteine nucleari e misurare la concentrazione di proteine utilizzando il metodo BCA secondo le istruzioni del produttore.
      2. Preparare campioni di carico proteico con 50 μg di proteine caricate per campione. Preparare il gel separatore SDS-PAGE (10%) e il gel impilabile (3%). Eseguire l'elettroforesi a 80 V per 45 minuti, quindi trasferire la proteina alla membrana in PVDF a 110 V per 60 minuti dopo che i campioni sono entrati nel gel di separazione.
      3. Trasferire le proteine su una membrana e bloccarle per 60 minuti. Incubare con anticorpi primari (vedi Tabella dei materiali, 1:1000) per una notte a 4 °C, seguito da incubazione degli anticorpi secondari (vedi Tabella dei materiali, 1:1000) a 37 °C per 2 ore.
      4. Lavare la membrana con TBST e utilizzare ECL per la visualizzazione. In una camera buia, aggiungere i reagenti preparati su una membrana in PVDF ed eseguire l'imaging a fluorescenza e agitazione. I reagenti ECL interagiscono con le biomolecole sulla membrana, producendo forti reazioni di chemiluminescenza, che vengono registrate da strumenti di imaging a fluorescenza.
      5. Analizzare il valore della scala di grigi delle bande proteiche utilizzando un sistema di analisi delle immagini, metodo di quantificazione delle bande (per informazioni dettagliate sul sistema utilizzato per l'analisi della densitometria delle bande, vedere Immagine NIH).
   5. Analisi statistica
      1. Utilizzare SPSS 26.0 per l'analisi statistica. Usa l'ANOVA unidirezionale per confrontare le medie di più gruppi e i test LSD-t per confronti a coppie. Considera un valore p < 0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

Per valutare il potenziale terapeutico della shikonina, abbiamo prima valutato il suo effetto sulla sopravvivenza nei topi settici per un periodo di 7 giorni. Il trattamento con shikonin ha migliorato i tassi di sopravvivenza in modo dose-dipendente (Figura 1).

Data la diffusa presenza di lesioni polmonari nella sepsi, abbiamo anche valutato l'edema polmonare nei topi. L'edema polmonare è stato valutato misurando il rapporto tra peso umido e secco...

Discussione

Come modello gold standard per la ricerca sulla sepsi, il modello CLP è un passo fondamentale in questo esperimento perché il CLP imita la complessità della sepsi umana meglio di molti altri modelli. L'ALI associata alla sepsi rimane una sfida clinica critica a causa dei suoi alti tassi di mortalità e della limitata efficacia dei trattamenti attuali^14,15. Il nostro studio dimostra, per la prima volta, che la shikonina migliora si...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
H& Kit colorante E kit di colorazione	Solaibao Technology	G1120HE
Centrifuga a bassa temperatura	Sigma	3K15
Lettore di micropiastre	Bio-Rad	Modello 680
coniglio monoclonale VEGF-recettore1 anticorpo	Abcam	ab238632
coniglio policlonale HIF-1α anticorpo	Abcam	ab51608
SDS-PAGE sistema di elettroforesi	Bio-Rad	MINI Protean2
Shikonin	MedChemExpress	HY-N0822