Articolo metodologico

Mucosa orale come metodo alternativo per la somministrazione di prodotti a base di cannabis nei roditori

DOI:

10.3791/68104

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22 agosto 2025

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1Laboratório de Neuroquímica, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Laboratório Intermediário de Neuropatologia Experimental, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro

In questo articolo

Sommario

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La somministrazione orale tramite sonda gastrica nei roditori può indurre angoscia associata alla contenzione. Abbiamo esplorato la somministrazione oromucosa/buccale di estratto di cannabis arricchito con CBD, in cui i ratti sono stati trattati per 15 giorni con l'estratto a 3 mg/kg/giorno. I trattamenti sono stati somministrati per via orale con una micropipetta, utilizzando una tecnica di tocco affettuoso per maneggiare gli animali.

Abstract

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La somministrazione orale di farmaci in roditori da laboratorio come i ratti viene convenzionalmente eseguita utilizzando la tecnica del gavage. Nonostante l'efficacia, la sonda gastrica può indurre angoscia associata alla contenzione, soprattutto in seguito a ripetute manipolazioni di animali. Per mitigare questi effetti avversi e ridurre la morbilità associata ai metodi tradizionali, abbiamo esplorato la somministrazione oromucosa/buccale di estratto di cannabis arricchito con cannabidiolo (CBD). Con questo metodo, i ratti maschi sono stati trattati quotidianamente per 15 giorni con trigliceridi a catena media (MTC) derivati dall'olio di cocco o dall'estratto di cannabis arricchito con CBD. Ogni trattamento è stato somministrato individualmente mentre gli animali sono stati delicatamente immobilizzati utilizzando una tecnica di tocco affettuoso. La somministrazione ha comportato l'utilizzo di una micropipetta per applicare la formulazione oleosa direttamente nella mucosa orale. Il dosaggio è stato calcolato in base alla concentrazione di CBD nell'estratto di Cannabis, standardizzata a 3 mg/kg/die. Per garantire l'accuratezza, gli animali sono stati pesati quotidianamente, consentendo aggiustamenti della dose in base alle variazioni di peso durante il periodo di trattamento. Questo metodo offre un trattamento non invasivo e che riduce lo stress, migliorando potenzialmente il benessere animale in contesti sperimentali. Il trattamento con estratto di cannabis arricchito con CBD è risultato sicuro e l'analisi dell'ippocampo di questi animali ha mostrato alterazioni nei livelli di espressione delle proteine GluA1 e GFAP, che sono direttamente associate rispettivamente alla funzionalità del recettore glutammatergico e alla neuroinfiammazione. Ciò suggerisce che l'estratto di cannabis potrebbe essere applicato in condizioni patologiche in cui si osservano eccitotossicità glutammatergica e astrogliosi.

Introduzione

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La somministrazione di medicinali e sostanze con potenziale terapeutico negli animali da laboratorio è ancora una componente fondamentale nel disegno sperimentale della ricerca preclinica. Sebbene i metodi comuni includano iniezioni intraperitoneali, sottocutanee o sonda orale, spesso presentano limitazioni nella loro capacità traslazionale a causa di problemi di benessere indotti dallo stress negli animali 1,2. Inoltre, queste vie di somministrazione non sempre riflettono la via che sarà raccomandata per l'uso nell'uomo, influenzando potenzialmente l'applicabilità dei risultati in ambito clinico. I roditori, in particolare, svolgono un ruolo cruciale in queste indagini, fungendo da organismi modello per simulare scenari clinici umani. Per garantire la validità e l'affidabilità di questi studi, è imperativo creare condizioni sperimentali che riducano al minimo lo stress sugli animali da ricerca e imitino l'uso umano di tali sostanze. Inoltre, esistono diversi protocolli di somministrazione dei farmaci e questa scelta richiede un'attenta considerazione e pianificazione per ottimizzare la somministrazione della sostanza all'animale, riducendo al minimo le potenziali esperienze avverse della procedura3.

In questo contesto, l'obiettivo era quello di creare un protocollo che imitassela somministrazione di 4,5 di estratto di cannabis per mucosa orale, simile all'attuale pratica clinica 6,7,8,9, facilitando i trattamenti a lungo termine nei ratti10. L'immobilizzazione mediante tocco affettivo viene eseguita in modo tale che la pelle dietro il collo dell'animale venga delicatamente tirata all'indietro e vengano sollevati sopra le loro gabbie fino a quando le loro code smettono di toccare la lettiera per simulare il modo in cui le madri portano i loro cuccioli. Utilizzando una micropipetta, l'estratto di Cannabis, una soluzione oleosa, viene depositato con precisione nella loro cavità orale, toccando il rivestimento interno della guancia, seguito dal ritorno dei ratti nelle loro gabbie. Questo approccio non solo mira a evitare lo stress e potenzialmente a migliorare il benessere degli animali coinvolti, ma allinea anche i metodi preclinici più strettamente con le pratiche cliniche. L'indagine ha dimostrato che i ratti sani sottoposti a questo protocollo di somministrazione per mucosa orale e trattati con estratto di cannabis hanno mostrato significative modifiche neurochimiche10. Queste alterazioni suggeriscono un potenziale effetto neuroprotettivo del trattamento. In particolare, è stato scoperto che gli estratti di cannabis arricchiti con CBD modulano l'architettura molecolare delle sinapsi glutammatergiche, regolano l'espressione di GFAP negli astrociti e alterano la morfologia delle cellule microgliali. Sorprendentemente, questi adattamenti neurochimici e cellulari si sono verificati in assenza di cambiamenti comportamentali osservabili, sottolineando l'impatto biochimico sfumato del trattamento10.

Le piante di cannabis sono ampiamente conosciute per le loro proprietà medicinali, che sono state esplorate fin dall'antichità11, ma solo negli ultimi decenni la loro composizione biochimica e il potenziale farmacologico sono stati studiati più ampiamente 12,13,14. I principali fitocannabinoidi, il cannabidiolo (CBD) e il Δ 9-tetraidrocannabinolo (Δ9-THC), oltre a fitocannabinoidi e terpeni minori, sono responsabili di una miriade di effetti terapeutici descritti per diverse patologie 15,16,17. In questo senso, l'uso di prodotti a base di Cannabis nella pratica clinica è stato approvato e raccomandato per diverse condizioni cliniche 6,7,8,18. Oltre a questi progressi clinici, c'è stata un'impennata nella ricerca preclinica che utilizza prodotti a base di cannabis 9,19,20,21. Tali studi sono preziosi per valutare le risposte fisiologiche, i potenziali effetti avversi e i cambiamenti comportamentali22. La via di somministrazione del farmaco è una componente fondamentale degli studi e, in letteratura, diversi approcci terapeutici vengono utilizzati per somministrare fitocannabinoidi o prodotti a base di cannabis, come l'inalazione23,24 (o fumo), l'iniezione intraperitoneale25, le minipompe 26,27,28 e la sonda gastrica 29. Queste tecniche variano in complessità, durata del trattamento e tempo di completamento e producono diversi tempi di risposta fisiologica, influenzando il comportamento degli animali. Inoltre, errori nell'applicazione di queste tecniche possono portare a un trattamento inefficace, un'elevata variabilità nello studio e persino la morte dell'individuo 3,30,31,32,33,34.

Ci sono state prove crescenti che dimostrano che la stimolazione delle meccano-afferenze può essere mirata a ridurre lo stress non solo nei roditori ma anche nell'uomo. Pertanto, il contatto fisico modula anche le caratteristiche psicologiche oltre al solo impatto sulla stimolazione nervosa, contribuendo a migliorare le menomazioni causate da stress lieve a lungo termine 35,36,37. Questo metodo non invasivo è stato sviluppato per facilitare il trattamento a lungo termine riducendo il tempo di restrizione motoria degli animali e il conseguente stress dovuto a un'eccessiva manipolazione, preservando la qualità della vita e la sopravvivenza di questi animali. Inoltre, il metodo può essere utilizzato per altre specie di roditori e farmaci orali.

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Protocollo

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La ricerca è stata condotta in conformità con gli standard etici. Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico sull'Uso degli Animali nella Ricerca (CEUA) del Centro di Scienze della Salute (CCS) dell'Università Federale di Rio de Janeiro (UFRJ); CEUA: 079/22 (codice protocollo 014/19, approvato il 27 marzo 2019).

1. Calcolo del dosaggio in base al peso dell'animale

  1. Prima di iniziare il protocollo di somministrazione, dividere i ratti Wistar maschi (Rattus norvegicus) all'età di 45-60 giorni dopo la nascita in gruppi di trattamento. Un gruppo ha ricevuto trigliceridi a catena media (MCT) derivati dall'olio di cocco come controllo, mentre l'altro gruppo ha ricevuto un estratto di cannabis a spettro completo arricchito con CBD. Somministrare entrambi i trattamenti ogni giorno per 15 giorni. Standardizzare il dosaggio dell'estratto di cannabis a 3 mg/kg/giorno, con aggiustamenti giornalieri in base al peso di ciascun animale per garantire un dosaggio accurato.
  2. Pesare l'animale: posizionare ogni ratto singolarmente sulla bilancia utilizzando un piccolo contenitore. Attendere che il peso, in g, si stabilizzi. Rimuovi l'animale dalla bilancia.
  3. Calcolo del dosaggio: Calcolare la dose da somministrare in base al peso dell'animale. Usa la formula:
    Dose (mg) = [Peso (g) x concentrazione di CBD (mg/kg)]/1.000
    NOTA: Per questo protocollo, abbiamo utilizzato un estratto di cannabis arricchito con CBD con una concentrazione di CBD di 24 mg/mL. In questo caso, ad esempio, il volume totale di soluzione somministrato per un animale di 200 g era di 25 μl, un piccolo volume da posizionare nella guancia interna.
    1. Utilizzare la seguente formula standard per calcolare il volume per la somministrazione
      Volume (μL) = [D (mg/Kg) x W (g)]/C (mg/mL)
      dove D = dose da somministrare, W = peso dell'animale e C = concentrazione della soluzione
  4. Registrare il dosaggio richiesto per ogni animale.

2. Immobilizzazione e somministrazione dell'estratto di Cannabis

  1. Preparazione: Al momento della somministrazione, prelevare l'animale, singolarmente, dal suo gruppo di gabbie per evitare disturbi. Utilizzando una micropipetta, prelevare il dosaggio calcolato dell'estratto di Cannabis per ogni singolo animale.
    NOTA: Gli animali sono stati isolati brevemente, solo durante la procedura di somministrazione, per ridurre al minimo i disturbi. I ratti non sono stati tenuti in isolamento permanente.
  2. Immobilizzazione: immobilizzare delicatamente l'animale tirando delicatamente la pelle dietro il collo all'indietro. Tienilo sopra il pavimento della gabbia fino a quando la coda non smette di toccare la lettiera di casa. Assicurarsi che i movimenti dell'animale siano adeguatamente limitati senza causare danni.
    NOTA: Questo passaggio richiede una presa salda ma delicata per evitare angoscia.
    1. In caso di agitazione dell'animale, eseguire un'oscillazione morbida con l'animale sollevato per renderlo più calmo.
  3. Somministrazione: Posizionare con cura la punta della pipetta contenente l'estratto di cannabis nella guancia interna dell'animale. Assicurati che l'animale ingoi l'estratto di cannabis. Questo passaggio richiede circa 30 s.
    1. A causa del posizionamento della micropipetta nella cavità orale dell'animale e del basso volume somministrato, è improbabile che l'animale sputi la soluzione. Ma se ciò si verifica, non somministrare nuovamente la dose per evitare un sovradosaggio.
      NOTA: La soluzione stock di estratto di cannabis arricchito con CBD utilizzata conteneva 24 mg/mL di CBD nella sua formulazione, il cui veicolo utilizzato era MCT (trigliceridi a catena media - forniti dall'olio di cocco). Gli oli sono ampiamente utilizzati come solventi per estratti di farmaci difficilmente idrosolubili come il CBD, piante di cannabis derivate. L'MCT è un veicolo efficiente che porta a una migliore biodisponibilità e stabilità di questi preparati 38,39,40. Tale elevata concentrazione e l'elevata viscosità dovute alla soluzione oleosa hanno permesso di posizionare un volume molto basso nella guancia interna dell'animale e una probabilità molto bassa di fuoriuscirne una parte. Anche se tali perdite possono verificarsi in alcuni casi, oltre al fatto che parte del suo volume viene direttamente ingerito invece che assorbito attraverso la mucosa, è una rappresentazione molto affidabile di ciò che avviene nella pratica clinica, soprattutto nei bambini 6,7.
  4. Assicurarsi che ogni serie di trattamenti sia eseguita dallo stesso operatore e che l'operatore non utilizzi prodotti cosmetici con aromi.

3. Cura e analisi post-somministrazione

  1. Rilascia delicatamente l'animale e rimettilo nel suo gruppo.
  2. Dopo la somministrazione, monitorare brevemente gli animali (circa 5-10 minuti) per eventuali reazioni avverse immediate. Ciò include un'attenta osservazione dei cambiamenti nel comportamento, in particolare dei segni correlati al cannabinoide tetrade (catalessi, diminuzione dell'attività locomotoria, ptosi e ipotermia), che potrebbero indicare una risposta inaspettata o eccessiva all'estratto di cannabis. Inoltre, monitorare gli animali per segni di distress respiratorio (respiro affannoso, respiro sibilante) e irritazione orale (infiammazione, salivazione eccessiva).
  3. Prestare particolare attenzione ai segni di disagio gastrointestinale, come vomito o diarrea, in quanto potrebbero compromettere il benessere degli animali e potenzialmente interferire con il trattamento41. È importante notare che in questo studio non sono state osservate reazioni avverse.
  4. Per valutare ulteriormente l'impatto del trattamento di 15 giorni, eseguire una serie completa di analisi. Questi includono valutazioni comportamentali utilizzando il test in campo aperto per valutare l'attività locomotoria e il nuovo test di riconoscimento degli oggetti per valutare la memoria a breve termine.
  5. Eutanasia degli animali e raccolta del tessuto ippocampale per il Western blotting per quantificare i livelli di proteine correlate alla plasticità sinaptica e all'attività gliale. Eseguire l'immunoistochimica per esaminare la morfologia microgliale e l'attività fagocitaria all'interno dell'ippocampo, fornendo una comprensione dettagliata dei cambiamenti cellulari e molecolari indotti dall'esposizione a lungo termine all'estratto di cannabis arricchito con CBD10.

4. Protocollo di test in campo aperto

  1. Posiziona individualmente l'animale al centro dell'arena quadrata. Avviare la registrazione con la fotocamera collegata al computer. Assicurati che la telecamera sia posizionata sopra l'arena quadrata in modo da poter visualizzare l'intera area dell'arena.
  2. Imposta un cronometro per 5 min. Ogni topo deve esplorare liberamente l'arena. Trascorso il periodo di tempo, mettere in pausa il cronometro e la registrazione.
  3. Rimuovi l'animale dall'arena quadrata.

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Risultati

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La metodologia è stata precedentemente utilizzata dal nostro gruppo. Questo studio indaga gli effetti a lungo termine dell'estratto di cannabis arricchito con cannabidiolo, concentrandosi sulla crescita, sul comportamento e sui cambiamenti sinaptici. La somministrazione per mucosa orale di un estratto di cannabis arricchito con CBD alla dose di 3 mg/kg/die non ha influenzato negativamente la crescita degli animali dall'adolescenza alla prima età adulta. I parametri fisiologici chiave, tr...

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Discussione

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Il protocollo descritto offre un approccio raffinato alla somministrazione per mucosa orale di estratti di Cannabis nei ratti, presentando un notevole vantaggio di essere confortevole sia per l'operatore che, soprattutto, per l'animale, fornendo benessere, sicurezza e controllo preciso sulla dose somministrata per un assorbimento efficace. La via della mucosa orale è economica e relativamente sicura, e alcuni animali possono essere addestrati a cooperare volontariamente...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano che non sussistono conflitti di interesse in merito alla pubblicazione di questo articolo.

Ringraziamenti

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Gli autori riconoscono il supporto del team presso la struttura per animali situata nel Laboratorio Intermedio di Biofisica Cellulare. L'apprezzamento è esteso anche al Comitato Etico per l'Uso degli Animali dell'Università Federale di Rio de Janeiro per la loro supervisione. Questo lavoro è stato finanziato dal Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), dalla Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e dal Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Estratto di cannabis arricchito con CBDProgetto Farmacannabis - Università Federale di Rio de Janeiro (UFRJ)xConcentrazioni di cannabinoidi: CBD = 24,0 mg/mL; ?9-THC = 1,0 mg/mL; CBDA = 0,5 mg/mL; Non sono stati rilevati THCA e CBN.
GuantiNUGARDCA 41.485Materiale in gomma sintetica (nitrile)
MicropipettaLabmate pro/LabMate+LMP-20020-200ul
Soluzione oleosa di trigliceridi a catena media (MCT)MCT; MTC cerebrale, Puravida7907981000102Uso come soluzione per veicolo
Scala123 util1783912La sensibilità minima e massima è rispettivamente di 1 g e 10 kg

Riferimenti

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