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Articolo metodologico

Valutazione della frazione perduta: diversità, abbondanza e massa delle microplastiche (1-300 μm) nei sistemi acquatici

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DOI:

10.3791/68148

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22 agosto 2025

 ,  , 
1School of Marine and Atmospheric Science, Stony Brook University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive una metodologia da applicare ai campioni acquatici raccolti su filtri per rilevare, identificare e quantificare MP di dimensioni micron (1-300 μm). La microspettroscopia Raman è in grado di identificare la struttura chimica polimerica delle particelle MP e quantificare le loro abbondanze in termini di numero di particelle e la loro massa nei campioni d'acqua.

Abstract

Il protocollo qui presentato consente la quantificazione di microplastiche (MP) di diametro fino a ~1 μm, l'identificazione accurata dei tipi di polimero e la stima del volume delle particelle, consentendo in modo critico il calcolo della massa MP. I risultati rappresentativi dei campioni raccolti nella Great South Bay (GSB), NY, hanno mostrato che le particelle all'interno dell'intervallo di diametro sferico equivalente (ESD) di 1-6 μm erano le più abbondanti, con circa il 75% delle particelle che misuravano meno di 5 μm. In particolare, la fase di pre-setacciatura non è riuscita a produrre particelle più grandi di 60 μm, suggerendo che le MP di grandi dimensioni erano rare nei siti costieri campionati. Prima della filtrazione, è stata utilizzata una fase di ossidazione chimica per rimuovere i detriti organici, che ha facilitato la filtrazione di volumi d'acqua maggiori (>1 L) da campioni discreti raccolti in bottiglia e ha ridotto l'intasamento del filtro. Sebbene questo approccio abbia migliorato significativamente l'efficienza della filtrazione, alcuni aspetti della metodologia richiedono ancora un perfezionamento per ridurre il tempo totale necessario per la preparazione del campione e l'analisi dei dati. La microspettroscopia Raman e l'elaborazione dei dati associata continuano a richiedere molto tempo, in particolare per l'analisi accurata di particelle più piccole di 10 μm in matrici ambientali complesse. Gli sforzi in corso si concentrano sulla riduzione al minimo delle incertezze analitiche, sull'ottimizzazione del compromesso tra accuratezza del conteggio delle particelle e tempo di elaborazione e sulla riduzione degli artefatti nel flusso di lavoro di rilevamento.

Introduzione

Le microplastiche (MP) sono un gruppo altamente eterogeneo di particelle che variano ampiamente in dimensioni, forma, colore, densità, composizione chimica e altre proprietà fisiche, rendendo la loro identificazione e quantificazione particolarmente impegnative1. Nelle indagini MP sono stati impiegati diversi metodi analitici, dalle tecniche visive come la microscopia ottica2 ad approcci chimici più avanzati come la pirolisi-gascromatografia3. La microscopia ottica è un metodo comunemente usato per caratterizzare MP più grandi (in genere 0,5-5 mm) grazie alla sua semplicità, velocità ed economicità1. Consente l'identificazione visiva e la quantificazione di particelle simili alla plastica, fornendo al contempo informazioni sulla morfologia e la struttura della superficie2. Tuttavia, questa tecnica non fornisce informazioni chimiche sulla composizione chimica e si basa sull'esperienza dell'analista. L'errata identificazione è una limitazione ben documentata dell'analisi visiva, con tassi di errore riportati che vanno dal 20% al 70%, in particolare per particelle piccole e trasparenti. Tali errori possono sovrastimare significativamente le concentrazioni di MP nei campioni ambientali4.

D'altra parte, la pirolisi-gascromatografia (GC) combinata con la spettrometria di massa (MS) può fornire informazioni dettagliate sulla composizione chimica delle MP analizzando i prodotti di degradazione termica3. Se abbinato a una fase di desorbimento termico, può anche rilevare additivi plastici durante la stessa analisi5. Tuttavia, questo metodo richiede la preselezione manuale di particelle simili alla plastica e il loro accurato posizionamento nel sistema di pirolisi, con conseguente bassa produttività del campione1.

Per superare i limiti dei metodi tradizionali, le tecniche automatizzate che consentono sia l'identificazione che la quantificazione delle MP stanno diventando sempre più essenziali. La spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR) fornisce un'identificazione accurata del polimero attraverso le loro impronte spettrali uniche 6,7,8. Questi metodi di spettroscopia vibrazionale rilevano le vibrazioni molecolari indotte dalla luce, dal laser per Raman e dall'infrarosso per FTIR, producendo spettri che riflettono specifiche strutture molecolari7. Entrambe le tecniche hanno fatto progredire significativamente la rilevazione e la caratterizzazione di piccole particelle MP (<300 μm) in varie matrici ambientali8. Riducono i falsi positivi confermando chimicamente le particelle simili alla plastica, riducono al minimo i falsi negativi e non sono distruttivi. Se abbinate alla microscopia (microspettroscopia), queste tecniche consentono l'identificazione e la quantificazione di particelle polimeriche più piccole di 0,3 mm (con μFTIR che rileva fino a ~10 μm e μRaman a ~0,3 μm)8. Ogni metodo, tuttavia, ha dei limiti: il Raman offre una risoluzione spaziale più elevata e una migliore rilevazione per alcuni polimeri (ad esempio, il polistirene), ma è più suscettibile all'interferenza della fluorescenza e in genere richiede tempi di acquisizione più lunghi. Tuttavia, la microspettroscopia Raman è in grado di rilevare particelle più piccole di 0,3 μm, coprendo un intervallo di dimensioni microplastiche più ampio rispetto all'imaging FTIR 8,9.

Lo strumento principale per il lavoro qui descritto è un microspettrofotometro Raman confocale disponibile all'interno del NAno-Raman Molecular Imaging Laboratory (NARMIL) di SoMAS. Il protocollo è stato ottimizzato per rilevare, identificare e quantificare MP di dimensioni micro (<300 μm) su filtri provenienti da campioni d'acqua che di solito vengono esclusi quando si utilizzano reti da plancton o mante per campionare la plastica marina. Inoltre, è necessario un processo di semi-ossidazione per ridurre la presenza di residui non plastici (detriti organici). Ciò riduce al minimo l'interferenza analitica prima dell'analisi microspettroscopica Raman e, soprattutto, previene l'ostruzione dei pori del filtro, consentendo la filtrazione di volumi d'acqua maggiori. Utilizzando questa tecnologia, è possibile rilevare particelle MP nella frazione di dimensioni inferiori al micron al millimetro raccolte sui filtri da campioni d'acqua e consente il calcolo di specifiche concentrazioni di MP, dimensioni delle particelle e masse.

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Protocollo

Questo protocollo è stato modificato rispetto alla versione originale9. Il protocollo è una guida per l'analisi di campioni acquatici (acqua potabile, fiume, lago, costa o oceano aperto) per estrarre, rilevare e quantificare MP (<300 μm) sui filtri. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Controllo di qualità

  1. Assicurarsi di filtrare tutti i reagenti attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm prima dell'uso.
  2. Assicurarsi che il personale indossi camici da laboratorio di cotone (senza materiali sintetici) e si lavi le mani prima e tra una manipolazione del campione e l'altra.
  3. Sciacquare l'apparecchiatura di filtrazione con acqua distillata filtrata da 0,22 μm prima e tra le filtrazioni. Coprire con un foglio di alluminio pulito quando non in uso.
  4. Spazi vuoti sul campo: riempire i flaconi dei campioni risciacquati con acqua distillata filtrata da 0,22 μm e lavorare come campioni ambientali.
  5. Bianchi da laboratorio: Processare 1 L di acqua distillata filtrata da 0,22 μm attraverso filtri Al2O3 insieme a ciascun lotto di campioni.

2. Raccolta e preparazione di campioni di acqua naturale per la quantificazione MP

  1. Presciacquare tutti i flaconi dei campioni (compresi i contenitori Niskin e di vetro) con acqua distillata filtrata da 0,22 μm per ridurre al minimo la contaminazione.
  2. I campioni discreti di colonna d'acqua (>1 L) provenienti da sistemi acquatici possono essere raccolti utilizzando metodi di campionamento standard, ad esempio bottiglie di vetro (acqua superficiale) o bottiglie di Niskin in cloruro di polivinile (PVC) montate a rosetta (colonna d'acqua) e trasferite direttamente in bottiglie di vetro.
  3. Il prefiltro raccoglieva l'acqua utilizzando setacci metallici da 200 μm e 60 μm per rimuovere i detriti organici e separare gli MP in frazioni dimensionali.
    NOTA: Le particelle trattenute possono essere identificate direttamente al microscopio.
  4. Conservare l'acqua che passa attraverso il setaccio metallico da 60 μm in bottiglie di vetro. Successivamente, filtrare questa frazione su filtri a membrana in ossido di alluminio (Al2O3) (diametro 25 mm, dimensione dei pori 0,2 μm).

3. Demi-ossidazione di campioni d'acqua

NOTA: Per ridurre al minimo l'interferenza analitica da abbondanti particelle biogeniche, i campioni vengono puliti mediante chemi-ossidazione prima dell'analisi microspettroscopica Raman.

  1. Combinare 100 mL di perossido di idrogeno al 30% (v/v) con 1 L di campione in un contenitore di vetro e mescolare accuratamente.
    ATTENZIONE: Maneggiare H2O2 con cura - forte ossidante, può causare irritazioni alla pelle e agli occhi. Indossare guanti e occhiali protettivi e seguire le procedure di sicurezza del laboratorio.
  2. Coprite il contenitore con un coperchio o un foglio di alluminio e mettetelo in forno a 60 °C per ~10 h.
  3. Lasciare raffreddare il campione per 10 minuti, quindi procedere alla filtrazione ancora caldo.

4. Filtrazione di campioni d'acqua

NOTA: A causa della fragilità intrinseca del filtro, prestare attenzione a non piegare i filtri a membrana Al2O3 durante il montaggio e la rimozione, maneggiando esclusivamente il filtro tramite l'anello anulare in polipropilene incollato alla membrana.

  1. In una cappa a flusso laminare, filtrare campioni e bianchi da 1 litro utilizzando un sistema di filtrazione interamente in vetro con base in vetro sinterizzato e morsetto metallico.
  2. Dopo la filtrazione, sciacquare i filtri con acqua distillata filtrata da 0,22 μm.
  3. Montare il filtro su un vetrino da microscopio senza vetrino coprioggetti per l'analisi Raman.

5. Analisi microspettroscopica Raman di particelle MP filtrate

NOTA: Un microspettrofotometro Raman confocale e il suo software vengono utilizzati come metodo analitico per identificare e quantificare le particelle MP. Lo strumento è configurato con un microscopio a epifluorescenza verticale modificato, uno stadio x-y-z motorizzato controllato da computer con passo di 0,1 μm in tutte le dimensioni, quattro linee laser (laser ionico Ar+ da 457/514 nm, laser He/Ne da 633 nm, laser a diodi da 785 nm) e un rivelatore CCD raffreddato a Peltier da 1.040 × 256.

  1. Utilizzando la funzione di acquisizione delle immagini nel software Raman, è possibile impostare la configurazione dello strumento per l'analisi MPS di campioni acquatici.
    1. Laser: 633 nm He/Ne a ~9,3 mW di potenza laser (tramite obiettivo da 50×).
    2. Griglia: 1200 linee/mm.
    3. Gamma spettrale: 200-2500 cm-1.
    4. Tempo di esposizione: 0,7 s/spettro.
  2. Imposta una griglia all'interno di una regione di interesse (ROI) prendendo spettri ogni 1 μm nelle dimensioni x e y.
  3. Definisci ogni ROI come una griglia di 100 μm x 100 μm nell'immagine della telecamera (10.000 μm2).
    NOTA: L'area ROI può essere modificata; Ad esempio, aree più piccole ridurranno il tempo totale di analisi.
  4. Analizza ~40 ROI per filtro, selezionati casualmente utilizzando un modello cross-pattern per rappresentare la distribuzione spaziale MP nell'intera area del filtro esposta.
  5. Dopo la raccolta automatizzata dei dati, utilizzare la funzione di acquisizione delle immagini nel software per produrre mappe chimiche 2D dettagliate di ciascun ROI.
  6. Da ogni mappa chimica, identificare e quantificare le particelle MP utilizzando l'analisi dei componenti (metodo di correlazione dei minimi quadrati non negativi) in base alle funzionalità del software.
  7. Confronta gli spettri con le librerie di riferimento. Accetta le partite con punteggio >60 (punteggio della biblioteca interna 0-100) come MP confermati10.

6. Enumerazione quantitativa basata su filtri di particelle MP

  1. Dopo aver totalizzato il numero di particelle da ~40 ROI, calcolare il numero di particelle MP per litro di campione (N), secondo l'equazione 111.
    figure-protocol-1(1)
    dove Af è l'area totale esposta del filtro (mm2), n è il numero totale di particelle MP contate sommate a tutte le ROI esaminate, b il numero di ROI esaminate, M la dimensione dell'area di una ROI (mm2) e V il volume (l) dell'acqua filtrata dal campione.
  2. Stabilire l'incertezza analitica del numero totale di particelle (N) in ciascun campione calcolando l'errore standard da tutte le ROI conteggiate per campione.
  3. Riporta il numero totale di particelle per L come N ± 1S.E.

7. Calcoli di dimensione, volume e massa delle particelle

NOTA: Determinare le dimensioni, l'area e il diametro sferico equivalente (ESD) di ciascuna particella con l'aiuto di un software di analisi delle immagini.

  1. Determina l'area contando il totale dei pixel positivi per la plastica assegnati a ciascuna immagine di particella.
  2. Usa questa area di particella (Ap) per calcolare l'ESD applicando l'equazione 211:
    figure-protocol-2(2)
  3. Calcola una stima del volume dell'ellissoide idealizzato per ogni particella utilizzando l'equazione 312.
    figure-protocol-3(3)
  4. Calcolare le masse (M) di ciascun polimero plastico nel pool MP utilizzando le stime del volume e le densità specifiche pubblicate (ρ; g cm3) di ciascun polimero plastico (cioè M = ρV). La massa è solitamente riportata in μg/L
    NOTA: Per stimare l'incertezza propagata nel calcolo della massa (errore relativo di massa, RE = SD/media) per ciascuna particella, l'incertezza analitica sia nell'algoritmo del volume che nella densità media viene considerata applicando la seguente equazione13:
    figure-protocol-4(4)
    Dove R.E. vol è l'errore relativo (S.E. della pendenza/pendenza) della pendenza di regressione lineare (3D e "volume 2D")9. R.E. den è la variazione relativa (S.E. / media) nell'intervallo dei valori di densità riportati per ciascun polimero contenuto in una specifica particella.

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Risultati

Qui vengono presentati i risultati ottenuti utilizzando la versione più recente della metodologia. Il metodo è stato modificato rispetto alla sua applicazione originale 9,14. I campioni utilizzati in questo articolo fanno parte di un progetto per valutare l'inquinamento da MP nei tre principali corpi idrici costieri di Long Island, NY: Great South Bay, Peconic Estuary e Shinnecock Bay. I risultati qui presentati servono come prova di concetto per il nostro metodo...

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Discussione

Questa metodologia consente la quantificazione di particelle di microplastica (MP) di dimensioni fino a 1 μm da campioni d'acqua raccolti sui filtri, consentendo misurazioni dettagliate dell'abbondanza delle particelle, della composizione chimica, delle dimensioni e della massa. Tuttavia, è essenziale riconoscere e affrontare le fonti di incertezza inerenti a questo approccio, in particolare quando si analizzano particelle più piccole di 10 μm in matrici ambientali complesse.

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che possano aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati a Larissa Chraim, Anthony Hill, Alanna Chen, Maya Butkevich e Leslie Mejia per la loro assistenza in laboratorio e nell'analisi dei dati. Tutti i dati spettrali Raman sono stati prodotti nel NAno Raman Molecular Imaging Laboratory (NARMIL) della School of Marine and Atmospheric Sciences della SBU, una risorsa comunitaria dedicata alle applicazioni delle scienze ambientali e fondata con la sovvenzione NSF-MRI OCE-1336724. La ricerca è stata parzialmente supportata da una sovvenzione di avviamento della Stony Brook University (SBU) e dalla SBU Presidential Dissertation Completion Fellowship CF21.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Foglio di alluminio qualsiasi marca commerciale
Setacci analitici in acciaio inoxRetsch GmbH, GermaniaDIN 4188
Filtri anodiscWhatman
PortafiltriFisherBrand-Millipore SigmaXX1012542
Bottiglie di vetroFisherBrand-Millipore Sigma02-912-313Qualsiasi contenitore di vetro funziona per il processo di campionamento
Imbuto per vetreriaFisherBrand-Millipore SigmaXX1012514
Perossido di idrogeno 30 %Scienze innovative7722-84-1
microspettrofotometro Raman confocale inViaRenishaw
Cappa a flusso laminareLabconco o qualsiasi altra cappa laminare per uso laboratoriale
Morsetto in metalloFisherBrand-Millipore SigmaXX1012503
Pinze in metalloFisherBrand-Millipore Sigma13-820-061
Vetrini per microscopioThermo Fisherhttps://www.thermofisher.com/
Guanti in nitrileKimtech55080-54
Fliter a membrana in nitrocelulosio 0,22Tecnologia di filtraggio GVS 1214898
Forno a calore radialeStrumenti della linea Lab 3609
Pompa a vuotoWelchCodice 25468-01 A
WiRE 5.2Renishaw

Riferimenti

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