Isolamento e coltura di cellule primarie di Müller retiniche da ratti Sprague-Dawley (SD)

Le cellule gliali di Müller retiniche (RMC), la macroglia predominante nella retina, costituiscono il nucleo dell'unità neurovascolare retinica ^1,2. Coprendo quasi l'intero spessore retinico, gli RMC inguainano quasi tutti i neuroni retinici e la microvascolarizzazione. I loro processi si estendono verso l'alto fino alla membrana limitante interna (ILM), formando le estremità apicali, e verso il basso fino alla membrana limitante esterna (OLM), dove sviluppano microvilli specializzati³. Questa architettura unica consente agli RMC di funzionare come impalcatura strutturale primaria per l'organizzazione della retina ^4,5.

Le RMC sono arricchite con canali ionici, ligandi, recettori, trasportatori transmembrana ed enzimi⁶ e partecipano al metabolismo del glucosio retinico attraverso la glicolisi⁷. I canali ionici del potassio (Kir2.1, Kir4.1) e le proteine dei canali dell'acqua (AQP4, AQP9, AQP11) regolano in modo collaborativo l'omeostasi ionica e idrica attraverso la membrana cellulare, mantenendo l'equilibrio fisiologico retinico⁷. Inoltre, gli RMC assorbono ed eliminano i neurotrasmettitori rilasciati dai neuroni, tra cui il glutammato, l'acido γ-aminobutirrico (GABA) e la glicina ^7,8.

Condizioni patologiche come la retinopatia diabetica⁷, il glaucoma⁹ e la retinite pigmentosa¹⁰ possono danneggiare le RMC, interrompere la barriera emato-retinica, innescare l'infiammazione, aumentare la permeabilità vascolare e compromettere la funzione retinica. Gli RMC sono anche riconosciuti come fonti intrinseche latenti di cellule rigenerative retiniche^11,12. Nei pesci e in alcuni anfibi, le RMC possono dedifferenziarsi in cellule progenitrici della retina che sostituiscono i neuroni persi a causa della lesione¹³. Nelle retine dei mammiferi adulti, le RMC esprimono proteine marcatrici correlate alle cellule staminali^14,15, garantendo loro il potenziale di differenziarsi in neuroni retinici e sostituire le cellule danneggiate in malattie degenerative come la degenerazione maculare legata all'età, il glaucoma e la retinopatia diabetica¹⁶. Gli RMC primari imitano da vicino il loro stato in vivo e sono di grande valore nello studio e nel trattamento delle malattie degenerative della retina. Tuttavia, la letteratura contiene pochi metodi consolidati per isolare e coltivare RMC primarie, in particolare da ratti neonatali di Sprague-Dawley (SD).

Questo protocollo utilizza ratti SD neonatali di 3-5 giorni, senza preferenza di genere. In condizioni sterili, i bulbi oculari vengono enucleati e il tessuto retinico viene digerito utilizzando la tripsina. Gli RMC primari vengono quindi isolati mediante centrifugazione e purificazione per la successiva coltura e passaggio. L'analisi morfologica mediante microscopia ottica invertita combinata con colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) ha rivelato che le cellule isolate mostravano caratteristiche caratteristiche RMC. La colorazione in immunofluorescenza ha confermato l'espressione di marcatori proteici specifici per RMC, tra cui la glutammina sintetasi (GS), la proteina legante la retinaldeide cellulare (CRALBP), la vimentina, l'acquaporina-4 (AQP4) e il canale del potassio raddrizzatore verso l'interno 4.1 (Kir4.1). L'analisi citofluorimetrica dopo la marcatura con anticorpi GS e CRALBP ha dimostrato una purezza cellulare del ≥90%, che soddisfa i criteri stabiliti per gli esperimenti biologici basati su RMC e garantisce l'idoneità per i successivi studi funzionali. Durante il processo sperimentale, le cellule al quarto passaggio hanno mostrato una ridotta aderenza al pallone di coltura, cambiamenti morfologici e segni di senescenza, portando infine alla morte cellulare. Pertanto, negli esperimenti successivi sono state utilizzate solo le cellule dei primi tre passaggi.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e sono stati approvati dal Comitato etico animale dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (numero etico: 2024069). Nello studio sono stati utilizzati cinquanta ratti Sprague-Dawley privi di patogeni specifici (SPF) (3-5 giorni di età, sesso non specificato, peso corporeo 7-10 g). Gli animali sono stati ottenuti commercialmente e ospitati presso il Centro Sperimentale per gli Animali dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (Licenza d'uso della struttura n.: SYXK [Sichuan] 2024-049) in condizioni di laboratorio standard. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Isolamento e coltura delle RMC primarie

1. Preparazione di elementi sperimentali
   1. Sterilizzare i seguenti elementi sotto la luce ultravioletta per almeno 30 minuti sul banco pulito prima dell'uso: matracci di coltura T25, provette e rack da centrifuga, pipette e supporti, contenitori per rifiuti liquidi, accendini, lampade ad alcool e pennarelli.
   2. Sterilizzare i seguenti elementi in autoclave prima dell'uso: puntali per pipette da 1 ml, piastra piegante, piastre di Petri in vetro con coperchio, pinzette curve, rete di nylon da 45 μm (300 mesh), pinzette dentate, pinzette senza denti e micro forbici corneali.
2. Preparazione ambientale: disinfettare l'ambiente e il tavolo operatorio per la dissezione del bulbo oculare con luce ultravioletta per più di 30 minuti. Spruzzare alcol sulle mani dello sperimentatore ogni volta prima di entrare e dopo aver lasciato il banco pulito. Impostare l'incubatrice a 37 °C e 5% di CO₂. Spruzzare le mani dello sperimentatore con alcol prima e dopo l'apertura dell'incubatrice.
3. Preparazione della soluzione: Preparare la soluzione di D-Hank, la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), il Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM high-glucose), il siero fetale bovino (FBS, inattivato termicamente), la soluzione di penicillina/streptomicina (100x) e la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%.
   NOTA: Scaldare DMEM e FBS a bagnomaria a 37 °C prima dell'uso.
   1. Preparare le soluzioni di D-Hank e PBS contenenti l'1% di penicillina/streptomicina aggiungendo 100 μL di soluzione di penicillina/streptomicina a 10 mL di soluzione di D-Hank o PBS, rispettivamente.
   2. Preparare il terreno di coltura completo aggiungendo 100 μL di soluzione di penicillina/streptomicina e 2 mL di FBS a 10 mL di DMEM ad alto contenuto di glucosio.
      NOTA: Preparare le soluzioni su un banco pulito da laboratorio e utilizzarle immediatamente quando possibile. Conservare l'intero terreno di coltura a 4 °C e riscaldarlo a 37 °C prima di ogni utilizzo. Gettare se conservato per più di una settimana.
4. Rimozione degli occhi
   1. Eutanasia di ratti neonati SD mediante lussazione cervicale (senza asfissia da CO₂) su un banco da lavoro sterilizzato seguendo protocolli istituzionalmente approvati. Immergere i corpi in alcol al 75% per 5 minuti per la disinfezione, quindi trasferirli in un piatto curvo sterile.
   2. Versare la soluzione di D-Hank in due piastre di coltura in vetro da 10 cm.
   3. Usa una pinzetta dentata per aprire la palpebra lungo la fessura palpebrale per esporre il bulbo oculare.
   4. Usa una pinzetta sdentata tenuta aperta e parallela alla fessura palpebrale per premere verso il basso l'orbitale. Una volta raggiunto il nervo ottico e esposto il bulbo oculare, chiudere le pinzette per sollevare ed estrarre il bulbo oculare.
   5. Metti il bulbo oculare in un piatto di coltura di vetro con la soluzione di D-Hank, sciacqualo e trasferiscilo in un altro piatto con la soluzione fresca di D-Hank.
      NOTA: Assicurarsi che il bulbo oculare rimanga intatto. Idealmente, una parte del nervo ottico dovrebbe rimanere attaccata per facilitare la separazione del tessuto retinico.
5. Dissezione retinica
   1. Preparare una capsula di coltura vuota sterilizzata e con coperchio e regolare il microscopio.
   2. Posizionare al microscopio la piastra di coltura in vetro del passaggio 1.4.5. Utilizzare micro pinze oftalmiche curve per fissare delicatamente la regione tra la cornea e il nervo ottico per esporre la cornea.
   3. Forare la giunzione corneosclerale utilizzando micro forbici corneali. Tagliare lungo il limbus in modo circolare, quindi praticare incisioni sclerali simmetriche di circa 2 mm di lunghezza. Rilasciare la pinza e serrare nuovamente all'incrocio tra il nervo ottico e la sclera.
   4. Utilizzare una seconda pinza per premere delicatamente vicino alla radice del nervo ottico, dirigendo la pressione verso l'interfaccia del nervo corneale-ottico. Quando appare il tessuto del cristallino, rimuoverlo con cautela e continuare a premere fino a quando il tessuto retinico non emerge.
      NOTA: Rimuovere la lente con cautela per evitare di estrarre inavvertitamente il tessuto retinico.
   5. Trasferire il tessuto retinico separato in un'altra piastra di coltura sterile utilizzando una pinza. Copri il piatto, spruzzalo con alcol e posizionalo sulla panca pulita.
6. Estrazione di RMC primari
   1. Accendere l'interruttore di ventilazione del banco pulito.
   2. Aprire il coperchio del piatto di coltura. Utilizzare una pipetta con una punta da 1 ml per pipettare il tessuto retinico su e giù circa 15 volte per romperlo in piccoli pezzi. Aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,25% e incubare a 37 °C per 5 minuti.
   3. Estrarre il piatto di coltura dall'incubatrice e posizionarlo sul banco pulito. Aggiungere 2 ml di terreno completo e pipettare delicatamente per fermare la digestione.
      NOTA: Utilizzare il doppio del volume di tripsina per terminare la digestione. Ad esempio, se è stato utilizzato 1 mL di tripsina, terminare con 2 mL di terreno completo.
   4. Filtrare la sospensione cellulare attraverso uno schermo di nylon da 300 maglie in una provetta da centrifuga da 15 mL. Lavare il piatto con PBS preparato e raccogliere la sospensione rimanente.
   5. Centrifugare la provetta a 878 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Aspirare e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 2 mL di terreno completo e centrifugare nuovamente a 878 x g per 5 minuti per purificare le cellule.
   6. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 2 mL di terreno completo. Aggiungere preventivamente 3 mL di terreno completo a ciascun pallone T25, quindi aggiungere 1 mL di sospensione cellulare. Agitare il pallone a croce e metterlo nell'incubatrice.
   7. Eseguire il primo cambio del terreno dopo 48 ore di incubazione. Estrarre il pallone dall'incubatrice e posizionarlo sul banco pulito. Scartare il terreno esaurito e lavare tre volte la superficie di adesione alle cellule con 1 mL di PBS.
      1. Aggiungere 5 ml di terreno completo fresco. Continuare a cambiare il terreno a giorni alterni fino a quando la confluenza cellulare non supera il 90%, quindi procedere con la subcoltura.

2. Passaggio degli RMC

NOTA: Passaggio delle celle quando la confluenza supera il 90%. In questo protocollo, le colture primarie richiedono in genere il passaggio a 5-6 giorni dopo l'isolamento. I tempi del primo passaggio possono variare a seconda della densità di placcatura. Regolare la densità cellulare a 4 x 10³ cellule/mL e seminare le cellule in fiasche di coltura T25. Quando la confluenza raggiunge il >90% dopo 3-4 giorni, procedere con il passaging.

1. Rimuovere il pallone di coltura T25 dall'incubatrice. Eliminare il terreno di coltura e lavare le cellule tre volte con 1 mL di soluzione PBS contenente l'1% di penicillina/streptomicina.
2. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% nel pallone e incubare per 1 minuto e 30 s.
3. Osservare il pallone al microscopio invertito. Quando le cellule appaiono rotonde, staccate e iniziano a galleggiare, rimuovere il pallone dall'incubatrice. Trasferirlo nel banco pulito e aggiungere 2 ml di terreno di coltura completo per terminare la digestione.
4. Utilizzare una pipetta per aspirare la sospensione cellulare. Pipettare delicatamente contro la parete del pallone per rimuovere le cellule aderenti rimanenti.
5. Trasferire l'intera sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL. Sciacquare la parete del pallone con 2 ml di PBS contenente l'1% di penicillina/streptomicina e aggiungerlo alla stessa provetta. Centrifugare la provetta a 878 x g per 5 minuti a RT.
6. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet di cella in un volume appropriato di mezzo completo. Passaggio delle celle in un rapporto di 1:2 o 1:3 a seconda delle esigenze.
   NOTA: Utilizzare le celle al passaggio 2 (P2) per gli esperimenti a valle (Figura 1).

3. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)

1. Passaggio del seme 2 cellule (P2) in una piastra a 6 pozzetti contenente vetrini coprioggetti sterili pre-posizionati a una densità di 2 x 10⁵ cellule per pozzetto. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura completo a ciascun pozzetto. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, scartare il terreno di coltura e sciacquare delicatamente ciascun pozzetto due volte con 1 mL di PBS.
2. Aggiungere 1 mL di fissativo paraformaldeide al 4% in ciascun pozzetto e incubare per 30 minuti per fissare le cellule. Scartare il fissativo e lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS.
3. Aggiungere 1 mL di colorante di ematossilina in ogni pozzetto e incubare per 15 minuti. Eliminare la soluzione colorante e sciacquare i pozzetti 2-3 volte con 1 ml di PBS.
4. Osserva le cellule al microscopio. Se la macchia di ematossilina appare troppo scura, utilizzare alcol di acido cloridrico all'1% per differenziare e rimuovere la colorazione citoplasmatica in eccesso. Lavare 2-3 volte con 1 ml di PBS.
5. Aggiungere 1 mL di soluzione colorante eosina in ogni pozzetto. Osservare la colorazione al microscopio per circa 30 s o fino a raggiungere l'intensità del colore desiderata. Sciacquare i pozzetti 2-3 volte con 1 ml di PBS. Montare i vetrini coprioggetti sui vetrini utilizzando resina neutra.

4. Colorazione in immunofluorescenza

1. Semina di cellule P2 in una piastra a 6 pozzetti contenente vetrini coprioggetti sterili preposizionati a una densità di 2 x 10⁵ cellule per pozzetto. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura completo a ciascun pozzetto.
   1. Quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza, scartare il terreno di coltura. Togliete il vetrino coprioggetti e mettetelo in un barattolo colorante. Lavare il vetrino coprioggetti tre volte con 1 mL di PBS, 5 minuti ogni volta.
2. Aggiungere circa 50 μL di soluzione di permeabilizzazione (Triton X-100: PBS = 1: 200) per coprire le cellule. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi lavare tre volte con 1 mL di PBS, 5 minuti ogni volta. Aggiungere circa 50 μl di soluzione bloccante BSA al 3% e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
3. Gettare delicatamente la soluzione bloccante. Aggiungere circa 200 μl di soluzione di anticorpi primari preparata in PBS per coprire il vetrino: AQP4 (1:100), Kir4.1 (1:200), GS (1:200), CRALBP (1:50) o Vimentin (1:200). Porre il vetrino coprioggetti in una camera umidificata e incubare per una notte a 4 °C.
4. Lavare il vetrino coprioggetti tre volte con 1 mL di PBS, 5 minuti ogni volta.
5. Aggiungere circa 200 μl di anticorpo secondario IgG di capra¹⁷ marcato con FITC. Incubare a temperatura ambiente al buio per 50 min. Lavare il vetrino coprioggetti tre volte con 1 mL di PBS, 5 minuti ogni volta.
6. Colorare i nuclei con DAPI per 10 min. Lavare tre volte con 1 ml di PBS, 5 minuti ogni volta.
7. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio anti-sbiadimento alla diapositiva. Montare il vetrino coprioggetti con la cella rivolta verso il basso. Sigillare e osservare al microscopio a fluorescenza.

5. Citometria a flusso

1. Regolare la concentrazione cellulare a 1,0 x 10⁷ cellule/mL utilizzando il tampone di colorazione per citometria a flusso.
2. Aliquotare 100 μl della sospensione a cellula singola in due provette separate per condizione. Designare un tubo come controllo negativo (non colorato).
3. Aggiungere 100 μl di mezzo di permeabilizzazione A (dal kit ottenuto in commercio, vedere la tabella dei materiali) a ciascuna provetta. Mescolare delicatamente e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
4. Aggiungere 3 mL di tampone di colorazione per citometria a flusso pre-raffreddato in ciascuna provetta. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a RT ed eliminare il surnatante.
5. Aggiungere 100 μl di mezzo di permeabilizzazione B (dal kit ottenuto in commercio) a ciascuna provetta e vortice da miscelare. Aggiungere 0,1 μl di anticorpo CRALBP alle provette del campione designate e 0,8 μl di anticorpo GS alle provette corrispondenti. Non aggiungere alcun anticorpo al tubo di controllo negativo. Incubare a 4 °C al buio per 30-60 min.
6. Aggiungere 3 mL di tampone di colorazione per citometria a flusso in ciascuna provetta. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a RT ed eliminare il surnatante.
7. Risospendere ciascuna provetta in 100 μL di tampone di colorazione per citometria a flusso. Aggiungere 1 μL di IgG (H&L) di capra coniugata con FITC a ciascuna provetta colorata con CRALBP e 1 μL di IgG (H&L) di capra coniugata con PE a ciascuna provetta colorata con GS. Non aggiungere alcun anticorpo al tubo di controllo negativo. Incubare a 4 °C al buio per 30-60 min.
8. Aggiungere 3 mL di tampone di colorazione per citometria a flusso in ciascuna provetta. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
9. Risospendere ciascuna provetta in 300 μL di tampone di colorazione per citometria a flusso. Procedere immediatamente con l'analisi di citometria a flusso; in alternativa, risospendere in 500 μL di paraformaldeide all'1%-4%, conservare a 2-8 °C al buio e analizzare entro 24 ore.
10. Analizza campioni negativi e positivi utilizzando il software di citometria a flusso.

Dopo che le cellule primarie sono state seminate nel pallone di coltura, i successivi cambiamenti del terreno e il passaggio aiutano a eliminare le RMC scarsamente aderenti e a rimuovere i detriti cellulari generati durante il passaggio, arricchendo così la popolazione di RMC nella coltura. Gli RMC sono stati identificati in base alla loro morfologia utilizzando un microscopio ottico invertito (Figura 1) e la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) (Figura 2). La colorazione in immunofluorescenza è stata eseguita utilizzando anticorpi specifici contro GS, Vimentina, CRALBP, AQP4 e Kir4.1 per osservare l'espressione proteica (Figura 3). Inoltre, la citometria a flusso è stata condotta utilizzando la marcatura degli anticorpi GS e CRALBP per determinare la purezza della popolazione RMC (Figura 4).

Come mostrato nella Figura 1 e nella Figura 2, le RMC di secondo passaggio (P2) osservate al microscopio ottico invertito mostrano morfologie a forma di stella o di fuso con confini chiari e abbondante citoplasma. I loro nuclei sono rotondi o ovali, di dimensioni uniformi e circondati da processi che si estendono radialmente. Sono visibili anche alcune cellule progenitrici della retina; Queste cellule sono rotonde o ovali, contengono nuclei grandi e hanno relativamente meno citoplasma.

Per l'identificazione specifica degli RMC, questo studio ha utilizzato GS, vimentina, CRALBP, AQP4 e Kir4.1 come marcatori di immunofluorescenza. Il GS è un enzima chiave che converte il glutammato in glutammina. È espresso esclusivamente nelle RMC ed è localizzato principalmente nel loro citoplasma18,19. CRALBP, originariamente identificato nelle retine dei vertebrati, è espresso sia nelle cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) che nelle RMC20. L'espressione di GS e CRALBP è stata osservata anche in tutti i processi cellulari nella retina umana21. In particolare, il livello di espressione specifica di CRALBP nelle RMC dei mammiferi regola l'efficienza del ciclo visivo retinico ed è strettamente associato alla funzione dei coni22,23. Pertanto, sia GS che CRALBP fungono da marcatori immunospecifici affidabili per le RMC.

La vimentina, una proteina del filamento intermedio del citoscheletro, è un segno distintivo delle cellule gliali nella retina dei mammiferi. È abbondantemente espresso nel citoplasma e nei processi delle RMC ed è comunemente usato come marcatore delle cellule gliali retiniche24. AQP4 è una proteina canale dell'acqua transmembrana bidirezionale che colocalizza con Kir4.1 nella membrana limitante interna (ILM). Queste due proteine mostrano un accoppiamento strutturale e funzionale, facilitando il trasporto transmembrana coordinato dell'acqua in eccesso e degli ioni K+ nello spazio interstiziale retinico per mantenere l'omeostasi 7,25. NeuN, un antigene nucleare neuronale e un marcatore di differenziazione neuronale, è stato utilizzato come controllo negativo in questo studio26.

Nella Figura 3, la colorazione in immunofluorescenza degli RMC ha rivelato una fluorescenza rosso vivido per GS, AQP4, mentre CRALBP, Kir4.1 e Vimentin hanno mostrato una fluorescenza verde brillante. Le RMC mostravano morfologie diverse, con corpi cellulari che apparivano circolari, ovali o irregolari e con confini chiaramente definiti. I processi dendritici erano visibili, indicando strette connessioni intercellulari. Non è stata rilevata alcuna espressione di NeuN nelle RMC, confermando l'assenza di contaminazione neuronale.

Nella Figura 4, l'analisi citofluorimetrica dopo la marcatura degli anticorpi GS e CRALBP ha dimostrato che la purezza degli RMC in coltura superava il 90%. Questo elevato livello di purezza soddisfa i requisiti per i successivi studi funzionali.

Figura 1: Morfologia delle RMC allo stadio P2 osservata al microscopio invertito a diversi ingrandimenti. Le cellule appaiono a forma di stella o di fuso, disposte ravvicinate, con bordi lisci. I nuclei sono rotondi o ovali e le sostanze granulari sono visibili nel citoplasma. Le immagini vengono catturate con ingrandimenti 40x, 100x e 200x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Morfologia cellulare delle RMC dopo colorazione con ematossilina ed eosina (H&E). Le celle sono a forma di fuso o a forma di stella; alcuni rimangono relativamente rotondi, indicando una differenziazione incompleta. Il citoplasma è abbondante e di colore rosa chiaro, con membrane cellulari chiare. I nuclei sono grandi, ovali e situati centralmente, appaiono più scuri del citoplasma in rosa o rosso chiaro. Le cellule presentano bordi lisci e sono interconnesse da sottili strutture filamentose. Le immagini vengono catturate con ingrandimenti di 100x, 200x e 400x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 3: Colorazione in immunofluorescenza di RMC. GS e AQP4 mostrano una fluorescenza rosso brillante, mentre CRALBP, Kir4.1 e Vimentin mostrano una fluorescenza verde. Le RMC presentano corpi cellulari circolari o ovali, con nuclei singoli o doppi e citoplasma abbondante. Le membrane cellulari hanno confini ben definiti e sono visibili sporgenze dendritiche. La quantificazione è stata eseguita in cinque campi visivi selezionati casualmente, mostrando il 90% di cellule positive (n = 3 esperimenti indipendenti). Ingrandimento: 40x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi con citometria a flusso di RMC. Vengono mostrati i livelli di espressione di GS (a sinistra) e CRALBP (a destra). Il blu rappresenta la popolazione di controllo negativa e il rosso rappresenta le cellule colorate per la proteina bersaglio. L'asse orizzontale indica l'intensità della fluorescenza (area FL2 per l'area PE, area FL1 per l'area FITC) e l'asse verticale indica la conta cellulare. I valori etichettati sui picchi blu e rosso rappresentano rispettivamente le proporzioni delle celle negative e positive. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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