Innovativo frazionamento del tessuto adiposo per trasformare il grasso in componenti specializzati

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo in grado di trasformare il tessuto adiposo autologo in varie sostanze componenti adipose con diverse proprietà e funzioni fisico-chimiche.

Abstract

L'innesto tradizionale di tessuto adiposo autologo è comunemente usato per l'aumento del volume e la rigenerazione dei tessuti. Tuttavia, le proprietà fisiche e biologiche uniformi degli innesti di grasso spesso portano a prestazioni non ottimali in diversi scenari di pazienti e requisiti sfaccettati. Ampliando le basi del trapianto di grasso autologo, introduciamo un approccio pionieristico chiamato trapianto autologo di componenti adipose. Questo concetto innovativo integra un protocollo meticolosamente progettato volto a convertire il tessuto adiposo autologo in una vasta gamma di componenti adiposi, ciascuno caratterizzato da proprietà fisico-chimiche uniche su misura per affrontare applicazioni specifiche in vari contesti clinici. Attraverso una serie di metodi fisici, il tessuto adiposo può essere trasformato in un complesso di matrice adiposa (AMC) che fornisce un supporto rigido sufficiente, grasso ad alta densità (HDF) per un ulteriore riempimento, gel per frazione vascolare stromale (SVF) per iniezioni piccole e/o precise e frammento di collagene adiposo (ACF) per rughe sottili e/o esigenze di ringiovanimento del viso. Queste distinte componenti adipose possiedono caratteristiche intrinseche che si prestano a strategie di trapianto precise e mirate, soddisfacendo le esigenze sfumate dei singoli pazienti. Il nuovo protocollo di frazionamento del tessuto adiposo mostra un grande potenziale nel rivoluzionare l'innesto di tessuto adiposo. Offre una nuova prospettiva e metodologia per un trapianto più raffinato e su misura.

Introduzione

L'innesto di tessuto adiposo autologo è una tecnica ampiamente utilizzata per il miglioramento volumetrico e la rigenerazione dei tessuti, guidata dai progressi nella preparazione del sito donatore, nell'estrazione del grasso, nella lavorazione e nell'impianto 1,2,3,4. Tuttavia, le proprietà fisiche e biologiche uniformi degli innesti di grasso tradizionali spesso limitano la loro efficacia nell'affrontare diverse esigenze cliniche⁵. Per superare queste limitazioni, il nostro team di ricerca ha sviluppato un innovativo protocollo di frazionamento del tessuto adiposo, trasformando il grasso autologo in componenti specializzati con proprietà e funzioni fisico-chimiche distinte.

L'obiettivo principale del protocollo è quello di frazionare il tessuto adiposo autologo in componenti specializzati: Complesso di matrice adiposa (AMC), Frazione vascolare stromale (SVF) in gel e Frammento di collagene adiposo (ACF), ciascuno progettato per affrontare specifiche sfide cliniche. Fornendo componenti con proprietà uniche, come una maggiore rigidità, un'elevata densità cellulare e formulazioni ricche di collagene, il protocollo consente strategie di trapianto precise e mirate 6,7,8,9,10,11.

L'innesto di grasso tradizionale, sebbene efficace per l'aumento di volume, spesso non riesce a soddisfare le esigenze sfumate di scenari clinici complessi. Il suo imprevedibile assorbimento dei grassi porta a un ripristino del volume instabile. Inoltre, a causa delle proprietà fisiche e biologiche uniformi degli innesti di grasso tradizionali, non possono fornire un riempimento mirato per aree con requisiti specifici per il trapianto, come il supporto strutturale, l'esecuzione di iniezioni precise su piccole aree e il raggiungimento di una stimolazione mirata del collagene. Questi problemi richiedono spesso più interventi chirurgici, aumentando così il dolore e l'onere finanziario dei pazienti ^1,2,5. Questo protocollo di frazionamento affronta queste limitazioni arricchendo in modo specifico il tessuto adiposo con contenuti di particolare valore rispetto al tessuto adiposo tradizionale. Attraverso questo processo, formiamo componenti del tessuto adiposo con proprietà su misura, offrendo così ai medici un kit di strumenti versatile per un trattamento personalizzato. Rispetto ai filler sintetici o all'innesto di grasso tradizionale, l'approccio utilizza tessuto autologo, eliminando il rischio di rigetto immunitario e garantendo la biocompatibilità³. Inoltre, il processo di frazionamento crea componenti con proprietà uniche, come l'AMC, che fornisce supporto strutturale e presenta un basso tasso di assorbimento; SVF-gel, che fornisce iniezioni precise ed è caratterizzato da un'alta densità di cellule della frazione vascolare stromale; e ACF, un'impalcatura proteica del collagene in grado di rilasciare in modo controllato fattori di grasso, che mostra un potenziale per applicazioni cliniche nel ringiovanimento della pelle ^7,9,11. Questo approccio riduce anche la necessità di procedure ripetute migliorando la ritenzione dell'innesto e la soddisfazione del paziente^10,12.

Il concetto di frazionamento dei tessuti biologici per ottimizzare i risultati terapeutici è ben consolidato, come si vede nella separazione del sangue in plasma, globuli rossi e piastrine per applicazioni mediche mirate. Negli ultimi anni, anche la ricerca e le applicazioni cliniche dei componenti del tessuto adiposo sono gradualmente avanzate 13,14,15,16,17,18. Questo protocollo di frazionamento adiposo si basa su questo principio, isolando componenti con proprietà distinte per un uso clinico su misura. I medici possono determinare l'idoneità di questo metodo considerando le esigenze anatomiche del paziente, i risultati desiderati (ad esempio, aumento del volume, supporto strutturale o ringiovanimento della pelle) e le attrezzature disponibili. Questo protocollo è particolarmente efficace per i casi che richiedono un controllo preciso sulle proprietà dell'innesto, come il ringiovanimento facciale, la revisione della cicatrice o complesse procedure ricostruttive ^7,10,12.

Protocollo

Questa ricerca è stata approvata dall'Ethical Review Board dell'ospedale Nanfang, Guangzhou, Cina. Il tessuto adiposo è stato raccolto da donatori sani che hanno dato il consenso informato scritto a partecipare allo studio. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Ospedale Nanfang ed eseguiti secondo le linee guida del Consiglio Nazionale per la Salute e la Ricerca Medica (Cina).

1. Preparazione del grasso

1. Anestesia generale e infiltrazione di liquido tumescente
   1. Porre il paziente in anestesia generale. Durante la fase di induzione endovenosa, somministrare una combinazione di propofol (2 mg/kg), fentanil (1,5 μg/kg) e rocuronio (0,6 mg/kg), seguita dal mantenimento della profondità di anestesia utilizzando sevoflurano (1,5%) e remifentanil (0,1 μg/kg/min). Durante la procedura, regolare dinamicamente il piano di anestesia in base al monitoraggio BIS (valore target 40-60), ai parametri circolatori (MAP >65 mmHg) e all'EtCO₂ (35-45 mmHg).
   2. Posizionare il paziente in posizione supina con imbottitura protettiva nei punti di pressione e disinfettare rigorosamente il sito chirurgico con clorexidina-alcol. Aderire ai protocolli asettici per ridurre al minimo il rischio di infezione.
   3. Infiltrare il tessuto sottocutaneo dell'area di liposuzione (come l'addome o la coscia) con liquido tumescente contenente lo 0,06% di lidocaina e lo 0,001% di epinefrina utilizzando una siringa da 20 ml. Mantenere un rapporto di 2:1 tra infiltrato e volume previsto di estrazione del grasso, regolando il volume totale di iniezione in base alle caratteristiche anatomiche specifiche del paziente e alle dimensioni dell'area da trattare.
   4. Controllare l'effetto anestetico per confermare l'infiltrazione completa di liquido tumescente. Prima del passaggio successivo, pungere o pizzicare l'area della liposuzione. Se il paziente avverte solo una leggera pressione, l'infiltrazione è sufficiente, consentendo la raccolta del grasso con meno disagio.
2. Raccolta del grasso
   1. Utilizzare una cannula multiporta da 3 mm con fori laterali affilati di 1 mm di diametro per la raccolta del grasso. Eseguire l'operazione a -0,75 atm di pressione di aspirazione per ridurre al minimo i danni al tessuto adiposo e garantire l'integrità e la vitalità delle cellule adipose raccolte.
3. Preparazione del grasso Coleman
   1. Lasciare riposare il grasso raccolto, che viene posto in una siringa da 60 ml, per 10 minuti in modo che i componenti liquidi si depositino sul fondo del contenitore.
   2. Scartare con cura la parte liquida sul fondo e raccogliere lo strato di grasso superiore, relativamente puro, per rimuovere le impurità come sangue e liquido tumescente.
   3. Conservare il grasso raccolto nella siringa da 60 millilitri e centrifugare a 1.200 x g per 3 minuti a temperatura ambiente per stratificare ulteriormente i componenti.
   4. Dopo la centrifugazione, scartare nuovamente la parte liquida sul fondo. Mantenere lo strato superiore di grasso, che è definito come grasso di Coleman, nell'ordine di 60-
      siringa da millilitro.
4. Raccolta di campioni di grasso ad alta e bassa densità
   1. Trasferire i 2/3 superiori del grasso di Coleman in una provetta da 20 mL, definendolo grasso a bassa densità (LDF).
   2. Trasferire il restante 1/3 inferiore del grasso di Coleman in un'altra provetta da 20 mL, definendolo grasso ad alta densità (HDF).

2. Estrazione dei componenti

1. Preparazione del complesso della matrice adiposa (AMC)
   1. Far passare l'HDF attraverso un dispositivo di filtraggio con un manicotto e tre setacci interni (distanza tra gli schermi filtranti di 1,5 mm).
   2. Raccogliere il fazzoletto attaccato e disidratarlo in un sacchetto filtro da 100 maglie circondato da una garza. Determinare il punto finale osservando il tessuto mentre viene prelevato con una pinza; Quando non cadono goccioline di liquido evidenti al momento del prelievo del forcipe, indica che la disidratazione ha raggiunto l'effetto desiderato. Il prodotto finale è stato identificato come AMC. Conservare l'HDF rimanente per un uso futuro.
2. Estrazione su gel della frazione vascolare stromale (SVF)
   1. Emulsione meccanica dell'LDF: Emulsionare meccanicamente l'LDF facendolo passare tra due siringhe collegate da un connettore Luer-Lok femmina-femmina con un diametro interno di 1,4 mm ad una velocità di 10 mL/s per 1 minuto.
   2. Centrifugare l'LDF emulsionato a 1.600 x g per 3 min. Raccogli lo strato intermedio, che assomiglia a una sostanza gelatinosa, come SVF-gel.
3. Produzione di frammenti di collagene adiposo (ACF)
   1. Polverizzazione di LDF: Polverizzare l'LDF in un estrattore ACF specializzato a 30.000 giri/min per 60 s per ottenere una sospensione di grasso.
   2. Filtraggio: Trasferire la sospensione grassa in siringhe da 20 mL. Collegarlo a un filtro unidirezionale da 0,25 mm, premere il pistone e raccogliere il filtrato in un'altra siringa da 20 ml. Quindi, collegare questa siringa a un filtro unidirezionale da 0,15 mm, spingere nuovamente il pistone e raccogliere il filtrato finale in una terza siringa da 20 ml. Quindi, centrifugare la sospensione grassa a 3.000 x g per 3 minuti.
   3. Raccogli la parte solida in basso come ACF.

3. Test dei componenti grassi

1. Test di rigidità
   1. Utilizzare un dispositivo con un sensore di misurazione della forza con un intervallo da 0 N a 225 N e un attuatore elettromagnetico che consenta una corsa assiale di 6 mm.
   2. Bloccare ogni campione di tessuto (AMC e grasso di Coleman) e applicare un precarico di 25 - 30 N per eliminare l'allentamento e causare l'allungamento. Impostare il carico della rampa a 8 mm/s e registrare elettronicamente la forza massima raggiunta prima che il campione si rompa. Il dispositivo calcola quindi la rigidità dei tessuti.
2. Ematossilina ed eosina (HE) e colorazione di Masson
   1. Fissare i campioni in paraformaldeide al 4% per preservarne la struttura. Disidratare in gradiente di etanolo per rimuovere l'acqua, necessaria per il successivo processo di inclusione.
   2. Incorporare i campioni nella paraffina, un processo che rende i campioni più facili da tagliare in sezioni sottili. Quindi, sezionare i campioni inclusi in paraffina.
   3. Colora le sezioni con le macchie tricromiche di HE e Masson. Esaminare i campioni utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM).
3. Studi sui trapianti
   1. Seleziona 70 topi nudi con livello SPF Salute, del peso di 15-18 g e di età compresa tra 4 e 6 settimane (indipendentemente dal sesso). Tenere i topi in conformità con le linee guida istituzionali, alloggiati in gabbie individuali con un ciclo luce/buio di 12 ore e dotati di cibo standard e acqua ad libitum.
   2. Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (50 mg/kg). Controllare la profondità dell'anestesia utilizzando il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi. Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza.
   3. Iniettare 0,3 mL di AMC preparato o tessuto adiposo (grasso di Coleman nel gruppo di controllo) nei tessuti sottocutanei di ciascun topo, fungendo da base per l'innesto di grasso. Monitora gli animali fino a quando non riprendono conoscenza e poi trasferiscili nelle loro gabbie.
   4. Nei giorni 7, 14, 30, 60 e 90 dopo l'innesto, raccogli gli innesti separandoli accuratamente dal tessuto circostante. Misura i loro volumi. Il tasso di ritenzione degli innesti è stato definito come segue:
      tasso di ritenzione (%) = il volume dell'innesto al momento del prelievo/volume di grasso per iniezione (0,3 mL qui) x 100%.

Risultati

Attraverso varie procedure meccaniche eseguite durante il processo chirurgico, abbiamo trasformato con successo il tessuto adiposo in componenti adipose distinte con caratteristiche diverse. Sono, in sequenza, l'AMC che fornisce un ampio supporto robusto (Figura 1A), l'HDF per ulteriori otturazioni (Figura 1B), il gel SVF per iniezioni precise in piccole aree (Figura 1C) e l'ACF per affrontare le rughe sottili o le esigenze di resta...

Discussione

Questo protocollo di frazionamento del tessuto adiposo prevede diversi passaggi critici che garantiscono il successo dell'isolamento di componenti specializzati. In primo luogo, la centrifugazione del tessuto adiposo raccolto lo separa in grasso ad alta densità (HDF) e grasso a bassa densità (LDF), ciascuno con composizioni distinte di matrice cellulare ed extracellulare (ECM)^23,24. L'HDF, ricco di adipociti vitali e cellule dell...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,001% Epinefrina	Sigma-Aldrich	E4375
0,06% Lidocaina	Sigma-Aldrich	L5647
Cannula multiporta da 3 mm	Tulip Medical Products, San Diego, CA, USA/
Provette da centrifuga da 50 ml	Corning	430829
Dispositivo di prova di carico BOSE ElectroForce	Bose Corporation	/
Collagenase	Worthington Biochemical	LS004176
Connettore Luer-Lok femmina-femmina	BD Biosciences	309628
Dispositivo di filtraggio con manicotto e setacci	su misura (Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.)	/
Garza	Medline Industries	MDS093944
Kit di colorazione ematossilina/eosina		Sigma-Aldrich
Masson	Sigma-Aldrich	HT15
Topi nudi Southern	Mdical University	/
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific
Schermo filtrante rotondo in acciaio inox (0,15 mm)	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Schermo filtrante rotondo in acciaio inossidabile (0,25 mm)	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Sacchetto filtro sterilizzato da 100 maglie	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Estrattore di Frazione Vascolare Stromale (SVF)-Gel	Shanghai Tiangong Instruments Co., Ltd.	/
Tripsina	Thermo Fisher Scientific	25200056
Kit di analisi Western Blot	Bio-Rad	1705061

Kit di colorazione tricromica HT110116 10010023