Protocolli di Screening Sperimentale, Tecniche di Immunocitochimica e Imaging Microscopico per Penium margaritaceum

Sommario

Questo rapporto descrive i metodi fondamentali utilizzati per coltivare e manipolare sperimentalmente l'alga streptofita unicellulare, Penium margaritaceum. Fornisce inoltre protocolli fondamentali di imaging basato sulla microscopia, tra cui la marcatura di cellule vive con anticorpi monoclonali e altre sonde fluorescenti e la microscopia elettronica a scansione.

Abstract

La parete cellulare è il primo componente della ricezione/trasduzione del segnale per una cellula vegetale durante lo sviluppo e quando risponde a fattori di stress abiotici e biotici ambientali. La cellula monitora costantemente l'integrità della sua parete cellulare e la modula in risposta allo stress. Chiarire le specifiche modulazioni strutturali e biochimiche che si verificano nella parete cellulare è un compito difficile, soprattutto quando si impiegano piante multicellulari e i loro organi/tessuti. Ciò è dovuto ai limiti su ciò che può essere risolto in una singola cellula che fa parte di una complessa rete multicellulare. L'alga streptofita unicellulare, Penium margaritaceum, è stata recentemente utilizzata in studi sulla dinamica delle pectine, sulla plasticità fenotipica basata sulla parete cellulare e su molteplici aspetti della biologia cellulare algale. Il suo fenotipo semplice, la parete cellulare distinta che ha molti componenti notevolmente simili alle pareti cellulari delle piante terrestri e la facilità negli studi immunocitochimici e sperimentali lo rendono un potente organismo modello nella biologia della parete cellulare vegetale. L'obiettivo di questo studio è quello di fornire le tecniche di base per la coltura, la manipolazione sperimentale e lo screening dei fattori di stress applicati. Protocolli di screening per immunocitochimica, imaging al microscopio a scansione laser confocale e imaging al microscopio elettronico a scansione della struttura della parete cellulare. Allo stesso modo, molte delle tecniche descritte possono essere modificate per una vasta gamma di altri studi cellulari e molecolari.

Introduzione

La parete cellulare di una pianta è una complessa rete polimerica che ha molteplici ruoli nella vita di una cellula vegetale¹. L'integrità della parete cellulare è costantemente monitorata dalla cellula durante lo sviluppo e in risposta allo stress ambientale e, modula di conseguenza in chimica e struttura. Penium margaritaceum è un'alga verde unicellulare che è stata recentemente utilizzata negli studi sulle alghe streptofite (Streptophyta, il gruppo di alghe verdi più strettamente imparentato e ancestrale alle piante terrestri²).

Negli ultimi due de....

Protocollo

NOTA: Il Penium margaritaceum è ottenuto presso la Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen - Collezione di colture di alghe presso l'Università di Gottinga, SAG; Ceppo #2640.

1. Mantenimento delle culture

1. Mantenere l'alga in un terreno liquido Woods Hole (WH¹²) che può anche essere integrato con estratto di acqua del suolo (cioè 40 ml per litro di terreno). Mantenere le colture a 20-25 °C con un ciclo luce: buio di 16 h:8 h con 3,5 klux (74 μmol di fotoni/m²/s) di luce fluorescente bianca fredda.
2. Prepar....

Risultati

L'etichettatura della parete cellulare di P. margaritaceum con anticorpi monoclonali anti-pectina (ad esempio, JIM5) rivela una rete di fibre e proiezioni complessate con calcio che formano un modello regolare o reticolo (Figura 1). La pectina si deposita nel centro della cellula o istmo, dove sposta la pectina più vecchia verso i poli (Figura 2). La marcatura con un diverso anticorpo pectina-simile a JIM7 evidenzia la secrezione iniziale di pectina alt.......

Discussione

P. margaritaceum è un organismo efficace per chiarire le dinamiche dello sviluppo della parete cellulare e della secrezione di ECM nelle piante e nelle alghe streptofite. Le caratteristiche principali includono un'abitudine unicellulare e facilità nel mantenimento della coltura e nella manipolazione sperimentale, una parete cellulare primaria con un reticolo esterno di pectina distinto e altri polimeri, facilità nella marcatura di cellule vive con anticorpi monoclonali diretti a.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1,5 mL microcent. Provette	Fisher Scientific	01-549-740
Micropiastra a 12 pozzetti	Fisher Scientific	50-233-6077
Vetrini coprioggetti 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-541-016
Vetrini coprioggetti 45x 50 cm	Brain Research	4550-1.5D
Agar	Sigma Aldrich	A9414
anti-ratto FITC	Sigma Aldrich	F6258
anti-ratto TRITC	Sigma Aldrich	T4280
cloruro di calcio	Sigma Aldrich	C4981
Cambbridge stubs	EMS	75183-65
Fluoview CLSM	Evident	Fluoview 1200
JIM5	Kerafast	ELD004
JIM7	Kerafast	ELD005
Microcentrifuga	Fisher Scientific	13-100-675
Micropipetors	BioRad	1660499EDU
Penium margaritaceum	Sammlung von Algenkulturen der Universitä t Gö ttingen - Collezione di colture di alghe a Gö Università di ttingen	2640
Kit polisfera	Polysciences	18336
SEM	ThermoFisher	Quattro SEM
sputter coater	EMS	Q150V
Miscelatore a vortice	Fisher Scientific	02-215-414