Un compito motorio fine per studiare la cinematica articolare in un modello preclinico di malattia neurodegenerativa

Sommario

L'attuale studio descrive un test del comportamento motorio fine per esaminare i deficit motori nei modelli di roditori, incluso il ratto TgF344-AD, utilizzando l'apprendimento automatico.

Abstract

La disfunzione motoria è una componente critica, ma spesso sottovalutata, delle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (AD) e le demenze correlate. Una nuova ricerca ha dimostrato che i compiti che coinvolgono il comportamento motorio fine, l'abilità visuospaziale e la funzione esecutiva negli esseri umani possono avere un potenziale nella diagnosi precoce della malattia. Tuttavia, si sa poco sui meccanismi esatti con cui questi compiti predicono il declino cognitivo e funzionale associato all'AD. Nel metodo attuale, è stato creato un compito motorio fine, Kinematic Motor Ability Task (KINEMAT), per esaminare i cambiamenti nella capacità motoria attraverso la progressione della malattia in modelli preclinici di AD rispetto ad altre malattie neurodegenerative e al normale invecchiamento utilizzando un software di apprendimento automatico gratuito e open source. Qui, è stata stabilita la prova di concetto con la progettazione, il test e l'implementazione del compito motorio fine in uno studio pilota su ratti Fisher 344 CDF con e senza disabilità motorie indotte da Armalina. Un'ulteriore convalida, con un modello di ratto con malattia di Alzheimer (TgF344-AD), ha ulteriormente dimostrato la fattibilità del modello e la sensibilità al compito. I ratti sono stati addestrati a raggiungere attraverso una piccola fessura nella parte anteriore della camera per recuperare una pallina di zucchero da una delle tre ciotole con difficoltà variabile. Il recupero dei pellet è stato valutato utilizzando una delle tre classificazioni: successo (afferrare e mangiare con successo il pellet di zucchero), drop (afferra ma lascia cadere il bocconcino dopo averlo afferrato) o fallimento (portata in cui non viene procurato alcun pellet o i pellet vengono espulsi dalla ciotola quando si tenta di afferrare). Sono state osservate differenze significative nella capacità motoria tra i ratti di controllo e quelli trattati con Harmaline, dimostrate dalla riduzione delle portate totali e dall'aumento della variabilità della posa delle zampe. I ratti TgF344-AD hanno anche mostrato una riduzione delle portate totali, nonché una riduzione dei successi in tutte le ciotole. Convalidando questo come un compito motorio fine nei roditori, ha il potenziale futuro per studiare l'invecchiamento normale e i modelli preclinici delle malattie neurodegenerative, inclusa l'AD, man mano che la patologia e i sintomi emergono nel tempo.

Introduzione

È stato dimostrato che la funzione motoria è compromessa nelle persone con demenza dovuta al morbo di Alzheimer (AD) o ad altri sottotipi (ad esempio, demenza con corpi di Lewy). La forza di presa e la velocità dell'andatura possono distinguere tra anziani cognitivamente compromessi e non compromessi ^1,2, ma non possono necessariamente distinguere tra diversi sottotipi di demenze (cioè bassa specificità)^1,2. Pertanto, continua ad esserci la necessità di nuovi strumenti diagnostici per la demenza precoce, possibilmente abbinati all'apprendimento automatico, per valutare modelli complessi e relazioni tra comportamento e stato di malattia ^3,4. I modelli animali sono preziosi per studiare la progressione delle malattie neurodegenerative per offrire informazioni sull'insorgenza precoce della malattia, sui correlati comportamentali e sull'integrazione dell'apprendimento automatico nelle pipeline di analisi per distinguere tra gravità e presentazione ^5,6,7.

Nuovi metodi comportamentali negli esseri umani hanno identificato compiti che coinvolgono l'abilità motoria fine insieme all'elaborazione cognitiva, come l'abilità visuospaziale e la funzione esecutiva ^8,9,10. Ad esempio, un compito funzionale degli arti superiori può tracciare i modelli di neurodegenerazione e può distinguere il decadimento cognitivo lieve (MCI) dall'AD. In questo compito, gli esseri umani spostano i fagioli crudi (due alla volta) da una tazza centrale di casa a una tazza bersaglio usando un cucchiaio. La fase del compito in cui i fagioli vengono acquisiti con il cucchiaio mostra associazioni più forti con la cognizione (in particolare, la memoria visuospaziale) rispetto alla fase in cui i fagioli vengono trasportati alla tazza bersaglio^11,12. Quando il cucchiaio entra nella tazza, può disturbare i chicchi nella tazza, il che significa che i movimenti del partecipante possono rendere il compito più difficile. Inoltre, man mano che la prova procede e il numero di fagioli nella tazza di casa diminuisce, il compito diventa più difficile (cioè, il tempo per acquisire i chicchi con il cucchiaio aumenta)¹³. È stato dimostrato che questo compito è correlato con la patologia specifica per l'AD (amiloide)^9,14 e la neurodegenerazione (atrofia ippocampale^)10,15, suggerendo che le sue prestazioni possono dipendere dai circuiti neurali e dai processi comportamentali che sono influenzati nelle prime fasi del processo patologico. È noto che l'inizio, la pianificazione, l'esecuzione e la correzione del movimento sono controllate da una rete diversificata che attraversa il cervello, compresa la corteccia motoria, con corpi cellulari dei motoneuroni superiori situati nella corteccia cerebrale che sinapsi sui motoneuroni inferiori nel midollo spinale¹⁶. Questi motoneuroni inferiori comunicano direttamente con i muscoli per controllare il movimento alla giunzione neuromuscolare. I tratti ascendenti trasportano le informazioni sensoriali dalla periferia al midollo spinale, mentre i tratti discendenti all'interno del cervello comunicano informazioni direzionali su come e dove tornare ai muscoli ^17,18. Comprendere come questi percorsi siano selettivamente influenzati dalla patologia AD è fondamentale per comprendere la progressione della malattia, in particolare perché i modelli genetici animali, tra cui il topo 3xTg-AD e il ratto TgF344-AD, sono stati precedentemente utilizzati per studiare come i geni AD influenzano la locomozione, la coordinazione e altre menomazioni motorie 19,20,21. In genere, questi compiti si concentrano sui disturbi motori grossolani relativi al movimento di tutto il corpo, ma i deficit motori negli esseri umani sono molto più variabili, il che può essere difficile da identificare nei roditori²². Sono quindi necessari nuovi compiti per colmare il divario tra i modelli umani e animali e catturare questa variabilità.

Una regione del cervello che è comunemente implicata nelle menomazioni motorie e nei tremori è il cervelletto²³. Il cervelletto è un regolatore significativo di movimenti precisi e coordinati e agisce come elaboratore di informazioni sensoriali per fornire feedback attraverso percorsi discendenti per correggere e adattare questo movimento volontario^24,25. È importante notare che l'atrofia cerebellare è stata riconosciuta in individui con AD, ma, contrariamente ad altre regioni come l'ippocampo, l'aumento della deposizione di amiloide nel cervelletto non è correlato con l'aumento dell'atrofia²⁶. Mentre la progressione della patologia AD è diversa nel cervelletto, ci sono connessioni bidirezionali multisinaptiche tra il cervelletto e l'ippocampo che sono probabilmente interrotte in AD 27,28,29. In particolare, esistono connessioni funzionali tra il cervelletto e l'ippocampo, poiché è stato documentato che i deficit di memoria si verificano dopo la resezione del tumore cerebellare 30,31,32,33,34,35,36,37. Nei roditori, le cellule di posizione dell'ippocampo vengono interrotte con una perturbazione cerebellare³⁸. Questi deficit sovrapposti nella memoria, nella socialità e nel controllo motorio evidenziano l'importanza di scoprire potenziali cambiamenti precoci nelle vie motorie che si verificano prima del declino cognitivo 30,31,38,39. Con l'implementazione di compiti motori fini nella ricerca precoce sull'AD, potremmo iniziare a rimodellare la comprensione tradizionale dell'AD come un semplice disturbo cognitivo e reindirizzare gli sforzi diagnostici verso cambiamenti motori precoci che possono predire la progressione della malattia e possono essere più ampiamente distinguibili tra individui che invecchiano con e non alterazione cognitiva.

Per capire come il comportamento motorio fine possa essere indicativo di cambiamenti nella struttura del cervello, è stata creata e testata una versione per roditori del compito umano sopra descritto. Questo compito per roditori è stato chiamato KINEMAT (KINEmatic Motor Ability Task) e si discosta dai precedenti compiti di raggiungimento che richiedono il recupero di un singolo pallino da un piedistallo o da una scala e il punteggio più semplicistico come risultato del posizionamento coerente del pellet in tutte le fasi del compito 40,41,42,43,44,45,46^{, 47,48}. Questo compito di raggiungimento motorio fine include nuovi metodi di punteggio, ciotole con varie difficoltà e funzioni autoperturbanti per imitare la controparte umana, con il movimento dei pallini e le successive regolazioni della strategia dei partecipanti al centro del design. Questo compito utilizza gli strumenti di apprendimento automatico, Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) e keypoint-MoSeq^49,50, consentendo una misurazione imparziale e quantitativa della capacità motoria fine e dei comportamenti di raggiungimento. Mentre altri modelli computazionali degni di nota sono stati sviluppati per compiti di raggiungimento abili nei roditori ^44,45,51, keypoint-MoSeq elimina il rumore per consentire una quantificazione precisa del movimento e delle pose di presa⁵⁰. Le prestazioni del compito e la strategia di apprendimento motorio sono state ricostruite utilizzando una telecamera di visione artificiale ad alte prestazioni in ratti tipici e con disturbi motori utilizzando Harmaline⁵². L'armalina iperattiva il nucleo olivare inferiore e interrompe la funzione cerebellare attraverso fibre rampicanti glutammatergiche ^53,54. Inoltre, la capacità motoria fine è stata esaminata in un sottogruppo di ratti TgF344-AD. Pertanto, ci si aspettava che il compito motorio fine avrebbe trovato menomazioni misurabili nei ratti trattati con Harmaline e TgF344-AD rispetto alle loro controparti tipiche come prova di concetto. Questo protocollo descrive la costruzione del compito motorio fine, l'addestramento e il test degli animali e la quantificazione del comportamento di raggiungimento utilizzando SLEAP e keypoint-MoSeq.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Arizona State University.

1. Progettazione e costruzione della camera

1. Preparare i pannelli acrilici trasparenti. Gli schemi della scatola si trovano a https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask. Tagliare pannelli acrilici trasparenti alle seguenti dimensioni (tutti i pannelli hanno uno spessore di 1 cm):
   1. Ritagliare due pannelli laterali: 26 cm × 22 cm.
   2. Ritaglia un pannello superiore: 27 cm × 12 cm.
   3. Ritaglia il primo pannello inferiore: 26 cm x 10 cm
   4. Ritaglia il secondo pannello inferiore: 26 cm x 11 cm
   5. Taglio di un pannello frontale: 20 cm × 11 cm.
   6. Ritaglia un pannello posteriore: 20 cm x 12 cm
   7. Ritagliare una fessura del pannello frontale (140 mm x 12 mm). Posizionare la fessura centralmente, con il bordo inferiore allineato con la parte inferiore del pannello.
   8. Ritaglia un solco interno: 1 cm. Sui bordi interni dei pannelli laterali, creare una rientranza o una scanalatura per consentire al pannello frontale di scorrere saldamente dentro e fuori.
      NOTA: Se la funzione di scorrimento non è richiesta, il pannello frontale può essere incollato in modo permanente per semplificare la costruzione.
   9. Praticare dei fori equidistanti (5 mm di diametro) nel secondo pannello inferiore per consentire la caduta dei pallini in caso di caduta. Distanzia i fori di 1 cm l'uno dall'altro in uno schema a griglia.
2. Assemblare la camera con l'adesivo (Figura 1A).
   NOTA: Utilizzare un adesivo forte e trasparente progettato esplicitamente per i materiali acrilici.
   1. Pannelli laterali: Applicare una linea continua di adesivo lungo i bordi del pannello inferiore. Posizionare i pannelli laterali verticalmente e premere con decisione. Lasciare indurire l'adesivo secondo le istruzioni di produzione.
   2. Pannello posteriore: applicare l'adesivo sui bordi posteriori dei pannelli laterali e inferiori. Posizionare il pannello posteriore e premerlo in posizione.
   3. Pannello superiore: applicare l'adesivo sui bordi superiori dei pannelli laterali e posteriori. Posizionare il pannello superiore e premere con decisione.
   4. Pannello frontale: far scorrere con cautela il pannello frontale nelle scanalature sui pannelli laterali, assicurando una vestibilità aderente ma liscia, oppure applicare l'adesivo lungo i bordi del pannello frontale e fissarlo ai pannelli laterali, superiore e inferiore.
      1. Testare il movimento del pannello e confermare che si allinei esattamente con il resto della camera.
3. Illuminazione di allestimento
   1. Posizionare la luce a infrarossi (IR) sull'estremità opposta della camera di prova, puntando verso la camera. Posiziona un foglio di carta da costruzione bianca sopra la camera per riflettere la luce verso il basso.
      NOTA: L'illuminazione è fondamentale per un corretto tracciamento e tutte le registrazioni devono essere effettuate sotto la luce IR in una stanza buia.
4. Prepara la ciotola da allenamento.
   1. Realizza la ciotola di allenamento con un raggio di 31 mm e un'estensione di 32 mm utilizzando una stampante 3D. File STL disponibile su https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask (Figura 1B: in alto)
   2. Fissare la ciotola di allenamento al fondo della camera direttamente davanti alla fessura. Posiziona la ciotola in modo che il suo bordo superiore sia all'incirca sopra il livello degli occhi del topo all'interno della camera, usando un supporto di supporto, come un blocco di legno.
5. Preparare le ciotole di prova (Figura 1B: centro e fondo).
   1. Stampa le ciotole utilizzando i file STL forniti. Sono disponibili due diversi design della ciotola: "Plain-Less" e "Plinko". (https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask)
      1. Ispezionare la precisione dimensionale e la durata (dimensioni: 50 mm di profondità x 40 mm di larghezza).

2. Hardware del computer e della fotocamera

1. Utilizzare un treppiede per montare la fotocamera in modo sicuro.
2. Posizionare la telecamera a circa 15-20 cm dal pannello frontale della camera.
   1. Regola l'altezza e l'angolazione del treppiede in modo che la fotocamera catturi una vista isometrica a 45° sia della fessura che della ciotola.
      NOTA: Assicurati che il campo visivo della fotocamera comprenda la zampa del topo e la portata completa, la fessura e la ciotola di allenamento o di prova. Se necessario, testare diversi angoli e distanze per ottenere una visibilità ottimale.
3. Scarica il software da associare alla fotocamera per le registrazioni comportamentali (https://www.teledynevisionsolutions.com/products/spinnaker-sdk) e apri il software per utilizzare la fotocamera per registrare il comportamento.
   1. Utilizzare le seguenti impostazioni della fotocamera: modalità di acquisizione: continuo, frequenza fotogrammi: 216 Hz, modalità di esposizione: temporizzata, esposizione automatica: disattivata, tempo di esposizione: 4430 μs, guadagno automatico: disattivato, guadagno: 16,85 dB, gamma: 0,8.
   2. Le impostazioni di registrazione sono le seguenti: tipo di file H264, bitrate 5 milioni (5.000.000).
   3. Per registrare per 10 minuti, immettere 130.000 fotogrammi e utilizzare la modalità streaming per salvare.
      NOTA: Si consiglia l'uso di una macchina dedicata con un minimo di 16 GB di RAM e un disco rigido interno a stato solido da 1 TB per l'archiviazione dei dati.

Figura 1: Schema del compito motorio fine. (A) Rappresentazione a fumetti del compito motorio fine in cui un topo raggiunge attraverso una fessura per ottenere una pallina di zucchero. Le distanze vengono registrate per l'analisi dell'apprendimento automatico. Ci sono tre ciotole separate utilizzate: una ciotola da allenamento (in basso a sinistra), una ciotola Plain/Less (in basso al centro) e la ciotola Plinko (in basso a destra) con ostruzioni cerchiate in rosso. (B) Schemi di ciascun design della ciotola, inclusa la ciotola di allenamento (superiore), la ciotola Plain/Less (centrale) e la ciotola Plinko (inferiore). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione degli animali

1. Accoppiare i ratti Fisher 344 CDF (maschio e femmina, >3 mesi di età) in coppia su un ciclo inverso luce/buio per consentire il test quando gli animali sono più attivi.
2. Pesare tutti i roditori 1 settimana prima dell'inizio dell'assuefazione e fornire ~30 g di cibo per un roditore di peso superiore a 300 g e ~15 g per un roditore di 100-300 g per mantenere gli animali al 90% del peso corporeo.
   1. Pesare quotidianamente i ratti e regolare il cibo di conseguenza, riducendo la quantità di cibo fornita di 1-2 g al giorno fino a quando il roditore raggiunge il 90% del peso corporeo. La manipolazione quotidiana aiuterà anche ad abituare gli animali allo sperimentatore.
   2. Durante l'assuefazione e il test, continuare questa procedura, regolando il cibo di +/- 0,5 g quando il peso scende al di sotto o supera la soglia.
   3. Durante i test, pesare gli animali prima dell'inizio dell'attività, quindi fornire il cibo assegnato immediatamente dopo il ritorno nella gabbia dopo il completamento dell'attività.
      NOTA: Qualsiasi perdita improvvisa di peso (>15%) nell'arco di 1-2 giorni potrebbe segnalare un problema di fondo e dovrebbe essere consultato un veterinario.

4. Assuefazione (2 giorni)

1. Accendi la luce IR, la fotocamera e il computer.
2. Posizionare la ciotola da allenamento con i pellet nella fessura di apertura, assicurandosi che la punta della ciotola si estenda leggermente nell'apparecchio (circa 2 cm inizialmente).
3. Trasferisci le gabbie nella sala prove e lascia che i ratti si acclimatino per 5 minuti.
4. Giorno 1: Aggiungi i ratti alloggiati in coppia alla camera e lasciali esplorare per 20 minuti. Metti 3-5 pellet di zucchero nella gabbia domestica dopo il test per consentire ai ratti di familiarizzare con i pellet.
   NOTA: La dimensione del pellet di 45 mg consente il prelievo di un singolo pellet.
5. Pulire la camera con una salvietta disinfettante tra i ratti. Alla fine della giornata, spruzzare con etanolo per disinfettare.
6. Giorno 2: Abituare i roditori individualmente all'apparecchio utilizzando la stessa procedura (20 min). Se i roditori sembrano spaventati o evitano la parte anteriore dell'apparato e la ciotola, continua ad abituarti fino a quando questo comportamento non si risolve. Continuare a dare pellet come dolcetti nella gabbia di casa (3-5 pellet).
   1. Per favorire la familiarità e l'avvicinamento alla ciotola, spostare progressivamente il tubo allungato all'interno dell'otturatore dell'apparecchio durante l'assuefazione, spostando la punta di 0,5 cm alla volta più vicino al roditore per facilitare il raggiungimento.
      NOTA: L'assuefazione, il test e l'allenamento devono essere eseguiti nello stesso luogo sotto l'illuminazione rossa per eliminare l'impatto di un nuovo ambiente.

5. Modellatura (10 giorni)

1. Accendi la luce IR, la fotocamera e il computer.
2. Trasferisci le gabbie nella stanza e lascia che i ratti si acclimatino per 5 minuti.
3. Utilizzando la ciotola di allenamento, fornire 1-5 pellet lungo l'estensione, con l'estensione posizionata completamente all'interno dell'attrezzo il primo giorno. Addestra gli animali in sessioni di 10 minuti. La registrazione durante la sagomatura è facoltativa.
   NOTA: Per familiarizzare i roditori con i pellet, è importante fornire alcuni pellet di zucchero all'interno dell'apparecchio stesso per ridurre l'avversione ai pellet nella ciotola. I roditori probabilmente mangeranno i pellet all'interno dell'apparecchio perché sono facilmente reperibili e riconosceranno questi pellet nella ciotola. È importante abituarli a rivolgere la direzione corretta dell'apparecchio e ad abituarsi a toccare la ciotola.
4. Nei giorni successivi di allenamento, iniziare a ritrarre l'estensione della ciotola dall'attrezzo. Ciò richiederà ai roditori di avvicinarsi all'apertura dell'apparato nella parte anteriore e incoraggiare l'interazione con l'estensione appena fuori dall'apparato.
   1. Il design consente il posizionamento specifico dei pellet. Ad esempio, posiziona i pellet all'estremità della ciotola più vicina al roditore e allontanati gradualmente per incoraggiare il roditore a uscire dall'apparecchio.
5. Man mano che i roditori si sentono più a loro agio nel prendere i pellet dal bordo delle estensioni, anche se solo per via orale, iniziano a introdurre pellet attraverso le pinzette per incoraggiare il comportamento di raggiungimento.
   1. Tieni un pellet nelle pinzette appena fuori dall'apparato, consentendo ai roditori di toccare semplicemente le pinzette. Premia immediatamente questo comportamento per incoraggiare ulteriori raggiungimenti.
   2. Man mano che i roditori si sentono più a loro agio nel toccare le pinzette, consenti loro di allungarsi un po' di più dall'apparecchio per toccare o afferrare il pellet tenendo le pinzette un po' più lontane dall'apertura dell'apparato.
      NOTA: Prendere nota di tutti i comportamenti degli animali, in particolare se gli animali hanno paura della ciotola o non la raggiungono. Questi animali potrebbero aver bisogno di ulteriori giorni di modellatura.
6. Una volta che i roditori raggiungono in modo continuo e indipendente per un minimo di 3 giorni (Figura 2A), passano alla ciotola semplice fino a quando non viene stabilito il comportamento di raggiungimento (raggiungimento continuo per 3 giorni con almeno 10 raggi indipendenti al giorno).
   1. Quando si introducono i roditori nella ciotola Plain, assicurarsi che la ciotola sia riempita il più possibile di pellet in modo che i roditori possano visualizzare i pellet sul lato della ciotola.
      NOTA: In questa fase potrebbe essere necessario incoraggiare le allunghe utilizzando le pinzette.
7. Pulire la camera con una salvietta disinfettante tra i ratti. Alla fine della giornata, spruzzare con etanolo per disinfettare.

6. Preparati per il test:

1. I test vengono completati nell'arco di 9 giorni (Figura 2A), con ogni roditore che esegue 3 prove per ciotola, con ogni prova di 10 minuti che si verifica in giorni consecutivi.
   NOTA: Il test viene eseguito al meglio al mattino.
2. In ogni giorno di test, pesare i ratti. Una volta completato, i ratti vengono lasciati nelle gabbie domestiche per 30-60 minuti prima del test, poiché la pesatura può indurre stress e inibire il comportamento di raggiungimento.
3. Accendi il computer e configura la ciotola. Collega la fotocamera e accendi. Aprire il software di registrazione e regolare le impostazioni della fotocamera come descritto nella sezione 2 del protocollo.
   NOTA: Si consiglia di registrare almeno 200 fotogrammi al secondo (fps) per catturare tutti i movimenti della zampa.
4. Allinea la ciotola nell'inquadratura della fotocamera e visualizzala nel software di registrazione premendo il pulsante di riproduzione. Posizionare la ciotola a filo con l'apparecchio e la telecamera con un angolo di 45° rispetto al lato della ciotola.
   1. Muovi la fotocamera per catturare l'allungamento direttamente frontalmente per studiare il movimento delle singole dita e del palmo, nonché il movimento relativo all'altezza del palmo sopra la ciotola durante l'allungamento.
   2. Posizionare la fotocamera direttamente perpendicolarmente alla ciotola per acquisire il movimento del braccio e della mano da e verso la ciotola, ma non il posizionamento delle cifre o i dettagli sul comportamento di presa.
      NOTA: Sebbene si raccomandi un angolo di 45° per acquisire il movimento lungo i piani x, y e z, altre configurazioni possono acquisire più facilmente le informazioni per lo studio desiderato.

7. Test (9 giorni)

1. Metti i topi nella stanza per abituarsi per 1 ora.
2. Posiziona la prima ciotola sulla piattaforma della ciotola, fissandola con cera dentale. Assicurarsi che la parte anteriore della ciotola sia a filo e centrata con l'apertura dell'apparecchio.
3. Assegna un nome al file video all'interno di Spinview con il numero di identificazione del ratto, la data di registrazione e l'ora di registrazione.
4. Metti il topo nell'apparecchio. Chiudi il coperchio e posiziona sopra il cartoncino bianco per deviare la luce.
5. A questo punto, ricontrolla l'angolazione della telecamera per assicurarti che venga catturata la scena appropriata e regola la ciotola se non è centrata.
6. Versare la giusta quantità di pellet nella ciotola e premere Start Recording.
   Giorno 1-3 Ciotola liscia: ~100 pellet
   Giorno 4-6 Meno ciotola: ~50 pellet
   Giorno 7-9 Ciotola Plinko: ~50 pellet
7. Rimanere nella stanza durante i test per monitorare continuamente il ratto, prendere appunti sul raggiungimento delle prestazioni e del comportamento e aggiungere pellet se necessario per mantenere la quantità corretta.
   1. Per la ciotola semplice, assicurati che i roditori possano vedere i pellet oltre il bordo della ciotola e che i pellet possano sempre essere ottenuti (ad esempio, riempiendo la ciotola durante la prova man mano che i pellet diminuiscono, i pellet vengono stratificati).
   2. Per la ciotola Less: controlla che i pellet non siano impilati l'uno sull'altro e che ci sia un po' di spazio tra i pellet, permettendo loro di disperdersi quando il topo tenta di raggiungerlo.
   3. Per la ciotola Plinko: assicurarsi che ci sia abbastanza pellet da essere accessibile tra gli ostacoli.
8. Riporta l'animale nella sua gabbia di casa e fornisci il cibo assegnato. Pulire la camera con una salvietta disinfettante tra i ratti.
9. Alla fine della giornata, spruzzare con etanolo per disinfettare l'intera camera e prepararsi per il giorno successivo.
   NOTA: Se si testano sia i roditori maschi che le femmine, assicurarsi di controbilanciare i sessi con alcune femmine e alcuni maschi testati la mattina presto e un mix simile testato più tardi. Mantenere l'ordine dei tester durante l'intero esperimento.

Figura 2: Addestramento e test di ratti che eseguono il compito motorio fine. (A) Cronologia dell'esperimento. I ratti sono stati abituati all'apparecchio per due giorni, quindi sono stati sottoposti a procedure di formatura per 10 giorni. Gli animali sono stati testati per la capacità motoria fine in tutte e tre le ciotole per tre giorni ciascuna. Quindi, agli animali è stata iniettata l'armalina e ritestati su ogni ciotola per tre giorni. (B) I ratti (n = 6) sono stati sottoposti a due diverse ciotole (ciotola di addestramento e Plain) durante le procedure di modellatura, e il tipo di ciotola è stato cambiato il giorno 5 per migliorare i bracci. C'è stato un aumento significativo della modellazione nell'arco di 10 giorni per raggiungere i criteri (F(9, 45) = 13,5, p < 0,001). La barra grigia indica l'interruttore tra l'originale e l'attuale ciotola di allenamento a tubo allungato. (C) Per testare tutte e tre le ciotole, c'è stata una differenza significativa nelle portate totali nei 9 giorni di test (F(8, 32) = 3,74, p = 0,003). Nota: il ratto 2 è stato rimosso dopo la modellatura. La ciotola Plinko ha comportato differenze significative tra la ciotola Less (p = 0,001) e la ciotola Plain (p = 0,027). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

8. Modellazione della distruzione motoria fine utilizzando Harmaline

NOTA: Per identificare gli effetti dei disturbi motori sulla capacità motoria fine e sulle prestazioni nel compito motorio fine, ai ratti è stata iniettata con Harmaline (10 mg/kg), un alcaloide β-carbolina che è un inibitore reversibile della monoamino ossidasi-A e ha come bersaglio l'oliva inferiore 52,55,56,57. L'armalina nei modelli di roditori influisce sulla postura e sull'equilibrio, limita la coordinazione motoria fine e induce interruzioni motorie negli arti superiori.

1. Pesare i ratti per calcolare la dose corretta di Armalina.
2. Lasciare che i ratti si abituino alla sala di prova per 1 ora.
3. Accendi il computer e configura la ciotola. Collega la fotocamera e accendi. Aprire il software di registrazione e regolare le impostazioni della fotocamera come descritto nella sezione 2 del protocollo.
4. Iniettare nei roditori Armalina (10 mg/kg, i.p.).
5. Dopo 15 minuti, versare i pellet nell'apposita ciotola e iniziare a registrare. Metti alla prova il ratto su ogni ciotola per 3 giorni.
   Giorno 1 Ciotola liscia: ~100 pellet
   Giorno 2 Meno ciotola: ~50 pellet
   Giorno 3 Ciotola Plinko: ~50 pellet
   NOTA: Monitorare il sito di iniezione per anomalie, tra cui irritazione della pelle, comportamenti dolorosi, atassia, ipotermia e cambiamenti posturali fino a 3 ore dopo l'iniezione. Dopo le finestre di 3 ore, continuare a monitorare eventuali cambiamenti nel comportamento, comprese le latenze per mangiare o bere o qualsiasi tremore residuo.

9. Analisi video utilizzando l'apprendimento automatico

NOTA: Dopo la raccolta dei dati e la registrazione video, i reach sono stati contati a mano e valutati come segue: Successo (recupero e consumo di pellet), Drop (recupera il pellet ma rilascia il pellet prima del consumo), Fallimento (impossibile recuperare il pellet). Questi dati con punteggio manuale sono stati utilizzati come dati di base per l'analisi dell'apprendimento automatico.

1. Utilizzando il codice Python personalizzato a https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask, sono stati effettuati confronti tra animali trattati con Baseline e Harmaline per identificare i cambiamenti nelle prestazioni di portata (Figura 3, Figura 4, Figura 5 e Figura 6).
2. Per analizzare la cinematica congiunta del comportamento di raggiungimento, tra cui la traiettoria di portata, la conformazione e la posizione della zampa e i cambiamenti nella strategia di portata tra i vari tipi di ciotola, utilizzare il software di apprendimento automatico gratuito e open source Social LEAP Estimates Animal Poses (SLEAP) (vedi https://sleap.ai/ per una spiegazione più ampia e una guida passo passo all'utilizzo del programma open source⁴⁹).
   NOTA: SLEAP⁴⁹ può essere scaricato all'indirizzo https://github.com/talmolab/sleap.
3. Apri un nuovo progetto e aggiungi 3 video dell'attività di raggiungimento.
4. Crea uno scheletro composto da 15 nodi: 1 parte superiore del braccio, 1 polso, 1 centro del palmo, 4 basi, 4 nocche e 4 nodi per la punta delle dita (scarica lo scheletro su https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask).
5. Aggiungi i bordi tra i nodi in modo che la parte superiore del braccio si colleghi al polso, quindi al centro del palmo. Dal centro del palmo, collegare i nodi della base, delle nocche e della punta delle dita in modo che il centro del palmo sia sempre il nodo iniziale (Figura 7A).
6. Etichettare un minimo di 50 montature prima dell'allenamento di corsa. Qui si può addestrare un nuovo modello o utilizzare i modelli per centrato e centroide sul github: https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask.
7. Una volta addestrato il modello, apri un nuovo video ed esegui inferenza: trackin.match: greedy, n_instances:1, tracking.clean_instance_count: 1, tracking.target_instance_count: 1, tracking.pre_cull_to_target: 1.
   NOTA: l'inferenza può essere eseguita come script bash in un cluster locale. I video tracciati potrebbero richiedere la correzione di bozze (vedere https://sleap.ai/ per le istruzioni di correzione di bozze).
8. Per analizzare ulteriormente i nodi e comprendere le differenze tra i gruppi nella cinematica articolare, utilizzare il keypoint-MoSeq⁵⁰ gratuito e open-source (vedere https://github.com/dattalab/keypoint-moseq per i dettagli sul download e le istruzioni per l'uso).
9. Creare sillabe discrete di comportamento utilizzando keypoint-MoSeq⁵⁰ (Figura 7B). Eseguire ulteriori analisi per mappare la frequenza di transizione, la probabilità e le variazioni nella frequenza delle transizioni tra le condizioni di Harmaline e Baseline per ciotola (Figura 7C, D). Vedere https://github.com/verpeutlab/ADFineMotorTask per il codice di analisi.

Figura 3: Cambiamenti nell'allungamento tra le ciotole e nel trattamento. (A) Per i test di base (n = 5), in tutte e 3 le ciotole, c'era una differenza significativa nei tratti totali (H(df) = 8,48, p = 0,014, Kruskal-Wallis), con più tratti che si verificavano con il tipo di ciotola Plinko (p = 0,011, test di Dunn post-hoc con correzione di Bonferroni). (B) La perturbazione armalina (n = 5) non ha provocato differenze tra i tipi di ciotola. Gli errori sono segnalati come S.E.M. *p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Confronto delle prestazioni tra le condizioni e tra i tipi di ciotola. (A) C'è stata una ciotola significativa (F(2) = 5,78, p = 0,007) e una differenza di esito (F(2) = 3,92, p = 0,029) durante i test di base. I tentativi di portata sono aumentati man mano che il tipo di ciotola è diventato più difficile, anche se le distanze sono state ridotte rispetto alla linea di base in tutte le ciotole in condizioni di armalina. (B) Non sono state riscontrate differenze nei ratti trattati con Armalina per il conteggio della portata tra le ciotole. (C) C'era una differenza di esito significativa (F(2) = 2,07, p < 0,001) durante i test di base quando analizzati in base alle prestazioni. (D) Non sono state riscontrate differenze nei ratti trattati con Armalina per quanto riguarda le prestazioni della ciotola o dei risultati. Gli errori sono segnalati come S.E.M. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Confronto tra le condizioni basali e quelle di Armalina. (A) Non ci sono state differenze nel successo delle prestazioni tra le condizioni. (B) Per il conteggio dei guasti, c'era una differenza significativa tra le condizioni di base e quelle di Harmalina (H(df) = 4,85, p = 0,028, Kruskal-Wallis) con un effetto significativo riscontrato nella condizione di Armalina (p = 0,028, test di Dunn post-hoc con correzione di Bonferroni). Gli errori sono segnalati come S.E.M. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Tassi di apprendimento e di raggiungimento. (A) Gli animali armalini avevano un tasso di apprendimento perturbato rispetto alla condizione di base (t-stat = 2,833, p = 0,022). (B) Per i tratti totali al minuto, c'è stata un'interazione significativa tra ciotola (meno) e condizione (armalina) (F(1,5) = 9,83, p = 0,002, modello lineare misto) e ciotola (plinko) e condizione (armalina) (F(1,5) = 22,67, p < 0,001, modello lineare misto). Harmaline ha ridotto i colpi totali al minuto in tutti i tipi di ciotola (Meno: p = 0,01, Plinko: p < 0,001) rispetto al basale. Gli errori sono segnalati come S.E.M. *p < 0.05, ***p < 0.001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: L'apprendimento automatico identifica pose e strategie di attività uniche. (A) Posizioni dei nodi sulla zampa di ratto etichettate utilizzando SLEAP. (B) Esempi di sillabe identificate dal keypoint-MoSeq durante il reaching. (C) Matrice delle frequenze di transizione del bigramma tra sillabe consecutive. Le probabilità di transizione sono normalizzate dal conteggio totale dei bigrammi. (D) Un grafo di transizione che confronta le differenze di transizione delle sillabe tra Harmaline e Baseline. I nodi del grafo rappresentano le sillabe e gli spigoli indicano le transizioni tra di loro. Gli spigoli più prominenti indicano transizioni di sillabe con frequenze più alte. Le connessioni rosse indicano una transizione sovraregolata, mentre una connessione blu indica una transizione sottoregolata negli animali trattati con Armalina. I cerchi rossi indicano un uso regolamentato verso l'alto, mentre un cerchio blu indica un uso regolamentato verso il basso della sillaba indicata negli animali trattati con Armalina. Sono state escluse le coppie di sillabe con frequenze inferiori a 0,005. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

Dopo che i ratti hanno raggiunto una restrizione alimentare del 90% del peso corporeo, sono stati abituati alla camera per 2 giorni, quindi sono stati sottoposti a procedure di modellatura per 1-2 settimane. Il numero di tiri riusciti, caduti e falliti è stato valutato da un osservatore addestrato all'oscuro di ogni condizione. Nel corso di 9 giorni (basale), i ratti sono stati testati per la capacità motoria fine su 3 diverse configurazioni di ciotola (Plain, Less e Plinko). Quindi, agl...

Discussione

I compiti di raggiungimento per i roditori sono comunemente limitati a singoli pellet e non includono ostruzioni o caratteristiche autoperturbanti, che sono difficoltà comuni per i pazienti con patologia neurodegenerativa. Il metodo qui presentato, che utilizza sia un'attività di raccolta dei pellet reinventata che l'apprendimento automatico, è in grado di rilevare sia la coordinazione che la strategia attraverso l'analisi delle caratteristiche e delle transizioni di posa, oltre ai movim...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiale per stampa 3D	Amazon (Ouverture)	B07PGY2JP1	Filamento PLA 1,75 mm Filamento per stampante 3D PLA, Precisione Dimensionale +/- 0,03 mm
Fotocamera	Edmond Optics	BFS-U3-13Y3M-C	1,3 MP, Mono, 170 FPS, ON Semi PYTHON 1300 x2
Cavi della telecamera	Edmond Optics	ACC-01-2300	USB 3.1, 3 m, cavo da tipo A a Micro-B (chiusura)
Obiettivo della fotocamera	Laboratori Thor	MVL5WA	Obiettivo a visione artificiale formato EFL da 4,5 mm F/1.4, 1/2"
Connessione fotocamera-treppiede	Edmond Optics	88-210	Collegamento della fotocamera al treppiede
Salviette detergenti	Amazon (Sani-Cloth)	B00KMZ7KMO	AF3 Detergente disinfettante per superfici Cartuccia Dust Mild Scent 160 Ct P13872
Computer	Dell	Precisione	Intel Core i7-13700 @ 2,1 GHz, NVIDIA T1000 8 GB, RAM 16 GB
Luce IR	Amazzonia (Serlium)	B0BJFDBT44	Telecamera Luce IR 48 LED Illuminazione IR Luci Impermeabile a infrarosti Luce notturna per sicurezza Telecamera CCTV
Colla per pannelli	Amazon (Sdintar)	B0B1DLRPNZ	Colla per vetro
Plexiglass	Amazon (TOOLINHAND  USA)	B0BRJ1L8TR	12 e volte; Fogli trasparenti in acrilico/plexiglass da 12" - trasparenti 1/8" Spesso (3 mm) e nbsp;
Python	Python Software Foundation	Python 3.7
Spinview	Teledyne Technologies	Versione 3.1.0.79
Pellet di zucchero (45 mg)	Bioserv	F0023	45 mg, non aromatizzato 50.000/scatola; Ingredienti: Saccarosio, Destrosio, Stearato di Magnesio, Silicato di calcio, Olio minerale
Treppiede	Amazon (YOUYI)	B086PYJF9D	Treppiede con webcam per scrivania flessibile Amazon
Pinzette	Strumenti scientifici di qualità	11064-07	Pinza dell'iride
Cera	Amazon (Ortomeccanica)	B00FKDC0UU	Orthowax autentico