Regolazione delle modalità di contrattilità e deformazione di assemblaggi attivi basati su actina in vitro: dalle reti attive bidimensionali alle gocce di cristalli liquidi

Summary

Qui, presentiamo metodi per la preparazione di assemblaggi di actina quasi bidimensionali (2D) entangled, reticolati e a cristalli liquidi da proteine purificate.

Abstract

I materiali basati sul citoscheletro di actina sono ampiamente studiati come materiali cellulari modello per chiarire i meccanismi fisici della meccanica cellulare, come la regolazione della forma e la produzione di forza, nonché intriganti materiali polimerici morbidi. In questo metodo, descriviamo in dettaglio la creazione di assemblaggi a base di actina in vitro utilizzando proteine purificate per studi di microscopia a fluorescenza. Polimerizziamo lunghi filamenti di actina in una camera campione e utilizziamo un depletante polimerico per affollare i filamenti in una rete aggrovigliata bidimensionale (2D) contro una superficie passivata con uno strato di tensioattivo. L'aggiunta di filamenti II di miosina muscolare scheletrica in presenza di adenosina trifosfato (ATP) induce la contrazione della rete di actina. Raggruppando i filamenti di actina con un reticolante, accordiamo la contrattilità dell'assemblaggio, passando da un materiale che si deforma a un materiale che scorre su microscala. Riducendo la lunghezza dei filamenti di actina attraverso la co-polimerizzazione dell'actina in presenza di proteina di capping, sintonizziamo il materiale dall'essere una rete 2D a un cristallo liquido. La reticolazione di filamenti corti di actina dispersi provoca la formazione di goccioline di cristalli liquidi tridimensionali (3D).

Introduction

I materiali biologici attivi sono alla base dei processi meccanici in una varietà di processi fisiologici, tra cui il trasporto intracellulare, la migrazione cellulare, la regolazione della forma cellulare e la generazione di forza biologica ^1,2,3. Gli assemblaggi in vitro di sistemi citoscheletrici, costruiti da componenti proteici purificati e ingegnerizzati autoassemblati in tampone, sono uno strumento consolidato per caratterizzare processi biofisici e biochimici fondamentali ^4,5,6,7. Questi sistemi modello semplificati consentono di studiare le proteine senza la complessità degli ambienti cellulari, consentendo di identificare i ruoli dei singoli componenti. Oltre a supportare studi biologici fondamentali, gli assemblaggi citoscheletrici in vitro sono anche ampiamente sviluppati come sistemi sperimentali per studiare materiali cristallini liquidi e attivi o fuori equilibrio 8,9,10,11,12,13,14,15.

L'actina è un biopolimero chiave negli assemblaggi citoscheletrici che regola la meccanica e la dinamica cellulare attraverso forze motorie e di polimerizzazione ^3,16. Gli esperimenti di microscopia a fluorescenza consentono la visualizzazione dei cambiamenti strutturali della rete di actina durante processi come la contrazione motoria e il raggruppamento dell'actina mediante la reticolazione delle proteine. L'imaging delle reti tridimensionali di actina mentre vengono rimodellate da proteine motrici incorporate ha messo in luce il ruolo dei crosslinker di actina per la contrazione della rete e la formazione di pattern 12,17,18,19. Tuttavia, le reti di actina quasi bidimensionali superano le sfide dell'imaging con una risoluzione spazio-temporale sufficiente a catturare i cambiamenti strutturali della rete. Inoltre, le strutture di actina ad alta densità, quasi bidimensionali, sono un'imitazione più stretta di assemblaggi cellulari come la corteccia densa di actina di una cellula²⁰. Le strategie per produrre strutture di actina quasi-bidimensionali hanno incluso l'attaccamento di proteine nucleanti dell'actina a un vetrino^{coprioggetti 21,22}, l'accoppiamento dell'actina a una superficie attraverso molecole linker 10,23,24, la formazione di fasci densi di actina attaccati a perline su una superficie di vetrino ^{coprioggetti 25,26} e la concentrazione di filamenti di actina su una superficie di vetrino coprioggetti con agenti di affollamento molecolare^10,27.

Qui, descriviamo in dettaglio un metodo per creare assemblaggi riproducibili basati sull'actina del modello e come modificarlo per preparare variazioni da reti attive a cristalli liquidi quasi-2D e goccioline nematiche. Abbiamo precedentemente utilizzato metodi simili per studiare la formazione di goccioline cristalline liquide separate in fase di filamenti corti di actina con l'aggiunta di reticolante¹¹, i cambiamenti nelle modalità di deformazione della rete di actina generata dalla miosina II (ad esempio, instabilità del filamento o scorrimento relativo) con reticolazione del filamento e connettività²⁸, differenze nelle forze generate dalla miosina II su fasci di actina con spaziatura e conformità variabili²⁹, e miosina II trasporto³⁰. L'uso di proteine reticolanti e proteine di capping dell'actina consente una variazione sistematica della lunghezza del filamento di actina e dell'architettura di assemblaggio.

Protocol

NOTA: Proteine ed etichettatura: Ai fini di questo protocollo, si presume che il ricercatore inizi con scorte di proteine purificate, che vengono marcate in fluorescenza quando appropriato per l'indagine al microscopio a fluorescenza. Queste proteine possono essere acquistate o purificate e marcate in fluorescenza in laboratorio 31,32,33,34,35,36,37. In questo protocollo sono state utilizzate scorte di proteine che sono state congelate in azoto liquido e conservate a -80 °C. Le proteine in genere possono essere marcate con metodi simili. La proteina può essere etichettata come fase di purificazione o da un brodo congelato. Scongelare le scorte proteiche congelate con ghiaccio prima di procedere con l'etichettatura. Quello che segue è un metodo per marcare in fluorescenza la miosina II del muscolo scheletrico (miosina) con un fluoroforo funzionalizzato con maleimmide (adattato da³⁸).

1. Preparare la miosina marcata con fluorescenza

1. Inizia con ~2 ml di miosina a una concentrazione di 5-10 mg/mL.
   NOTA: In questo protocollo, sono stati utilizzati la miosina II del muscolo scheletrico purificata dal muscolo di pollo utilizzando i metodi pubblicati³⁵ . La miosina viene conservata in un tampone di conservazione della miosina (25 mM KPO₄, 0,6 M KCl, 10 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1 mM di ditiotreitolo (DTT), pH 6,6), subito dopo la purificazione o da stock congelato. È importante mantenere la miosina sempre fredda per prevenire la perdita dell'attività motoria.
2. Aggiungere DTT alla soluzione di miosina scongelata fino a una concentrazione finale di 10 mM. Utilizzare una soluzione stock DTT da 1 M per limitare il volume.
   NOTA: Il DTT riduce il gruppo tiolico sulle cisteine nella proteina miosina, preparandole a reagire con la maleimmide per la marcatura.
3. Per evitare interferenze con la reazione di marcatura, rimuovere il DTT mediante dialisi notturna in 50 mM HEPES, 500 mM KCl, 1 mM EDTA, pH 7,6, a 4 °C.
4. Dopo la dialisi, centrifugare la soluzione di miosina a 100.000 x g a 4 °C per 15 minuti per pellettare eventuali aggregati. Raccogli il surnatante.
5. Determinare la concentrazione di miosina nel surnatante utilizzando uno spettrofotometro. Stimare la concentrazione di miosina utilizzando un coefficiente di estinzione a 280 nm di ~148.000 ^{M-1 cm-1} per la miosina³⁸ del muscolo scheletrico. Questo coefficiente di estinzione assume che un "monomero" sia costituito da una catena pesante, una catena leggera essenziale e una catena leggera regolatoria.
6. Preparare il fluoroforo per la reazione di marcatura risospendendo il fluoroforo in polvere in dimetilsolfossido secco (DMSO) a una concentrazione di 5 mM di fluoroforo.
   NOTA: Qualsiasi fluoroforo con un gruppo reattivo maleimmide dovrebbe funzionare. È stata utilizzata la maleimmide Alexa 647. Il DMSO è igroscopico e accumula acqua. Il DMSO "secco" si riferisce al DMSO che è stato immagazzinato in un ambiente per evitare l'accumulo di acqua. Per garantire che il solvente sia DMSO secco, per questa fase è stata utilizzata un'ampolla di DMSO appena aperta. Non mettere le soluzioni DMSO sul ghiaccio. Il DMSO ha un punto di fusione di 19 °C, quindi deve essere a temperatura ambiente (o leggermente più calda) per pipettare³⁹.
   ATTENZIONE: Il DMSO può penetrare nei guanti, quindi è buona norma indossare doppi guanti in nitrile e fare attenzione a prevenire fuoriuscite.
7. Per preparare la miosina per l'aggiunta di fluoroforo, togliere brevemente la soluzione di miosina dal ghiaccio e lasciarla riscaldare a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Non lasciare la miosina a RT più a lungo del necessario. Eseguire questo passaggio dopo che il fluoroforo è stato sospeso nel DMSO.
8. Non appena la soluzione di miosina è vicina alla RT, aggiungere la soluzione di fluoroforo alla miosina e mescolare rapidamente in modo tale che ci sia un rapporto molare di 5:1 di fluoroforo: miosina. Mettere la soluzione di miosina sul ghiaccio non appena viene mescolata con il fluoroforo.
9. Incubare su ghiaccio per 1 ora, al riparo dalla luce, quindi arrestare la reazione aggiungendo DTT a una concentrazione di 1 mM. Utilizzare un calcio DTT da 1 M per ridurre al minimo il volume aggiunto.
10. Rimuovere i fluorofori non reagiti. Utilizzare uno dei due metodi descritti di seguito:
    1. Opzione 1:
       1. Polimerizzare la miosina diluendola lentamente in un tampone F (10 mM Imidazolo, 50 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 4 mM ATP, pH 7,5). Si tratta di una diluizione di circa 10x, a seconda del volume di colorante aggiunto nel passaggio 1.8.
       2. Incubare con ghiaccio per 20 min. Centrifugare a 8.000 x g in una centrifuga refrigerata a 4 °C per 10 minuti per pellettare.
       3. Scartare il surnatante contenente colorante libero e risospendere/depolimerizzare la miosina con il tampone di conservazione della miosina (dal passaggio 1). Per rimuovere il colorante rimanente, dializzare in 5 mM di acido 2-[4-(2-solfoetil)piperazin-1-il]etansolfonico (PIPES), 0,45 M KCl, pH 7,0 (>100 volte l'eccesso di volume) tre volte per 15 minuti ciascuna utilizzando una tazza per dialisi cutoff da 10 kD.
    2. Opzione 2:
       1. Utilizzare una colonna di desalinizzazione per lo scambio di tamponi in 5 mM PIPES, 0,45 M KCl, pH 7,0, con il protocollo standard del produttore della colonna.
11. Stimare il rapporto fluoroforo/proteina misurando la concentrazione di miosina e fluoroforo con uno spettrofotometro, utilizzando i coefficienti di estinzione per la miosina a 280 nm e per il fluoroforo come riportato dal produttore. Un rapporto di 2-4 è tipico.
    NOTA: La miosina marcata è ora pronta per il congelamento rapido delle aliquote in azoto liquido. Le aliquote vengono conservate a -80 °C per la conservazione a lungo termine.

2. Opzionale: procedura per rimuovere la miosina inattiva

NOTA: La miosina può essere utilizzata direttamente da un'aliquota scongelata negli esperimenti, ma una parte della miosina sarà inattiva. La procedura seguente descrive come rimuovere la miosina inattiva. Questo è un passaggio facoltativo, ma può essere cruciale per la riproducibilità. Le aliquote di miosina vengono utilizzate per circa 3 giorni dopo lo scongelamento, conservate a 4 °C o su ghiaccio.

1. Polimerizzare l'actina non marcata, stabilizzata con falloidina:
   1. Miscelare 10 μL di 10x F-buffer, 1 μL di 100 mM ATP e ddH₂O in modo tale che il volume finale (compresa l'actina nella fase 2.1.2) sia di 100 μL in una provetta per microcentrifuga.
   2. Aggiungere il monomero di actina a una concentrazione finale di 20 μM e pipettare la miscela.
   3. Per stabilizzare i filamenti di actina, aggiungere falloidina a una concentrazione finale di 6,7 μM utilizzando uno stock di 100 μM di falloidina in una miscela di metanolo e pipetta.
      ATTENZIONE: La falloidina è una tossina⁴⁰. Evitare fuoriuscite e contaminazioni.
   4. Incubare su ghiaccio per 20 minuti per consentire all'actina di polimerizzare. Dopo la polimerizzazione, conservare l'actina a 4 °C per futuri spin-down.
2. Miscelare 10 μL di actina stabilizzata con falloidina, 3 μL di 10x F-buffer, 0,3 μL di 100 mM ATP, 6 μL di 2 M KCl e ddH₂O fino a un volume finale di 30 μL (compreso il volume associato all'aggiunta di miosina nella fase successiva) in una provetta da microcentrifuga su ghiaccio.
3. Aggiungere la miosina marcata con dimerico dal brodo preparato alla concentrazione desiderata, mantenendo un rapporto molare tra miosina e actina di ≤ 1:6.
4. Centrifugare la soluzione risultante a freddo (4 °C) a 100.000 x g per 30 minuti. La miosina inattiva si legherà ai filamenti di actina e rimarrà legata. I filamenti inattivi di miosina e actina formeranno un pellet durante la centrifugazione.
5. Rimuovere il surnatante (contenente miosina attiva) e conservarlo a 4 °C per l'uso negli esperimenti.
6. Stimare la concentrazione di miosina utilizzando lo stesso metodo spettrofotometrico per misurare la concentrazione di miosina dopo la marcatura.
   NOTA: Alle concentrazioni di proteine e ATP che rimangono nel surnatante, il picco di assorbanza di 280 nm è oscurato dal picco di assorbanza di ATP di 260 nm, quindi misurare la concentrazione attraverso l'assorbanza associata al fluoroforo o una misurazione della fluorescenza relativa è più accurata.

3. Preparare la soluzione tensioattiva

NOTA: La soluzione tensioattiva può essere acquistata anche premiscelata e pronta all'uso.

1. Inizia con una fiala di vetro pulita. Sciacquare la fiala in acqua ed etanolo per rimuovere potenziali contaminanti nell'olio, che è un solvente per il tensioattivo. Utilizzare fiale di vetro borosilicato con tappo rivestito in politetrafluoroetilene (PTFE).
2. Prelevare 5-20 mg di fluorotensioattivo utilizzando la punta di una pipetta e depositare vicino al fondo di una fiala di vetro. Misurare la quantità di tensioattivo in base al peso utilizzando una bilancia con precisione inferiore al milligrammo.
3. Pipetettare il volume appropriato di olio fluorurato per ottenere una soluzione al 2% in peso e chiudere il flaconcino.
   NOTA: L'olio è volatile, quindi chiudere la fiala subito dopo la misurazione.
4. Vortice a bassa velocità per mescolare.
   NOTA: La soluzione può ora essere conservata a 4 °C per alcune settimane. L'età e la qualità del tensioattivo possono influenzare sia l'affollamento che l'aspetto dell'actina. L'actina che appare maculata, aderisce alla superficie o non si affolla sulla superficie può indicare che è necessaria una nuova soluzione di tensioattivo. Lo stoccaggio sotto azoto gassoso può migliorare la durata di conservazione.

4. Preparare la camera del campione (tre opzioni)

NOTA: Questa sezione fornisce una procedura per costruire tre camere di campionamento standard utilizzate per la preparazione dei campioni per la microscopia. Le due sezioni seguenti trattano la preparazione del campione vero e proprio e la passivazione della camera del campione per il caricamento del campione.

1. Opzione 1: Cella di flusso
   NOTA: Una semplice cella a flusso è un modo standard per realizzare campioni al microscopio in molti laboratori. Per questo protocollo, è particolarmente adatto ai campioni racchiusi in gocce di emulsione. Può essere difficile ottenere campi visivi ampi e piatti con il rivestimento superficiale del tensioattivo descritto in questo protocollo, quindi per i campioni 2D, le opzioni 2 e 3 sono spesso più riproducibili. La geometria del canale può anche causare una miscelazione non uniforme dei componenti aggiunti in un secondo momento, come la miosina.
   1. Posizionare 2 pezzi di nastro biadesivo paralleli l'uno all'altro lungo la larghezza del vetrino del microscopio per formare i confini del canale della cella di flusso. Il canale formato tra i due pezzi di nastro deve essere largo circa 2 mm.
      NOTA: I canali più piccoli aiutano a evitare che le emulsioni rimangano bloccate nella parte iniziale del canale. Per ottenere una buona tenuta, utilizzare pezzi di nastro adesivo più lunghi di poco più della larghezza del vetrino e tagliare dopo aver costruito la cella di flusso.
   2. Posizionare il vetrino coprioggetti sul canale del nastro. Assicurarsi che il vetrino coprioggetti sia perpendicolare al vetrino del microscopio. Utilizzare un vetrino coprioggetti da 30 mm x 40 mm per questo scopo, perché fornisce una piccola sporgenza quando viene posizionato su un vetrino.
   3. Per creare una buona tenuta ed eliminare le sacche d'aria tra il nastro e il vetrino coprioggetti, premere sull'area del vetrino coprioggetti che è a contatto con il nastro biadesivo.
      NOTA: Fare attenzione a non rompere il vetrino coprioggetti mentre si preme intorno ai bordi. Strofinare l'area con un oggetto arrotondato, come l'estremità di un pennarello chiuso, funziona bene per premere il nastro.
   4. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il nastro in eccesso dal vetrino del microscopio e dal vetrino coprioggetti, in modo che l'unico nastro visibile si trovi all'interno del canale del campione.
      NOTA: Fare attenzione a completare questo passaggio, poiché è facile rompere accidentalmente il vetrino coprioggetti mentre si tenta di rimuovere il nastro.
2. Opzione 2: Cilindro su vetrino coprioggetti non trattato
   NOTA: Questa opzione è adatta per campioni planari 2D. È utile per aggiungere componenti in momenti diversi durante gli esperimenti di microscopia. Questa camera del campione non deve essere utilizzata per emulsioni, che si scremano piuttosto che sedimentare, rendendo difficile l'imaging.
   1. Sciacquare il vetrino coprioggetti e il cilindro di clonazione in vetro con acqua, etanolo e acqua. Asciugare all'aria.
   2. Utilizzando uno strato sottile di resina epossidica per 5 minuti, far aderire il cilindro di clonazione in vetro al vetrino coprioggetti.
      NOTA: È utile applicare forza al cilindro mentre la resina epossidica si asciuga posizionando un oggetto pulito sopra il cilindro. Un piccolo coperchio per piastre di Petri o la scatola dei vetrini coprioggetti possono funzionare bene.
3. Opzione 3: Cilindro su vetrino coprioggetti rivestito in silano
   NOTA: Questa opzione produce in modo riproducibile un'ampia regione planare al centro della camera e riduce il flusso di massa del campione. Per raggiungere questo obiettivo, è stata creata una regione idrofobica circondata da una regione idrofila sul vetrino, che si traduce in un campione finale che ha una rete di actina su una regione passivata e confinata in cui l'actina è ancorata alle regioni idrofile sul bordo della camera. Questa camera di campionamento non deve essere utilizzata per emulsioni, che si scremano anziché sedimentare nel tampone, rendendo difficile l'imaging.
   1. Preparare i vetrini coprioggetti con un rivestimento silano per renderli idrofobici.
      1. Caricare i vetrini coprioggetti puliti in una rastrelliera in acciaio inossidabile. Prepulire il vetro mediante sonicazione in detergente o etanolo, se lo si desidera.
      2. In una capsula per colorare il vetro, diluire il trimetossi(ottil)silano in una soluzione al 2% in isopropanolo.
      3. Immergere i vetrini coprioggetti nella soluzione per 10 minuti.
      4. Per risciacquare, sostituire la soluzione con acqua. Sollevare e reimmergere i rack dei vetrini coprioggetti sei volte. Ripetere il processo altre quattro volte con scambi d'acqua intermedi.
      5. Coprire le griglie con un foglio di alluminio per proteggere i vetrini dalla polvere e asciugarli a 25-30 °C.
   2. Posizionare un vetrino coprioggetti trattato con ottil-silano sul fondo di una capsula di Petri di vetro o di qualsiasi altro contenitore di vetro aperto che si adatti al detergente per ozono a raggi ultravioletti (UV).
   3. Utilizzando una pinza, posizionare un quadrato in PTFE di 2 mm x 2 mm (tagliato da un foglio) sul vetrino coprioggetti che fungerà da maschera per il successivo trattamento con ozono UV.
   4. Trattare il vetrino coprioggetti con ozono UV per 10 minuti. Questo processo rende il vetro idrofilo nelle regioni esposte che non sono coperte dalla maschera in PTFE.
   5. Rimuovere con cautela il piatto senza disturbare il vetrino coprioggetti o il quadrato in PTFE. Far aderire un cilindro di clonazione in vetro al vetrino coprioggetto utilizzando resina epossidica per 5 minuti. Assicurarsi che il cilindro circondi il quadrato in PTFE, che può essere rimosso con una pinza dopo che la resina epossidica si è asciugata.
      NOTA: Il quadrato in PTFE può essere riutilizzato in esperimenti futuri.

5. Assemblaggio della rete di actina

NOTA: Quanto segue si riferisce alla preparazione di un campione da 50 μl. Per i campioni a cilindro, un volume maggiore può ridurre gli effetti del menisco e aumentare la stabilità del campione.

1. In una provetta da microcentrifuga, aggiungere 5 μL di tampone 10x F, ddH₂O necessario per portare il volume finale a 50 μL, 1 μL di beta-mercaptoetanolo 25 vol%, 1 μL di 225 mg/mL di glucosio, 1 μL di una miscela di glucosio ossidasi (135 mg/mL) e catalasi (85.000 unità/mL), 1 μL di 25 mM ATP, e 10 μl di metilcellulosa 2 wt% 15 centipoisio. Mescolare accuratamente le pipette.
   NOTA: Il beta mercaptoetanolo è una tossina. Evitare fuoriuscite e contaminazioni. I reagenti glucosio ossidasi, catalasi, glucosio e beta-mercaptoetanolo sono nel campione per creare un sistema di evacuazione dell'ossigeno. La soluzione madre di metilcellulosa viene preparata agitando a 4 °C e può essere conservata a 4 °C per diverse settimane. La metilcellulosa può precipitare fuori dalla soluzione e deve essere ripreparata se c'è un precipitato visibile o se l'affollamento dell'actina è scarso.
2. Facoltativo: aggiungere la proteina reticolante (0,1-1 proteina reticolante per ogni 1 monomero di actina). Mix di pipette.
   NOTA: Le proteine reticolanti possono anche essere aggiunte dopo la polimerizzazione dell'actina e lasciate legare per 10-20 minuti prima di aggiungere la miosina. Ciò è preferibile per concentrazioni di reticolanti sufficientemente elevate da raggruppare i filamenti di actina: i fasci sono distribuiti in modo più uniforme e riproducibile all'interfaccia tensioattivo-acqua. La camera del campione del cilindro è suscettibile di aggiungere un reticolante dopo la polimerizzazione dell'actina.
3. Aggiungere falloidina, (1 falloidina per ogni 1-3 monomeri di actina), se lo si desidera. Mix di pipette.
4. In una provetta separata, mescolare l'actina non marcata e quella marcata in modo tale che, quando la miscela di actina viene aggiunta al campione da 50 μL, la concentrazione totale sarà di 2,64 μM. Utilizzare un rapporto di 1 monomero di actina marcato per ogni 9 monomeri di actina non marcati. Mix di pipette.
   NOTA: I monomeri di actina inizieranno a polimerizzare dopo l'aggiunta alla soluzione del campione. L'aggiunta separata dell'actina marcata e non marcata può portare a un'actina che appare punteggiata da regioni scure e fluorescenti lungo il contorno di un singolo filamento. Gli stock di monomero di actina vengono miscelati per garantire filamenti di actina marcati in modo uniforme. La purificazione e l'etichettatura dell'actina sono descritte in³¹.
5. Opzionale: per realizzare cristalli liquidi o altri esperimenti utilizzando filamenti corti di actina, aggiungere la proteina di copertura alla miscela di actina dal passaggio 5.4. La quantità esatta di proteina di capping dipende dalla frazione attiva della proteina e dalla lunghezza dei filamenti di actina presi di mira, ma in genere, circa l'1-10% mol% di proteina di capping (rispetto all'actina) è sufficiente per creare filamenti corti per esperimenti con cristalli liquidi. La purificazione delle proteine con capping è descritta in³⁶.
6. Per iniziare a polimerizzare l'actina, aggiungere la miscela di actina alla soluzione tampone F e alla miscela pipetta.
7. Lasciare polimerizzare l'actina nella provetta da microcentrifuga a RT, quindi aggiungerla alla cella del campione dopo 10-30 minuti.
8. Facoltativo: se si prepara un campione a cilindro, aspirare l'intera soluzione in un puntale per pipetta in modo che sia pronta per essere pipettata nella fase 7.4 del caricamento della camera del campione a cilindro.

6. Facoltativo: preparare le emulsioni

NOTA: A volte è conveniente preparare questi campioni in emulsioni, che forniscono una camera di campionamento confinata. Le emulsioni sono preparate utilizzando reagenti simili a quelli di Chowdhury et al., il che si traduce in una fase continua di olio che ha gocce di emulsione acquosa mediata da tensioattivi⁴¹. In presenza di un agente di depversione, come la metilcellulosa, utilizzato in questo protocollo, i campioni di actina si affolleranno all'interfaccia acquosa di questa emulsione. Per i campioni su cui si basa questo protocollo, non si osserva una differenza tra la polimerizzazione dell'actina prima o dopo l'aggiunta alle emulsioni; Tuttavia, è stato riportato che la fase di polimerizzazione è importante da considerare in alcuni esperimenti di incapsulamento⁴².

1. Aggiungere 3,5 μl di tensioattivo a una provetta per microcentrifuga. Utilizzare una provetta per microcentrifuga trasparente, di colore chiaro o trasparente per questo passaggio.
2. Senza mescolare, aggiungere 5 μl della soluzione di actina alla sommità dello strato di olio-tensioattivo. Chiudere la provetta della microcentrifuga.
3. Tenendo la parte superiore della provetta per microcentrifuga, muovere il bordo inferiore della provetta per creare inizialmente una schiuma con emulsioni visibili. Continuare a muovere il tubo fino a quando la schiuma non mostra caratteristiche distinguibili quando è retroilluminata, indicando microemulsioni.
   NOTA: Quando si prepara un campione in emulsioni, una cella a flusso o un'altra camera del campione deve essere pronta prima di realizzare il campione di actina. La camera di campionamento del cilindro di vetro non funziona bene per le emulsioni in quanto si increspano all'interfaccia dell'aria piuttosto che sedimentare sulla superficie del vetro di copertura.

7. Caricare la camera del campione (camere cilindriche)

1. Pipettare 5 μL di soluzione di olio-tensioattivo sul fondo della camera del cilindro di vetro
   NOTA: In alternativa, i campioni possono essere realizzati passivando la superficie con un doppio strato lipidico supportato 11,29,30.
2. Inclinare il vetrino coprioggetti e ruotarlo lentamente in modo che la superficie del vetrino coprioggetti e il cilindro inferiore siano rivestiti con la soluzione tensioattiva.
3. Rimuovere la soluzione di olio-tensioattivo in eccesso con una pipetta per ottenere uno strato di olio il più sottile possibile, evitando che l'olio, che è volatile, evapori completamente.
4. Aggiungere immediatamente la soluzione campione del passaggio 5.7 alla camera.
5. Coprire la camera con un piccolo pezzo di nastro in PTFE per evitare l'evaporazione e il flusso.

8. Alternativo: caricare la camera del campione (cella di flusso)

1. Per prepararsi al caricamento della cella a flusso, miscelare una piccola quantità di resina epossidica per 5 minuti. In genere è sufficiente una goccia con un'area inferiore a 0,5^cm2 .
2. Per posizionare il campione nella cella a flusso, pipettare prima 1-3 μL di soluzione di olio-tensioattivo nel canale del campione della cella a flusso per creare un piccolo tappo di soluzione che bagna il canale.
3. Pipettare immediatamente un volume di soluzione campione o di sospensione di emulsione lentamente all'ingresso della cella di flusso per riempire il canale. Tipicamente, per un canale di circa 2 mm, il volume è di circa 8 μl. L'ingresso è il lato a cui è stata aggiunta la soluzione olio-tensioattivo.
   1. Se il volume del campione supera il volume della cella di flusso, far passare il campione attraverso la cella di flusso posizionando un panno privo di lanugine o carta da filtro all'altra estremità del canale.
   2. Se il menisco della soluzione olio-tensioattivo si è ritirato, provocando un traferro, inclinare prima la cella di flusso per rimuovere il traferro all'ingresso prima di aggiungere il campione.
4. Se necessario, aggiungere un'ulteriore soluzione di olio-tensioattivo fino a quando l'aria non è più visibile nel canale o spingere ulteriormente il campione (in particolare per le emulsioni) nel canale.
5. Sigillare ogni lato del canale con resina epossidica per 5 minuti (miscelata subito prima di caricare la cella di flusso).

9. Immagine e aggiunta di miosina

1. Monta il campione sul microscopio e avvia l'imaging timelapse dell'actina utilizzando un obiettivo 20x, 40x, 60x o 100x con immersione in olio o acqua per fornire un'apertura numerica sufficientemente ampia per l'imaging ad alta risoluzione. In caso di polimerizzazione nella camera del campione, attendere la polimerizzazione per ~30 minuti o fino a quando non si verifica più un allungamento o un movimento visibile del filamento.
2. Facoltativo: aggiungi il reticolante.
3. Aggiungi la miosina attraverso le opzioni 1 o 2 di seguito.
   1. Aggiungere la miosina come dimero pipettato sulla parte superiore del campione (non è necessaria alcuna miscelazione perché il dimero della miosina si diffonde).
   2. Aggiungere la miosina come filamenti pre-polimerizzati. Le pipette mescolano circa la metà del volume totale molto lentamente per evitare di disturbare l'actina affollata.
      NOTA: Il metodo ideale per la miosina, oltre a ottenere la densità o la dimensione del filamento desiderata sulla superficie del vetrino coprioggetti, può variare per diverse architetture di actina e deve essere determinato sperimentalmente.
4. Avvia l'imaging time-lapse.

Results

Un'ampia gamma di assemblaggi di actina può essere formata in sistemi modello utilizzando proteine purificate seguendo la strategia generale descritta in questi metodi, in cui l'actina viene polimerizzata in filamenti in presenza di proteine accessorie che modificano l'architettura di assemblaggio (Figura 1). Quando l'actina viene polimerizzata in filamenti senza reticolanti o proteine di capping, forma reti di filamenti aggrovigliati (Figura 1A). L'aggiunta di ...

Discussion

Ci sono molte considerazioni da fare per produrre assemblaggi di actina riproducibili. Uno dei fattori più critici per la produzione di dati riproducibili e analizzabili è la superficie del vetro di copertura della camera del campione. Le proteine nei campioni di actina in vitro, in particolare la miosina, sono estremamente appiccicose e aderiscono alle superfici di vetro non trattate o mal trattate, rendendo il campione inutilizzabile (Figura 5A). ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provetta per microcentrifuga da 0,6 mL	Fisher Scientific	05-408-123
008-Fluorotensioattivo	RAN Biotechnologies	00115081361-6525	Soluzione alternativa a premiscelata
008-FluoroSurfactant in HFE7500	RAN Biotechnologies	008-FluoroSurfactant-2wtH-50G	Soluzione premiscelata
2-mercaptoetanolo (β-mercaptoetanolo)	Sigma Aldrich	63689	Numero CAS: 60-24-2 Soluzione madre: 25 mM in acqua MilliQ, conservata a 4 gradi; C
4-(2-idrossietil)piperazina-1-etano-sulfonato acido (HEPES)	Sigma Aldrich	H3375	Numero CAS: 7365-45-9
5 min Epossidico	Devcon	14250
	Citoscheletro di actina, Inc.	AKL99-A	>99% puro muscolo scheletrico di coniglio (alternato a purificante)
Actina (marcato con rodamina)	Citoscheletro, Inc.	AR05-A	Muscolo scheletrico di coniglio (alternato a purificante)
Adenosina 5′-trifosfato (ATP)	Sigma Aldrich	A6419	Numero CAS: 34369-07-8 Soluzione madre: 25 mM in acqua MilliQ, conservare a -20 ° C Conservare congelato per evitare l'idrolisi
Cloruro di calcio (CaCl2)	Sigma Aldrich	C5670	Numero CAS: 10043-52-4
Proteina di capping (topo)			Purificato dalla sovraespressione in E.coli con un HisTag Soluzione madre: 20 mM in tampone proteico di tappatura a -80 ° C
Catalasi da fegato bovino	Sigma Aldrich	C9322	Numero CAS: 9001-05-2 Soluzione madre: 85 ku/mL, conservare aliquotato con glucosio ossidasi a -20 gradi; C
Vetro di copertura	Fisherbrand	12544C	Borosilicato, #1,5, 24 mm x 40 mm Fisherbrand non Fisher Finest
D-(+)-Glucosio	Sigma Aldrich	G8270	Numero CAS: 50-99-7 Soluzione madre: 225 mg/mL in acqua MilliQ, conservare a -20 ° C
Ditiotreitolo (DTT)	Sigma Aldrich	3860-OP	Numero CAS: 3483-12-3 Soluzione madre: 1 M in acqua MilliQ, conservare a -20 ° C
Nastro biadesivo	3M	3136
Etilalcololo 200 prova	PHARMCO	111000200	Numero CAS: 64-17-5 200 prova
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N&primo;,Acido N&prima;-tetraacetico (EGTA)	Sigma Aldrich	E3889	Numero CAS: 67-42-5
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma Aldrich	E9884	Numero CAS: 60-00-4
Glucosio ossidasi	Sigma Aldrich 345386		Numero CAS: 9001-37-0 Soluzione madre: 135 mg/mL in acqua MilliQ, conservare aliquotata con catalasi a -20 ° C
Glicerolo	Sigma Aldrich	356352M	Numero CAS: 56-81-5
Imidazole	Fisher Bioreagenti	BP305-50	Numero CAS: 288-32-4
Cloruro di magnesio (MgCl2)	Bioreagenti Fisher	BP214	Numero CAS: 7786-30-3, 7791-18-6
Metilcellulosa	Sigma Aldrich	M0512	Numero CAS: 9004-67-5 15 centipoise
Microscopio Vetrini Microscopia Elettronica Piana	Scienze / Sigillo d'Oro	63710-05	3"x1", 1 mm di spessore
MilliQ	acqua Millipore	CUFBI001	Acqua ultrapura
Novec-7500 Fluido ingegnerizzato 3M		7100134816	Alternativo alla soluzione premiscelata
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma Aldrich	P3911	Numero CAS: 7447-40-7
Fosfato di potassio (KPO4)	Sigma Aldrich	P3786	Numero CAS: 7758-11-4
Polvere di acetone del muscolo scheletrico del coniglio	Pel-Freez Biologicals	41995-1	Utilizzato durante la purificazione dell'actina (alternato all'acquisto) Conservare circa 30 mM nel tampone di actina G a -80 ° C
Sodio Azide	Sigma Aldrich	71289	Numero CAS: 26626-22-8
Tetrametilrodammina-C6-maleimmide	AnaSpec	AS-81445	Numero CAS: 174568-68-4 Utilizzato durante la purificazione dell'actina (alternato all'acquisto) Conservare circa 30 mM nel tampone di actina G a -80 °C. Utilizzato per l'etichettatura dell'actina (alternato all'acquisto)
Acido cloridrico Tris (Tris HCl)	Sigma Aldrich	648317	Numero CAS: 1185-53-1
Bagno ad ultrasuoni	Emerson Branson