Un metodo semplice ed efficiente per testare gli agenti immunomodulatori per la generazione di cellule dendritiche tollerogeniche da monociti CD14+ umani

Summary

Descriviamo una procedura per valutare la capacità degli agenti farmacologici di generare cellule dendritiche tollerogeniche da cellule dendritiche naive derivate da monociti in vitro e convalidare la loro potenza mediante la generazione di cellule T regolatorie autologhe.

Abstract

Le cellule dendritiche tolerogeniche (tolDC) sono un sottogruppo di cellule dendritiche (DC) che sono note per influenzare le cellule T naive verso un fenotipo di cellule T regolatorie (Treg). Le TolDC sono attualmente in fase di studio come terapie per l'autoimmunità e il trapianto, sia come terapia cellulare che come metodo per indurre le tolDC da DC endogene. Ad oggi, tuttavia, il numero di agenti noti per indurre tolDC da DC naïve è relativamente piccolo e la loro potenza nel generare Treg in vivo è stata incoerente, in particolare le terapie che inducono tolDC da DC endogene. Ciò offre l'opportunità di esplorare nuovi composti per generare tolleranza.

Qui descriviamo un metodo per testare nuovi composti immunomodulatori su DC derivate da monociti (moDC) in vitro e convalidare la loro funzionalità per generare Treg autologhe. In primo luogo, otteniamo PBMC e isoliamo monociti CD14⁺ e cellule T CD3⁺ utilizzando kit di separazione magnetica disponibili in commercio. Successivamente, differenziamo i monociti in moDC, li trattiamo con un immunomodulatore consolidato, come rapamicina, desametasone, IL-10 o vitamina D3, per 24 ore e testiamo il loro cambiamento nei marcatori tollerogenici come convalida del protocollo. Infine, co-coltiviamo le tolDC indotte con cellule T autologhe in presenza di stimolazione anti-CD3/CD28 e osserviamo cambiamenti nelle popolazioni di Treg e nella proliferazione delle cellule T. Prevediamo che questo protocollo venga utilizzato per valutare l'efficacia di nuovi agenti immunomodulatori per riprogrammare DC già differenziate verso la tolDC.

Introduction

Le cellule dendritiche (DC) sono mediatori critici tra l'immunità innata e quella adattativa. Le DC, che risiedono principalmente nelle membrane mucose, nella pelle e nel tessuto linfoide, sono le principali cellule presentanti l'antigene (APC⁾¹. Le DC assorbono proteine estranee e le elaborano e le presentano sulle proteine maggiori di istocompatibilità (MHC) alle cellule T naive. Le DC esprimono specificamente proteine MHC di classe II, come l'antigene-DR leucocitario umano (HLA-DR) nell'uomo. Lo stato di attivazione delle DC in seguito all'esposizione all'antigene è critico per la risposta delle cellule T a ....

Protocol

Tutti i campioni di cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) sono stati ottenuti dal nucleo di immunologia umana dell'Università della Pennsylvania da donatori anonimizzati con previa approvazione dell'Institutional Review Board (IRB) dell'Università della Pennsylvania con il consenso del paziente.

Facoltativo: mentre in questo metodo abbiamo utilizzato PBMC appena isolate ottenute da un laboratorio accademico, le PBMC possono essere isolate sia dal sangue intero che dai prodotti ematici arricchiti con leucaferesi. Si consiglia di utilizzare il metodo di centrifugazione in gr....

Results

Abbiamo descritto un protocollo per le PBMC umane, isolando sia le cellule T CD3⁺ che i monociti CD14⁺ utilizzando kit di separazione magnetica disponibili in commercio, differenziando i monociti in moDC CD14^-, HLA-DR⁺, CD141⁺, CD1c⁺ utilizzando GM-CSF e IL-4, trattandoli per 24 ore e co-coltura con cellule T autologhe con stimolazione anti-CD3/CD28 per 72 ore. Uno schema sperimentale è mostrato nella Figura 1.

Discussion

Qui descriviamo un metodo affidabile e versatile per valutare la funzionalità di agenti immunomodulatori per indurre tolDC da moDC e convalidare la loro funzionalità per generare Treg da cellule T autogene ex vivo. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo. Innanzitutto, i monociti sono cellule notoriamente sensibili e devono essere ottenuti da PBMC fresche e non precedentemente congelate per ottenere i migliori risultati. I monociti devono essere isolati il prima po.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1-10 µ L Punte per pipette filtrate	VWR	76322-158	Colture cellulari generali
Provetta da centrifuga da 1,5 mL	VWR	77508-358	Colture cellulari generali
10 mL Pipette sierologiche	VWR	414004-267	Colture cellulari generali
100-1000 &; L Punte per pipette filtrate	VWR	76322-164	Coltura cellulare generale
Tubo conico da 15 mL	VWR	77508-212	Coltura cellulare generale
20-200 &; Punte di pipetta filtrate a L	VWR	76322-160	Coltura cellulare generale
2-Mercaptoetanolo	MP Biomedical	194834	Coltura cellulare T
Tubo conico da 50 mL	VWR	21008-736	Coltura cellulare generale
Piatto 60 x 15 mm, Nunclon Delta	Thermo Fischer	150326	Coltura cellulare generale
Piastra inferiore conica (V) a 96 pozzetti, superficie non trattata	Thermo Fischer	277143
fondo piatto a 96 pozzetti	Thermo Fischer	161093	Coltura cellulare generale
APC/Cyanine7 Anticorpo CD272 (BTLA)	Biolegend	344518	Citometria a flusso
Sintonizza NxT (laser rosso/blu, 7 canali)	Termo Fischer	A24863	Citometria a flusso
BSA	Thermo Fischer	15260-037	Cellula generale
Coltura CD14 anticorpo monoclonale (61D3), PE	Thermo Fischer	12-0149-42	citometria a flusso
CD1c anticorpo monoclonale (L161), PE-cianine7	Thermo Fischer	25-0015-42	citometria a flusso
CD209 (DC-SIGN) anticorpo monoclonale (eB-h209), PerCP-cianine5.5	Thermo Fischer	45-2099-42	citometria a flusso
CD25 anticorpo monoclonale (CD25-4E3), APC	Thermo Fischer	17-0257-42	Citometria a flusso
CD274 (PD-L1, B7-H1) Anticorpo monoclonale (MIH1), PE	Thermo Fischer	12-5983-42	Citometria a flusso
CD4 Anticorpo monoclonale (RPA-T4), Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	53-0049-42	Citometria a flusso
CD40 Anticorpo monoclonale (5C3), APC	Thermo Fischer	17-0409-42	Citometria a flusso
CD40 Anticorpo monoclonale (5C3), APC-eFluor 780	Thermo Fischer	47-0409-42	Citometria a flusso
CD69 Anticorpo monoclonale (FN50), PE	Thermo Fischer	MA1-10276	Citometria a flusso
CD86 Anticorpo monoclonale (BU63), FITC	Thermo Fischer	MHCD8601	citometria
a flusso CD8a anticorpo monoclonale (RPA-T8), PE-cianina 7	Thermo Fischer	25-0088-42	Citometria
a flussoPiastra a 96 pozzetti a fondo conico (pozzetto a V)	Thermo Fischer	2605
Fiale criogeniche	Thermo Fischer	430488	T Cell Culture
Dimethylsulfoxide (DMSO), grado di sequenziamento	Thermo Fischer	20688	Coltura cellulare generale
DPBS	Thermo Fischer	14200166
Kit	di isolamento dei monociti umani EasySepStem Cell Technologies	19359	Separazione cellulare
Kit di isolamento delle cellule T umane EasySep	Stem Cell Technologies	17951	Separazione cellulare
EasySep Magnet	Stem Cell Technologies	18000	Separazione cellulare
EDTA	Thermo Fischer	AIM9260G	General Cell Culture
Falcon Provette in polistirene a fondo tondo, 5 mL	Stem Cell Technologies	38025	Separazione cellulare
Inibitore del legame del recettore Fc Anticorpo policlonale	Thermo Fischer	14-9161-73	Citometria
a flusso Siero fetale bovino	Thermo Fischer	A5670701	Coltura cellulare generale
Colorante di vitalità fissabile eFluor 780	Thermo Fischer	65-0865-18	Citometria a flusso
Foxp3 / Set di tamponi per colorazione del fattore di trascrizione	Thermo Fischer	00-5523-00	Citometria a flusso
FOXP3 Anticorpo monoclonale (PCH101), PE-Ciana5.5	Thermo Fischer	35-4776-42	Citometria a flusso
HBSS	Thermo Fischer	14170-112	Coltura cellulare generale
Siero fetale bovino inattivato a caldo	Thermo Fischer	A5670801	Coltura cellulare generale
HEPES (1 M)	Thermo Fischer	15630106	moDC Cell
Coltura HLA-DR Anticorpo monoclonale (L243), Alexa Fluor 488	Thermo Fischer	A51009	Citometria a flusso
Attivatore di cellule T umane CD3/CD28/CD2	StemCell Technologies	10970	Coltura di cellule T
Proteina ricombinante GM-CSF umana	Thermo Fischer	300-03	moDC Coltura cellulare
Kit ELISA IL-10 umano, Alta sensibilità	Thermo Fischer	BMS215-2HS	ELISA
IL-4 Umana, Proteina Ricombinante Senza Animali	Thermo Fischer	AF-200-04	moDC Coltura Cellulare
PBMC Umana (Appena Isolata)	UPenn HIC	N/A	Cellule
TNF alfa Kit ELISA	Thermo Fischer	BMS223-4	Ottico ELISA
(DMi1)	Lucia	391240
Lipopolisaccaride per Colture Cellulari Generali (LPS)	Invivogen	tlrl-eblps	moDC Cell
LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte nel vicino infrarosso fissabile	Thermo Fischer	L34975	Citometria a flusso
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)	Thermo Fischer	11140050	T Cell Culture
Penicillina-Streptomicina (100x)	Thermo Fischer	15140122	General Cell
Culture Pipette Controller	VWR	77575-370	Rapamicina per colture cellulari generali
, 98+%	Thermo Fischer	J62473.	Coltura cellulare MF moDC
RPMI 1640 con Glutamax	Thermo Fischer	61870-036	delle
cellule staminali	separazione	20144
stimolazione delle cellule T per la separazione cellulare (500x)	Thermo Fischer	00-4970-93	Coltura cellulare
T UltraComp eBead Plus Perle di compensazione	Thermo Fischer	01-3333-41	Flusso
Set di pipette variabili	Fischer Scientific	05-403-152	Coltura cellulare generale