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Articolo metodologico

Istituzione del modello murino di psoriasi da parte di Imiquimod

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DOI:

10.3791/68111

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20 giugno 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Basic Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Characteristic Experimental Animal Models of Guangxi, 3Guangxi Key Laboratory of Translational Medicine for Treating High-Incidence Infectious Diseases with Integrative Medicine, 4College of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un modello murino altamente efficace e stabile di psoriasi stabilito attraverso l'utilizzo di imiquimod. Inoltre, descriviamo in dettaglio le metodologie impiegate per valutare la gravità della psoriasi.

Abstract

La psoriasi è una condizione cutanea comune, cronica, recidivante e infiammatoria, caratterizzata da infiltrazioni cutanee ispessite, squame ed eritema. La patogenesi della malattia è molto complessa e coinvolge l'interazione di vari fattori come la genetica, l'immunità e i fattori ambientali. Per studiare i meccanismi alla base della psoriasi, i ricercatori hanno sviluppato diversi modelli animali della malattia. Tuttavia, la variabilità delle metodologie ha presentato sfide per la costruzione coerente di questi modelli. In questo studio, abbiamo stabilito e valutato in modo completo un modello murino di psoriasi altamente efficiente e stabile utilizzando imiquimod (IMQ). Per stabilire il modello murino di psoriasi sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J di 8 settimane di grado SPF. Dopo una settimana di acclimatazione, sono stati esclusi i topi con pelle irritata o danneggiata nelle aree depilate. A partire dal secondo giorno, la crema IMQ al 5% (62,5 mg/die) è stata applicata quotidianamente sulle regioni depilate del collo e della schiena per sette giorni consecutivi. Durante l'esperimento, sono state condotte misurazioni giornaliere del peso corporeo, fotografia della pelle, punteggio della pelle e osservazioni comportamentali. Dopo l'esperimento, sono stati eseguiti la determinazione dell'indice della milza, l'analisi istologica della pelle, il rilevamento delle citochine sieriche e il rilevamento del livello di mRNA cutaneo. I risultati hanno mostrato che i topi del gruppo IMQ hanno sviluppato sintomi tipici simili alla psoriasi, tra cui eritema, squame e ispessimento della pelle, accompagnati da un aumento del comportamento di graffio, perdita di peso, indice di milza elevato e aumento dello spessore della pelle. E cambiamenti significativi nei livelli di TNF-α, IL-23 e IL-17A nel siero, nonché nei livelli di mRNA di IL-23, IL-17A, IL-17F e IFN-γ nella pelle. I livelli sierici di citochine (TNF-α, IL-23, IL-17A) e l'espressione cutanea dell'mRNA dei marcatori pro-infiammatori (IL-23, IL-17A, IL-17F, IFN-γ) sono stati notevolmente sovraregolati. Al contrario, il gruppo di controllo non ha mostrato tali alterazioni. Ottimizzando la durata dell'induzione dell'IMQ e standardizzando il protocollo di somministrazione, monitorando dinamicamente i cambiamenti della pelle, questo studio mira a fornire un quadro standardizzato per i ricercatori per costruire modelli di psoriasi affidabili.

Introduzione

La psoriasi è una malattia sistemica della pelle comune, cronica, recidivante e infiammatoria, con la psoriasi a placche che è la manifestazione clinica più predominante1. Le sue caratteristiche cliniche includono tipicamente l'infiltrazione cutanea, lo spessore, le squame e l'eritema2 e può anche scatenare una varietà di complicanze, tra cui artrite psoriasica, depressione, sindrome metabolica e malattie cardiovascolari1. Inoltre, la psoriasi è spesso accompagnata da prurito cronico3. A livello globale, la psoriasi colpisce dal 2% al 3% della popolazione4 e la sua incidenza è in aumento. Pertanto, la creazione di modelli animali affidabili che imitino da vicino le caratteristiche patologiche della psoriasi umana è fondamentale per scoprirne la patogenesi e sviluppare nuove strategie terapeutiche.

Nel campo della ricerca dermatologica, la psoriasi ha attirato un'attenzione significativa a causa della sua complessa patogenesi, che coinvolge l'interazione di fattori genetici, immunologici e ambientali, presentando notevoli sfide per uno studio approfondito1. La ricerca attuale indica che l'insorgenza della psoriasi è principalmente mediata dalle cellule T che, dopo l'attivazione, stimolano i cheratinociti a proliferare eccessivamente e alterano la secrezione di citochine durante il loro processo di differenziazione5. In questo processo, l'asse interleuchina (IL)-23/IL-17 svolge un ruolo fondamentale. IL-23 promuove la differenziazione e l'attivazione delle cellule Th17, che producono citochine come IL-17A e IL-17F, svolgendo un ruolo significativo nello sviluppo della psoriasi 6,7,8. Attualmente, la patogenesi della psoriasi comprende numerose alterazioni molecolari. Questi coinvolgono citochine come il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), l'asse IL-23/IL-17, IL-37, vie di segnalazione intracellulare come il fattore nucleare-κB (NF-κB) e la trasduzione del segnale della chinasi Janus e l'attivatore trascrizionale (JAK-STAT). Inoltre, è strettamente associato a molecole legate allo zucchero, al ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA), agli amminoacidi, alle vie del metabolismo lipidico e ai fattori regolatori epigenetici, tra cui la metilazione del DNA e la modificazione degli istoni. Questi bersagli sono intrecciati in modo intricato e interagiscono tra loro, guidando congiuntamente l'insorgenza e la progressione della psoriasi9.

Nell'attuale ricerca sulla psoriasi, vengono impiegati una varietà di modelli animali, tra cui modelli spontanei, modelli di trapianto allogenico, modelli transgenici o knockout genici e modelli indotti chimicamente, tra gli altri10. Questi modelli animali svolgono un ruolo essenziale nello studio della psoriasi, con gli scienziati che hanno utilizzato più specie come topi, porcellini d'India e pesci zebra per costruire modelli di psoriasi 11,12,13. Tuttavia, questi modelli hanno tutti alcune limitazioni, tra cui la complessità genetica, le differenze di specie, le preoccupazioni etiche e le considerazioni sui costi14.

Imiquimod (IMQ), come agonista dei recettori Toll-like (TLR), può innescare l'infiammazione cutanea e l'infiltrazione delle cellule immunitarie, promuovendo anche la proliferazione dei cheratinociti e il potenziamento dei vasi sanguigni dermici13. Uno studio ha riportato che l'applicazione topica di IMQ nell'uomo può indurre la psoriasi15. Le osservazioni cliniche hanno anche rivelato che l'IMQ aggrava i sintomi della psoriasi nei pazienti7. Nei modelli murini di psoriasi, la somministrazione continua di una concentrazione del 5% di IMQ può riprodurre le manifestazioni cutanee della psoriasi umana, come eritema e squame. Inoltre, altri sintomi imitano da vicino quelli della psoriasi a placche umana, compresi i cambiamenti epidermici come l'acantosi e la paracheratosi, la neoangiogenesi e così via. I modelli murini di psoriasi indotti da IMQ sono anche in grado di simulare il prurito cronico4. C'è anche un'infiltrazione di cellule infiammatorie costituite da cellule T, neutrofili e cellule dendritiche nei modelli murini di psoriasi 2,16. Le lesioni cutanee indotte da IMQ si basano principalmente sull'asse TNF-α-IL-23/IL-17, indicando che i modelli murini di psoriasi basati su IMQ possono essere utilizzati per studiare ulteriormente la psoriasi umana9.

Il modello murino di psoriasi indotta da IMQ impiegato in questo studio è adatto per ceppi murini come C57BL/6 e BALB/c, che hanno tendenze Th1 e Th2, rispettivamente7. Questo modello è stabile e altamente efficiente, con i vantaggi di basso costo, breve durata sperimentale, funzionamento semplice, sintomi distinti e un alto tasso di successo. Nell'esperimento, abbiamo fornito un resoconto dettagliato di diversi metodi impiegati per monitorare la progressione della psoriasi. Questi metodi comprendevano il punteggio cutaneo e i test comportamentali. Inoltre, abbiamo ulteriormente convalidato i risultati sperimentali attraverso l'utilizzo dell'analisi istopatologica, del saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e della reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR). Questo modello è adatto non solo per esplorare la patogenesi della psoriasi, ma anche per la valutazione preclinica di nuovi approcci terapeutici, rendendolo uno strumento prezioso nella ricerca.

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Protocollo

Il protocollo per l'uso degli animali elencato di seguito è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico e Istituzionale per il Benessere dell'Università di Medicina Cinese del Guangxi (DW20191220-153). Il certificato animale dei topi acquistati era SCXK (Xiang) 2024-0009. In questo studio, topi femmina C57BL/6J di 8 settimane, di grado SPF, sono stati divisi casualmente in gruppi, ogni gruppo contenente 6 topi. La gabbia è collocata in una stanza a temperatura controllata (23 ± 2 °C, 12 ore di ciclo luce/buio) con libero accesso al cibo e all'acqua. Il diagramma di flusso dell'esperimento è mostrato nella Figura 1. A parte il fatto di non essere stati indotti con la crema IMQ, i topi del gruppo di controllo hanno ricevuto gli stessi trattamenti di quelli del gruppo IMQ sotto tutti gli altri aspetti.

1. Preparazione degli animali

  1. Inizia a modellare dopo aver adattato l'animale all'ambiente per una settimana. Prima di iniziare l'esperimento, disinfettare meticolosamente il tavolo sperimentale utilizzando una soluzione di etanolo al 75%.
  2. Usando un pennarello, segna chiaramente le code dei topi, assicurandoti della loro identificazione individuale.
  3. Usa il rasoio per radere i peli del collo e della schiena di tutti i topi per un'area di circa 4 cm x 3 cm (giorno 0; Figura 2A). Utilizzare un batuffolo di cotone per applicare una quantità adeguata di crema depilatoria sulla pelle rasata e stenderla uniformemente (Figura 2B).
  4. Dopo aver applicato la crema depilatoria, attendere circa 15 s. Lasciare la crema depilatoria sulla superficie della pelle del topo per un ottimale 15-20 s. Strofinare delicatamente e rapidamente.
  5. Usa un nuovo batuffolo di cotone per immergerlo in acqua e strofina ripetutamente nella direzione dalla coda del topo alla testa per pulire i capelli. Asciugare delicatamente la pelle locale con carta assorbente medica.
  6. Esaminare le condizioni della pelle dei topi 24 ore dopo la depilazione ed escludere quelli con aree di depilazione danneggiate.

2. Modello murino di psoriasi indotta da IMQ

  1. Assicurarsi che il lieve danno alla pelle causato dalla rasatura o dalla depilazione sia completamente recuperato.
  2. A partire dal 2° giorno, applicare la crema IMQ al 5% alla dose di 62,5 mg7. Per fare ciò, pre-riempire in anticipo l'intera siringa da 1 ml con la crema IMQ e somministrare il farmaco al topo secondo il volume corrispondente a 62,5 mg di IMQ al giorno alla pelle depilata del topo utilizzando un cucchiaio a manico piatto (Figura 2C). Durante l'applicazione, assicurarsi che la crema IMQ sia distribuita il più uniformemente possibile sulla zona depilata e che l'area di applicazione sia più piccola della zona depilata.
  3. Dopo aver spalmato il farmaco, metti il topo in una gabbia vuota e attendi 15 minuti. Rimetti il topo nella gabbia di alimentazione dopo che il farmaco è completamente assorbito. Eseguire l'applicazione del farmaco continuamente per 7 giorni.

3. Analisi del peso corporeo di topi con psoriasi

  1. Posizionare un becher pulito su una bilancia elettronica e targarlo. Quindi, posizionare delicatamente il mouse all'interno e annotare le letture stabili visualizzate sulla bilancia.
  2. Dal giorno 1 (il giorno precedente l'applicazione iniziale di IMQ), pesare i topi ogni giorno fino al giorno 8. Confronta il peso di ciascun topo con il suo peso corrispondente il giorno 1.

4. Caratterizzazione cutanea di topi psoriasici

  1. Posiziona i mouse su uno sfondo bianco con un righello. Mantieni i corpi dei topi dritti senza restringere la testa o fare grandi oscillazioni (Figura 3).
  2. Dal giorno 1, scatta una fotografia ad alta risoluzione del sito di somministrazione dei topi con la stessa intensità di luce ogni giorno e registra la caratterizzazione della pelle dei topi.
  3. Durante ogni sessione fotografica, mantenere costante la distanza tra la fotocamera e i mouse, così come l'ingrandimento della fotocamera, e posizionare il righello perpendicolarmente alla fotocamera.

5. Punteggio della pelle

  1. Valutare la gravità della dermatite psoriasica nei topi utilizzando l'indice di area e gravità della psoriasi modificato (PASI)17 ogni giorno dal giorno 1 al giorno 8. Impiega tre ricercatori utilizzando un metodo in doppio cieco per valutare in modo indipendente eritema, squame e spessore della pelle su una scala da 0 a 4, prendendo la media aritmetica dei tre. Per le regole di punteggio PASI, consultare la Tabella 1.
    Punteggio PASI = eritema + scala + spessore

6. Osservazione comportamentale dei topi

  1. Nello stesso ambiente silenzioso e normalmente illuminato a temperatura ambiente (come al punto 4), posizionare ogni mouse in una scatola acrilica individuale (10 cm x 10 cm) con una piccola quantità di imbottitura di pannocchia di mais sul fondo.
  2. Usa le pareti divisorie nere per separare ogni scatola e bloccare la linea di vista. Dopo un periodo di adattamento di 15 minuti, videoregistrare il comportamento degli animali per 1 ora.
  3. Registra video comportamentali a un'ora fissa ogni giorno dal giorno 1 al giorno 8. Posiziona l'obiettivo della fotocamera perpendicolarmente alla scatola acrilica e assicurati che catturi completamente le attività del mouse all'interno.
  4. Registra i casi in cui il mouse solleva la zampa posteriore per grattare il collo e la schiena e poi la abbassa come un comportamento di prurito.

7. Raccolta del sangue e misurazione dei livelli di citochine nel siero mediante ELISA

  1. Rimuovi rapidamente i bulbi oculari dei topi con una pinza e raccogli il sangue il giorno 9.
  2. Lasciare riposare il sangue a 4 °C per 4 ore. Separare il sangue utilizzando una centrifuga a bassa temperatura a 3000 x g per 30 minuti a 4 °C. Raccogliere il siero e conservarlo a -80 °C per un uso futuro.
  3. Quantificare i livelli sierici di TNF-α, IL-17A e IL-23 utilizzando il kit ELISA pertinente secondo il protocollo18 del produttore.

8. Campionamento della pelle e della milza

  1. Secondo le norme del comitato etico per gli esperimenti sugli animali pertinente, lussare le vertebre cervicali dei topi per l'eutanasia dopo il prelievo di sangue al giorno 9.
  2. Dopo l'eutanasia, tagliare le lesioni cutanee sulla schiena dei topi in due parti. Immergere una porzione in una provetta da centrifuga da 5 ml con una soluzione di paraformaldeide al 4% per il fissaggio e la conservazione. Separare e imballare l'altra porzione di tessuti cutanei e conservarli a -80 °C per un uso futuro.
  3. Usa le forbici sterilizzate per tagliare la pelle lungo la linea mediana dell'addome del topo, esporre la cavità addominale e trovare e rimuovere completamente la milza. Lavare i campioni con soluzione fisiologica normale, quindi immergerli in soluzione fisiologica, pesarli e registrare i dati.

9. Analisi istologiche di sezioni cutanee

  1. Rimuovere il tessuto cutaneo dalla paraformaldeide e posizionarlo nella scatola di inclusione.
  2. Eseguire i seguenti passaggi sulla pelle: Utilizzare alcol gradiente dal 75% al 100% (da bassa ad alta concentrazione), con tre serbatoi di alcol al 100%. Lasciarlo in ogni vasca per 30 minuti a temperatura ambiente. Usa due serbatoi di xilene. Lasciarlo in ogni vasca per 30 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare tre serbatoi di cera di paraffina con un punto di fusione di 56-58 °C. Lasciarlo in ogni vasca per 1 ora a temperatura ambiente.
  3. Incorporare il tessuto cutaneo trattato: posizionare il tessuto cutaneo impregnato di cera in posizione verticale in uno stampo di paraffina. Versare la paraffina fusa nello stampo quando la temperatura di inclusione della paraffina è superiore di 5-7 °C rispetto al punto di fusione della paraffina. Spostarlo rapidamente nel tavolo di congelamento per raffreddare e solidificare rapidamente il blocco di cera.
  4. Congelare il blocco di cera a 0 °C, rimuoverlo dalla scatola di inclusione, fissarlo sul tavolo di serraggio dell'affettatrice e tagliarlo a uno spessore di 3 μm.
  5. Con una pinzetta raccogliete le fette e sbollentatele in acqua tiepida a 45 °C. Attacca la sezione al centro della parte liscia del vetrino e segna il numero patologico sull'area smerigliata con una matita. Inclinare un attimo la slitta di 45° per far defluire l'umidità, quindi metterla in forno a 62 °C e cuocere per 30 minuti.
  6. Colorazione HE: Mettere le fette nello xilene per 5 minuti, poi in un'altra vasca di xilene per 5 minuti, in etanolo anidro per 1 minuto, in etanolo al 95% per 1 minuto, in etanolo all'85% per 1 minuto e in etanolo al 75% per 1 minuto. Sciacquare con acqua di rubinetto per 1 minuto, colorare con la soluzione di ematossilina per 5 minuti e lavare la soluzione di ematossilina sotto l'acqua corrente per 1 minuto.
  7. Immergere in etanolo acido cloridrico all'1% per 3 s, lavare con acqua per 20 s, utilizzare acqua tiepida per il ritorno blu per 5 min, risciacquare con acqua corrente per 2 min, colorare con eosina allo 0,5% per 1 min, immergere in etanolo al 95% per 2 s, quindi in etanolo al 95% per 2 min, in etanolo anidro per 4 min, in un altro serbatoio di etanolo anidro per 4 minuti, in xilene per 4 minuti, in un altro serbatoio di xilene per 4 minuti e nell'ultimo serbatoio di xilene per 4 minuti. Dopo l'asciugatura all'aria, sigillarlo con gomma neutra.
  8. Osserva le sezioni al microscopio e scatta foto casuali in tre posizioni con un ingrandimento di 400. Per ogni immagine, misurare in modo casuale lo spessore epidermico in cinque punti utilizzando il software Image J. Registra e analizza i dati.

10. Misurazione dei livelli di mRNA di IL-17A, IL-17F, IL-23 e IFN-γ nella pelle mediante RT-qPCR

  1. Prelevare il tessuto cutaneo conservato in frigorifero a -80 °C, del peso di circa 100 mg, ed estrarre l'RNA con il metodo Trizol.
  2. Trascrivere inversamente in cDNA secondo il kit di trascrizione inversa (VAZYME, Cina).
  3. Configurare il sistema di reazione PCR secondo il manuale ed eseguire la PCR in tempo reale utilizzando uno strumento di PCR quantitativa a fluorescenza secondo la procedura di reazione specificata (Tabella 2) e la sequenza di primer (Tabella 3).
  4. Raccogli dati PCR quantitativi di fluorescenza in tempo reale, calcola e analizza i risultati utilizzando l'algoritmo qPCR (metodo 2-ΔΔCt).

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Risultati

Dopo la somministrazione continua di IMQ, i topi del gruppo IMQ hanno mostrato sintomi clinici della pelle posteriore che ricordano la psoriasi (Figura 4), con l'area indotta da IMQ che presentava i sintomi tipici di eritema, squame e spessore (Figura 5). Al contrario, il gruppo di controllo non ha mostrato alcun sintomo simile a quelli del gruppo IMQ. Rispetto al gruppo di controllo, eritema e squame minori hanno iniziato a emergere nel gruppo IMQ dal giorno 3 ...

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Discussione

La nostra ricerca utilizza l'IMQ per indurre lesioni cutanee simili alla psoriasi, costruendo così un modello di psoriasi. Questo modello può essere utilizzato per studiare i meccanismi alla base dello sviluppo della psoriasi e per fornire informazioni per lo sviluppo di trattamenti per la condizione. Nello studio di van der Fits7, quando è stata somministrata inizialmente l'induzione IMQ, il tempo di induzione è stato fissato a 5 o 6 giorni. Tuttavia, Jabeen et a...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation of China (NSFC) a Guanyi Wu (82060768), dalla Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region a Guanyi Wu Autonomous Region (2020GXNSFAA297244); Progetto di finanziamento di talenti di prim'ordine per la medicina tradizionale cinese di Guipai dell'Università di Medicina Cinese del Guangxi; il secondo lotto del progetto di coltivazione del team di talenti di alto livello "Qihuang Project" dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Guangxi (2024002).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5% Imiquimod CremaSichuan Medshine Pharmaceutical Co.
75% EtanoloXUE HUAN20240401
Bilancia analiticasartoriusSQP
Crema depilatoriaReckitt Benckiser20240612 08X
Bilancia elettronicaYingheng Technology7915
Carta velina medicaJD20221208
RasoioHORD shenjianAUX-C6S
Batuffolo di cotone sterilizzatoBeilun River20230728
40220602

Riferimenti

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